средство для усиления антиагрегационного эффекта аспирина

Формула изобретения

Применение высокомолекулярного линейного полимера полиэтиленоксида WSR-301 в качестве средства для усиления антиагрегационного эффекта аспирина

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности может быть применено при разработке новых средств профилактики и лечения артерио-артериальных эмболий, ангиоспазмок, коронарных и церебральных дисциркуляций.

В связи с увеличением числа сосудистых заболеваний, обусловленных атеросклеротическими изменениями сосудов мозга, ангиоспазмами, формированием микроэмболического синдрома, в настоящее время актуальным является изучение различных аспектов регуляции мозгового кровотока, определение характера потока крови, а также состояние гемореологии.

Одной из причин вышеперечисленных заболеваний является усиление агрегационной способности клеток крови, а также повышение гидродинамического сопротивления крови в результате турбулизации ее потока.

Закономерно встает вопрос, в какой мере существующие лекарственные средства могут обеспечить профилактику и лечение указанных патологических процессов.

Ранее в подобных случаях, связанных с повышением агрегационной способности клеток крови, применяли антиагрегационные средства (в том числе аспирин), которые в обычных дозах были недостаточно эффективными. Это объясняется тем, что исследование агрегации тромбоцитов и других клеток крови, а также подбор дозировок антиагрегантов ранее осуществляли в условиях микрокюветы агрегометра, где частота столкновений клеток задается вращением мешалки. В реальных условиях агрегация определяется гораздо более сложным процессом, тесно связанным с турбулизацией потока крови (в местах сосудистых разветвлений, аневризм, в постстенотических зонах и т. д. ), вызывающей мощную активацию тромбоцитов, которая в присутствии даже низких концентраций ее индукторов может привести к развитию секреции из них физиологически активных агентов, вовлекающих в процесс активации новые массы тромбоцитов и других клеток крови. Все это формирует замкнутый круг цепной реакции само- и взаимоактивации клеток крови, которая обычно влечет за собой развитие микроэмболического синдрома, тромбоза и т. д. При этом, влияя на внутриклеточные механизмы активации тромбоцитов, аспирин в достаточной степени активно подавляет их агрегацию в кювете, но не устраняет активацию клеток крови, обусловленную гидродинамическими факторами в потоке крови. Таким образом действие обычных доз аспирина в условиях турбулизованного при патологии потока крови нуждается в усиление.

До сих пор использовалась только одна возможность усилить действие аспирина посредством воздействия на фосфодиэстеразу, например, папаверином. Простое же увеличение дозы препарата или назначение одновременно нескольких антиагрегантов не всегда приемлемо ввиду повышения токсичности и появления побочных эффектов. Поэтому особенно привлекательной представляется возможность применения средств, реализующих принципиально иную возможность влияния на процесс внутрисосудистой агрегации и взаимоактивации клеток крови, а именно посредством уменьшения турбилизации кровотока в соответствии с эффектом Томса.

Известен целый ряд высокомолекулярных линейных полимеров, обладающих способностью снижать гидродинамическое сопротивление жидкостей, в том числе крови. К ним относятся: А. Вещества искусственного происхождения - 1) полиакрил- амиды: а) Separan АР-30 - в эксперименте на животных показан антиатерогенный эффект, б) Separan AP-273 - вызывает у животных увеличение сердечного выброса; 2) полиэтиленоксиды: а) полиэтиленоксид WSR-301 предложен в качестве снижающих турбулентное трение добавок к жидкостям-кровезаменителям, для снижения системного артериального давления у животных, для восстановления мозгового кровотока при ишемии мозга животных, б) Бадимол - действие, аналогичное полиэтиленоксиду WSR-301. Б. Некоторые природные соединения: ДНК тимуса теленка, слизи рыб, полисахариды некоторых растений, белковые компоненты крови. Общими свойствами веществ, обладающих способностью снижать гидродинамическое сопротивление, являются длинноцепные структуры полимерных молекул с немногочисленными боковыми группами или полным их отсутствием; высокая мол. масса порядка 106 и более; большая гибкость молекулы и способность к растворению.

Нами были проведены экспериментальные исследования с использованием нейтральных добавок полиэтиленоксида WSR-301 (Union Carbide, USA), которые модифицировали условия потока крови, в частности снижали его турбилизацию.

Целью изобретения является усиление антиагрегационного эффекта аспирина.

Поставленная цель достигалась путем одновременного введения растворимой формы аспирина - лизин-аспирина (Synthelabo, France) и раствора полиэтиленоксида WSR-301, нормализующего гидродинамические характеристики потока крови.

Экспериментальные исследования проводили следующим образом.

Была использована установка, обеспечивающая течение крови в системе соединительных трубок, средний диаметр которых равнялся 5 мм, с наличием участков, моделирующих зону стеноза (см. фиг. 8). Функцию стенозированного участка выполняла проточная микрокювета от спектрофлюориметра RF-540 (Shimutzu, Japan), позволяющая вести ряд измерений непосредственно в потоке. В цепь был включен капиллярный диализатор BL-612 (BELKO, Italy), общая площадь которого равнялась 1,2 м². Движение крови и контроль объемной скорости кровотока (расход) осуществляли с использованием системы BL 759В (BELKO, Italy). Система включала одну воздушную ловушку. Перфузию проводили с расходом 200 мл/мин, число Рейнольдса в участке стеноза R_e = 4700, в области насоса R_e = 3200-3400. Дополнительный контур осуществлял инфузию омывающей жидкости через диализатор. Одновременно контролировали давление до диализатора и после него (в воздушной ловушке), а также давление внешнего контура. Контроль давления осуществляли с использованием датчика давления этой системы и двух датчиков давления (Elema, FRG), данные регистрировали на самописце SE 120 (ВВС Goerz Netrawatt, USA). Исследования проводили при температуре 32^оС, обеспечиваемой термостатом МLW 8 (ЧСФР).

В работе использовали: богатую тромбоцитами плазму (БТП) здоровых доноров, не получавших антиагрегантов, которую разводили с целью уменьшения концентрации тромбоцитов примерно до 80-100 тыс. клеток/мкл; суспензию отмытых по описанной ранее известной методике тромбоцитов (100000 клеток/мкл); суспензию отмытых полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) (2 х 10⁶ клеток/мл), выделенных из цитратстабилизированной крови доноров осаждением эритроцитов декстраном Т-500. Отмытые клетки насыщали флюоресцирующим кальциевым хелатором - квином (quin - 2АМ, Amercham) путем его добавления к суспензии клеток на предпоследнем этапе отмывки в конечной концентрации 200 мкМ и инкубации в течение 30 мин. Затем клетки отмывали от незахваченного индикатора и ресуспендировали в рабочем буфере.

Селективную активацию тромбоцитов осуществляли коллагеном (1 мкг/мл), а селективную активацию ПМЯЛ - формил-метионил-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ) (10^-7 М). Полиэтиленоксид WSR-301 вводили в канал перфузии в виде матричного раствора с концентрацией 10^-3 г/мл (10 г полимера в 10 мл физиологического раствора) до получения конечной концентрации 2 х 10 г/мл циркулирующей крови. Лизин-аспирин использовали в концентрации 10^-6 М (ЕС₅₀).

Изобретение иллюстрируется фиг. 1-8.

На фиг. 1 показано изменение количества одиночных тромбоцитов в ходе рециркуляции крови. 1 - рециркуляция без инфузии коллагена; 2 - рециркуляция при введении коллагена на 20-25 минуте; 3 - рециркуляция при введении коллагена на фоне полимера; 4 - то же на фоне бадимола (другой полимер с аналогичным действием). По оси ординат - изменение числа одиночных тромбоцитов в % от исходной величины; по оси абсцисс - время рециркуляции в мин.

На фиг. 2 - изменение уровня свободного гемоглобина в ходе рециркуляции крови. Обозначение кривых смотри на фиг. 1. По оси абсцисс - уровень гемоглобина в отн. ед.

На фиг. 3 - динамика изменения разности давления на диализаторе в ходе рециркуляции крови (линией обозначен период инфузии коллагена), 1 - контроль; 2 - на фоне полимера.

На фиг. 4 - изменение уровня свободного метаболита ТХА - ТХВ в ходе рециркуляции крови. Обозначение кривых смотри на фиг. 1. По оси ординат - концентрация ТХВ в пг/мл.

На фиг. 5 - динамика накопления АТФ в ходе 30-минутной циркуляции БТП при стимуляции тромбоцитов коллагеном (1 мкг/мл). 1 - контроль; 2 - на фоне аспирина (5 х 10^-5 М); 3 - на фоне полимера; 4 - при одновременном введении аспирина и полимера. По оси ординат - интенсивность люминесценции люциферин-люциферазы в усл. ед. ; по оси абсцисс - время в мин.

На фиг. 6 - влияние активированной в ходе циркуляции БТП на уровень Са²⁺ в цитозоле тромбоцитов. Обозначение кривых такое же, как на фиг. 5. По оси ординат - концентрация Са²⁺ в тромбоцитах до (1) и после (2) воздействия плазмы. **- при Р < 0,01.

На фиг. 7 - тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия в потоке А. Влияние активации тромбоцитов коллагенов (2 мкг/мл) на уровень Са²⁺ в цитозоле ПМЯЛ при их совместной циркуляции. В. Влияние активации ПМЯЛ ФМЛФ (10^-7) на уровень Са²⁺ в цитозоле тромбоцитов при их совместной циркуляции. Обозначения такие же, как на фиг. 6. *- при Р < 0,05; **- при Р < <0,01.

Регистрировали следующие параметры:

1. Перепад давления на диализаторе по датчикам Elema;

2. Количество заблокированных капилляров диализатора по перепаду давления на диализаторе в условиях инфузии раствора до и после эксперимента;

3. Число одиночных тромбоцитов в системе циркуляции по Wu и Hook (1975). Подсчет одиночных клеток велся по McGade и Clark (1982);

4. Уровень гемолиза - стандартным оптическим методом;

5. Уровень тромбоксана В2 (ТХВ2) в диализной жидкости наружного контура - методом радиоиммунного анализа с использованием наборов Института изотопов ВНР на сцинтилляционном счетчике МАRK (USA) с использованием сцинтиллятора Брэя;

6. Уровень внутриклеточного кальция рассчитывали по изменению флюоресценции квина, измеренному в кювете спектрофлюориметра по общепринятой методике;

7. Количество высвободившейся из плотных гранул активированных тромбоцитов в БТВ АТФ с помощью люциферин-люциферазы (Colbiochem, USA) по описанной методике.

Процедура исследования.

1. Исследовали возможную флюоресценцию полимера при длине волны возбуждения 280-350. При этом в диапазоне волн флюоресценции 300-600 в растворе полимера концентрации 2 х 10^-6 г/мл флюоресценции не обнаружено. В диапазоне волн 400-450 по сравнению с физиологическим раствором имелось увеличение светорассеивания, не превышающее 50% исходной интенсивности сигнала. В диапазоне волн выше 450 (длина волны возбуждения 340) изменений интенсивности не обнаружено. Из этого был сделан следующим вывод: при исследовании уровня интрацеллюлярной концентрации Са²⁺ при волне возбуждения 340 и волне флюоресценции 495 полимер не создает помех ввиду отсутствия собственной флюоресценции и низкого уровня светорассеивания. Следовательно, эффектом внутреннего фильтра можно пренебречь.

2. Исследовали возможность взаимодействия полимера с сывороточным альбумином человека (САЧ). Показали, что в спектре флюоресценции САЧ в присутствии полимера изменений максимальной флюоресценции не выявляется, что указывает на отсутствие связывания.

3. Проверили спектр поглощения (пропускания) полиэтиленоксида WSR-301 в матричном растворе с концентрацией 10^-3 г/мл (10 мг полимера в 10 мл физиологического раствора). Показали, что собственного спектра пропускания полиэтиленоксид WSR-301 не имеет.

4. Изучили влияние полимера на гидродинамическое сопротивление при 30-минутной прокачке дистиллированной воды в вышеописанной установке (расход 200 мл/мин) по регистрируемому перфузионному давлению до и после диализатора (модели микроциркуляторного русла). Полимер вводили в виде болюса из расчета конечной концентрации 2 х 10^-6 г/мл. При этом изменения гидродинамического сопротивления на диализаторе не обнаружено. При повторном введении того же количества полимера на протяжении 30 последующих минут изменения гидродинамического сопротивления также не обнаружено. Вывод: при прокачке дистиллированной воды в системе циркуляции полиэтиленоксид WSR-301 не влияет на гидродинамическое сопротивление.

5. Исследовали влияние полиэтиленоксида на агрегацию тромбоцитов in vitro по методу Борн, а также на агрегационный эффект аспирина в условиях микрокюветы агрегометра (Payton, USA). Скорость вращения мешалки равнялась 800 об/мин. Объем исследуемой БТП крови составлял 450 мкл. В качестве проагреганта использовали 20 мкл раствора АДФ в концентрации 10-6 г/мл. Агрегацию осуществляли при температуре 37^оС. Подсчитывали процентное отношение агрегации, представленное в табл. 1.

В условиях микрокюветы агрегометра полиэтиленоксид WSR-301 не оказывает действия на агрегацию тромбоцитов и на антиагрегационный эффект аспирина.

6. Исследовали влияние полиэтиленоксида WSR-301 на функциональное состояние элементов крови в условиях системы циркуляции крови, моделирующих реальный кровоток. Для этого после эквилибрации системы в поток 100 мл забуференного физиологического раствора вводили 100 мл цельной крови здорового донора и по достижении перемешивания, контролируемого по уровню перфузионного (до диализатора) давления, осуществляли забор крови и диализной жидкости. Заборы повторяли на 5, 15, 30, 60 и 90 минутах циркуляции. Для стимуляции микроэмболии после 15 минуты в систему осуществляли 10-минутная инфузия раствора коллагена с помощью инфузомата Perfuser E (B: BRAUN, FRG). Конечная концентрация коллагена в крови достигала 2 мгк/мл.

Пассивная прокачка в течение 90 мин разведенной крови без введения коллагена не приводила к значительному понижению числа циркулирующих клеток и гемолизу эритроцитов. Перфузионное давление в ходе циркуляции существенно не менялось. Инфузия коллагена приводила к развитию тромбоцитарного тромбоообразования и к увеличению гемолиза эритроцитов (см. фиг. 1 и 2). Одновременно наблюдалось увеличение разности давлений до и после диализатора (см. фиг. 3), свидетельствующее о повышении сопротивления вследствие частичной блокады капилляров. Это сопровождалось процессом агрегации клеток, сопряженным с резким убыванием числа одиночных тромбоцитов в крови, и секвестрацией по крайней мере части агрегатов в капиллярах диализатора. К 90 минуте появилась тенденция к некоторому повышению числа тромбоцитов, что, по-видимому, связано с дезагрегацией части агрегатов. Этим же можно объяснять и тенденцию к понижению разности давлений на диализаторе (фиг. 1, 2 и 3). Уровень высвобождения тромбоксана А2, определяемый по накоплению стабильного его метаболита ТХВ2, повышался и при фоновой циркуляции крови, однако, после введения коллагена его концентрация скачкообразно увеличивалась и продолжала нарастать до конца циркуляции (см. фиг. 4). Это свидетельствует об интенсивной секреции тромбоцитами этого агента. Причем развитие реакции высвобож- дения тромбоцитов, очевидно, может происходить независимо от их агрегации (табл. 2).

Таким образом, в условиях инфузии коллагена в системе циркуляции происходит формирование развернутого микроэмболического синдрома, сопровождающегося накоплением в среде вазоконстрикторов.

Действие полиэтиленоксида WSR-301 на развитие коллагениндуцированного микроэмболического синдрома.

Введение в канал перфузии раствора полиэтиленоксида WSR-301 в начале циркуляции не приводило к выраженному понижению перфузионного давления. Оно понижалось всего на 3-4 мм рт. ст. (фиг. 3). Однако при индуцировании на его фоне коллагеном микроэмболического синдрома наблюдался значительно меньший подъем давления, которое очень быстро возвращалось к исходному уровню. При этом гемолиз эритроцитов был существенно ниже, чем в контроле; в значительной степени предотвращался процесс уменьшения числа одиночных эритроцитов в крови (фиг. 1 и 2); наблюдался более значительный рост одиночных клеток к 90 минуте циркуляции, что свидетельствует о меньшей прочности образовавшихся агрегатов и их распаде; имело место значительное снижение продукции ТХА2 (фиг. 4), уровень которого падал даже ниже, чем при фоновой прокачке крови без полимера. Это, по-видимому, указывает на особое значение гемодинамических условий для активации каскада арахидоновой кислоты в клетках и развития их реакции высвобождения (табл. 3).

Таким образом, введение раствора полиэтиленоксида WSR-301 в систему циркуляции крови весьма эффективно предотвращает развитие коллагениндуцированного микроэмболического синдрома.

Действие полиэтиленоксила WSR-301 на высвобождение АТФ из активированных тромбоцитов в циркулирующей БТП

Циркуляция разведенной до 80-100 тыс. клеток в 1 мкл БТП длительностью 90 мин при выключенной из потока проточной кюветы, моделирующей стенозированный участок сосуда, и диализатора, моделирующего микроциркуляторное русло, показала, что накопление АТФ в этих условиях не происходит. В присутствии коллагена в используемых подпороговых концентрациях увеличение уровня АТФ было незначительным (менее 5 усл. ед. люминесценции). При включении в цепь кюветы увеличение АТФ было недостаточно для количественных измерений, однако, после введения в канал перфузии коллагена уровень АТФ резко возрастал, что соответствует литературным данным.

При введении в циркуляторное русло аспирина в дозе 2,1 х 10 М, соответствующей ЕС50 для способности этого препарата предотвращать агрегацию и секрецию тромбоцитов в кювете агрегометра, изменения количества высвобождаемой АТФ в потоке практически не наблюдалось. Эффект удалось зарегистрировать только при создании концентрации препарата в потоке не ниже 8 х 10^-6 М. Введение в циркуляторное русло полимера вызвало снижение скорости накопления АТФ почти вдвое, причем одновременное введение аспирина с полимером почти полностью устраняло реакцию высвобождения кровяных пластинок (фиг. 5).

Перепад люминесценции, характеризующий изменение уровня внеклеточного АТФ (отн. ед. ), показан в табл. 4.

Действие полиэтиленоксида WSR-301 на образование тромбоцитоактивных агентов при циркуляции.

Был исследован суммарный уровень высвобождения из циркулирующих клеток в плазму тромбоцитоактивных агентов. Тестирование проводили на суспензии отмытых аутологичных тромбоцитов (100 тыс. клеток в 1 мкл), насыщенных квином. Мерой активации кровяных пластинок тромбоцитоактивными агентами служило изменение уровня внутриклеточного Са²⁺. Тестируемые образцы плазмы добавляли к суспензии тромбоцитов в 20-кратном разведении.

Богатая тромбоцитами плазма, взятая до ее прокачки в системе циркуляции, не влияла на уровень Са²⁺ в тромбоцитах. Добавление же разведенной в 20 раз, взятой после циркуляции, БТП к суспензии отмытых тромбоцитов приводило к немедленному и резкому повышению уровня Са²⁺ в цитозоле клеток. Аспирин в использованных концентрациях не приводил к достоверному понижению степени прироста Са²⁺ в цитозоле кровяных пластинок. Введение полимера само по себе в значительной степени нивелировало это явление. Вместе с тем, сочетанное добавление полимера и аспирина почти полностью устраняло эффект активации тромбоцитов ТБП, превосходя в этом смысле изолированное действие полимера (фиг. 6).

Содержание Са²⁺ в тромбоцитах при активации их предварительно активированной коллагеном БТП (нМ) показано в табл. 5.

Действие полиэтиленоксида WSR-301 на тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия

Исследовали способность секрета активированных тромбоцитов стимулировать активацию ПМЯЛ и наоборот. Для этого создавали поток тромбоцитарно-лейкоцитарной суспензии (100 тыс. тромбоцитов в 1 мкл - 2 х 10⁶ лейкоцитов в 1 мл), причем квином насыщали либо тромбоциты, либо ПМЯЛ. В канал перфузии вводили селективный активатор либо тромбоцитов при насыщении квином ПМЯЛ, либо - наоборот. Очевидно, что контрольный уровень Са²⁺ в цитозоле ПМЯЛ в первом случае, или в цитозоле тромбоцитов во втором случае, позволяет проконтролировать возможность выброса из клеток агентов, обладающих перекрестной активностью и способных обеспечить перекрестную тромбоцитарно-лейкоцитарную активацию. Поскольку измерения проводили непосредственно в проточной кювете (при выключенном диализаторе), можно было зарегистрировать динамичный процесс взаимодействия клеток. Регистрация максимального изменения флюоресценции клеток после введения активатора осуществляли компьютером прибора и выводили на дисплей.

Показано, что при добавлении к тромбоцитарно-лейкоцитарной суспензии коллагена, который сам по себе влияет на уровень Са²⁺ в ПМЯЛ, имеет место увеличение содержания этого катиона. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае селективной активации ПМЯЛ ФМЛФ. Аспирин, прямо не влияющий на ПМЯЛ, достоверно не ограничивал стимулирующее воздействие со стороны активированных тромбоцитов. Поскольку селективным ингибитором активации ПМЯЛ авторы не располагали, попытку ограничить активирующий эффект ПМЯЛ на тромбоциты не проводили.

При осуществлении циркуляции тромбоцитарно-лейкоцитарной суспензии на фоне полимера было установлено, что в этих условиях из взаимоактивация уменьшается, что проявляется в снижении уровня прироста Са²⁺ в цитозоле клеток при перекрестной активации. Добавка аспирина на фоне полимера еще более снижала активирующий ПМЯЛ эффект тромбоцитов, и уровень Са²⁺ в их цитозоле практически не повышался (см. фиг. 7).

Содержание Са²⁺ в тромбоцитах при активации лейкоцитов (нМ) представлено в табл. 6.

Содержание Са²⁺ в лейкоцитах при активации тромбоцитов (нМ) представлено в табл. 7.

Таким образом, на модели реального кровообращения показано, что введение в поток крови раствора полиэтиленоксида WSR-301 весьма эффективно предотвращает развитие коллагениндуцированного микроэмболического синдрома, что проявля- ется в подавлении активации, агрегации клеток крови и высвобождения из них физиологически активных агентов, вызывающих само- и взаимоактивацию клеток крови, а также ангиоспазмы.

Одновременное введение раствора полимера с аспирином практически полностью подавляет эти процессы, что вдвое превышает индивидуальный эффект аспирина.

В литературе нет данных о существовании аналогичных препаратов, используемых в медицине с целью подавления активации клеток крови, развития их реакции высвобождения и агрегации, вследствие воздействия на них изменившихся гидродинамических условий потока крови. Используется только одна возможность усилить антиагрегационный эффект аспирина посредством воздействия опять же на клеточные механизмы (на другой фермент - фосфодиэстеразу) папаверином, что также не устраняет активацию клеток крови, обусловленную гидродинамическими факторами в потоке крови.

(56) Патент США N 3590124, кл. 424-78, 1978.