ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции

Классы МПК:A61K35/20 молоко; молозиво
A61K39/395 антитела; иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки
A61P31/18 против вируса иммунодефицита
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):ИММУРОН ЛИМИТЕД (AU)
Приоритеты:
подача заявки:
2011-04-11
публикация патента:

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для предотвращения передачи ВИЧ, включающей поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с белком вирусной оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или его фрагментом, в которой поликлональные антитела или их фрагменты (i) способны связываться с белком Env из гетерологичного штамма ВИЧ и (ii) присутствуют в гипериммунном молоке животного или получены из гипериммунного молока животного, присутствуют в гипериммунном молозиве животного или получены из гипериммунного молозива животного или присутствуют в птичьем яйце или получены из птичьего яйца. Группа изобретений также касается применения указанной композиции для производства лекарственных препаратов, предназначенных для предотвращения передачи ВИЧ; способа предотвращения передачи ВИЧ, включающего топическое введение указанной композиции. Группа изобретений обеспечивает предотвращение передачи ВИЧ. 3 н. и 42 з.п. ф-лы, 12 пр., 6 ил., 6 табл.

Рисунки к патенту РФ 2594249

способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249 способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249 способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249 способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249 способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249 способы и композиции для предотвращения передачи вич-инфекции, патент № 2594249

Настоящее изобретение предусматривает создание способов и композиции, приемлемых для использования в медицинской области и, в частности, при лечении вирусных инфекций. В частности, настоящее изобретение относится к использованию способов и композиций для предотвращения передачи инфекционного заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции).

Предпосылки к созданию изобретения

Ретровирус, называемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), является этиологическим фактором заболевания сложного характера, вызывающим прогрессирующее разрушение иммунной системы (синдром приобретенного иммунодефицита - СПИД) и дегенерацию центральной и периферической нервной системы. С момента появления в начале 80-х годов данного заболевания, представлявшего угрозу для здоровья людей, меры по борьбе с заболеванием или его искоренению в основном были сосредоточены на поиске вариантов лечения заболевания уже после свершившегося факта инфицирования человека.

Использование презервативов обеспечивает существенную степень защиты от заражения ВИЧ-инфекцией при совершении полового акта. Тем не менее, применение презервативов не обеспечивает 100% эффективную защиту против заражения ВИЧ-инфекцией. Более того, пары нередко не используют презервативы. Топическая композиция, которая могла бы быть введена во влагалище или прямую кишку с помощью пены, геля, губки или в иной форме, либо которая могла бы быть топически нанесена на мужские половые органы, во многих случаях была бы предпочтительней по сравнению с презервативами. Более того, профилактическая эффективность презервативов могла бы быть повышена путем включения приемлемого микробицида в смазку, нанесенную па внешнюю поверхность презерватива. Тем не менее, до настоящего времени был достигнут незначительный прогресс в разработке эффективной топической композиции против передачи ВИЧ-инфекции.

При проведении большинства исследований по разработке топических профилактических композиций против ВИЧ-инфекции основное внимание было сосредоточено на использовании поверхностно-активных веществ и буферов, таких как патентованный препарат ноноксинол-9. Поверхностно-активные вещества и детергенты разрушают мембраны микробов и мужских половых клеток путем лизиса и эмульсифицирования. Кремы и гели, содержащие поверхностно-активные вещества, имеют преимущество, заключающееся в их исключительно широких возможностях поражения, в результате чего они способны поразить вирус ВИЧ и вирусы, связанные с другими заболеваниями, передающимися половым путем. Тем не менее, применение поверхностно-активных веществ и буферов в существенной степени ограничено тем что, они могут вызвать повреждение клеточных мембран. Как было продемонстрировано, во влагалище ноноксинол-9 может вызвать утонение вагинальных стенок. В прямой кишке ноноксинол-9 может вызвать шелушение стенок прямой кишки.

Другие исследуемые вирулицидные композиции для их применения в качестве вирулицидов ВИЧ включают каррагинан и другие крупные сульфатные полисахариды, которые приклеиваются к вирусным оболочкам и, возможно, создают защиту клеточных мембран. Было продемонстрировано, что ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека также оказывают определенное антивирусное воздействие.

В последнее время появилась информация о том, что учеными был сделан ряд открытий в области биологии, углубляющих наше понимание того, каким образом ВИЧ проникает в организм после полового контакта, которые могли бы привести к созданию профилактических веществ, препятствующих взаимодействию ВИЧ с его целевыми клетками. Указанные открытия, главным образом, относятся к Т-лимфоцитам, моноцитам/макрофагам и дендритным клеткам и указывают на то, что CD4 клеточные рецепторы участвуют в процессе трансмиссии вируса. Например, предполагается, что ВИЧ прочно связывает поверхность дендритных клеток, и когда дендритные клетки представляют микробные антигены CD4+Т-хелперам для стимулирования иммунного ответа, дендритные клетки самопроизвольно передают ВИЧ CD4+Т-клеткам, тем самым способствуя прогрессированию инфекции.

Ряд ученых теоретически допускает на основе указанных открытий, что могут быть разработаны профилактические средства, блокирующие взаимодействие между вирусом и организмом-хозяином человека. Тем не менее, способы, основывающиеся на специфическом взаимодействии ВИЧ и клеток человека, ограничены ввиду того, что пути проникновения инфекции не были полностью определены, и инфекция может проникать в организм различными путями. (Miller, С.J. et al., "Genital Mucosal Transmission of Simian Immunodeficiency Virus: Animal Model for Heterosexual Transmission of Human Immunodeficiency Virus", J. Virol., 63, 4277-4284 (1989); Phillips, D. M. и Bourinbaiar, A. S., "Mechanism of ВИЧ Spread from Lymphocytes to Epithelia", Virology, 186, 261-273 (1992); Phillips, D. M, Tan, X., Pearce-Pratt, R. and Zacharopoulos, V. R., "An Assay for HIV Infection of Cultured Human Cervix-derived Cells", J. Virol. Methods, 52, 1-13 (1995); Ho, J. L. et al., "Neutrophils from Human Immunodeficiency Virus (HlV)-SeronegatiVe Donors Induce HIV Replication from ВИЧ-infected Patients Mononuclear Cells and Cell Lines": An In Vitro Model of HIV Transmission Facilitated by Chlamydia Trachomatis., "J. Exp.Med., 181, 1493-1505 (1995); и Braathen, L.R. & Mork, С.в "HIV infection of Skin Langerhans Cells", в: Skin Langerhans (dendritic) cells in virus infections and AIDS (ed. Becker, Y.) 131-139 (Kluwer Academic Publishers, Boston (1991).)

Работа исследователей по разработке вакцины против ВИЧ также до сих пор не была успешной. Например, вакцинация с использованием инактивированного ВИО (вирус иммунодефицита обезьян) не защищает африканских зеленых мартышек против инфицирования гомологичным вирусом несмотря на сильный иммунный ответ на ВИО.

Как очевидно из вышеуказанного обзора известного уровня техники, до сих пор остаются серьезные нерешенные проблемы в области профилактики и лечения ВИЧ и ВИЧ-инфицирования. Аспект настоящего изобретения состоит в устранении или частичном решении проблемы предшествующего уровня техники путем создания композиций и способов для предотвращения передачи ВИЧ-инфекции.

Обсуждение документов, законодательных документов, материалов, устройств, статей и т.д. включено в настоящее описание изобретения исключительно в целях обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не допускается, что любой или все из указанных материалов образуют часть основы известного уровня техники или представляют собой общедоступные сведения в области, относящейся к настоящему изобретению, так как оно существовало до даты приоритета каждого пункта формулы настоящей заявки.

Краткое изложение существа изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения предлагается композиция для предотвращения передачи ВИЧ, включающая поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с белком вирусной оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или с его фрагментом. Белок Env или его фрагмент может быть любым белком Env ВИЧ, тем не менее, предпочтительно, чтобы белок Env являлся gpl40. Не ограничивая себя теорией, предполагается, что действие поликлональных антител обеспечивает связывание вирионов ВИЧ, тем самым ингибируя перемещение ВИЧ через клетки, которые образуют барьерный слой на поверхностях слизистой оболочки. В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция способна предотвратить инфицирование клетки вирусом иммунодефицита человека.

В одном примере осуществления настоящего изобретения белок Env или его фрагмент является олигомером gp140. Олигомер может содержать тримеры gpl40, димеры и мономеры. Олигомеры могут быть очищены от супернатанта трансфицированных клеток HeLa и 293, например, методом аффинной хроматографии с использованием лектина чечевицы или методом гель-фильтрации. Белок Env или его фрагмент может являться белком (Env) вирусной оболочки штамма клады А, клады В или клады С ВИЧ или его фрагментом.

В одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты способны связываться с белком Env из гетерологичной клады ВИЧ или гетерологичного штамма ВИЧ.

В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, индуцированные против gpl40 клады В, которые способны связываться с гетерологичной кладой А, кладой В или кладой С gpl40.

В одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

В одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты конкурируют с нейтрализующими антителами.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может быть выработано путем иммунизации животного с использованием белка (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагмента. Животное может быть иммунизировано gpl40, рекомбинантным gpl40 или олигомерным gpl40. Рекомбинантный gpl40 не может быть получен из культуры вириона. Животное может быть иммунизировано с использованием белка (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагмента и адъювантом. В одном примере осуществления настоящего изобретения адъювантом является вода в масляной эмульсии.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В, и выработанные антитела способны связываться с gpl40 гетерологичной клады А, клады В или клады С.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В, и выработанные антитела конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В, и выработанные антитела способны связываться с gpl40 гетерологичной клады А, клады В или клады С, при этом выработанные антитела конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gp140.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может присутствовать в птичьем яйце или может быть получен из птичьего яйца либо может присутствовать в гипериммунном молозиве или гипериммунном молоке животного или получено из них. Животным может являться корова.

Композиция может быть составлена для местного применения, и в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения композиция составлена для вагинального или ректального введения. Композиция может быть выполнена в виде геля или в виде крема, мази, лосьона или пены для топического применения.

В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, лубрикант или антивирусное средство.

Настоящее изобретение также предусматривает использование композиции настоящего изобретения для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для лечения и (или) профилактики передачи ВИЧ.

Настоящее изобретение также предусматривает создание способа изготовления композиции для предотвращения передачи ВИЧ, включающий иммунизацию животного белком (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагментом и получение гипериммунного молозива от иммунизированного животного.

Настоящее изобретение также предусматривает создание композиции для предотвращения передачи ВИЧ, изготовленной с помощью способа, включающего иммунизацию животного белком (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагментом и получение гипериммунного молока от иммунизированного животного.

Настоящее изобретение также предусматривает создание способа для предотвращения инфицирования ВИЧ, включающего:

формирование гипериммунного молозива или гипериммунного молока путем иммунизации коров; и

введение гипериммунного молозива или гипериммунного молока субъекту, при котором этап иммунизации коров для выработки гипериммунного молозива или гипериммунного молока включает вакцинацию белком вирусной оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или его фрагментом. Белок Env или его фрагмент может быть любым белком Env ВИЧ, тем не менее, предпочтительным белком Env является gp140.

Также предусматривается создание способа для предотвращения передачи ВИЧ-инфекции, включающего введение субъекту поликлональных антител или их фрагментов, способных связываться с белком вирусной оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или его фрагментом. Белок Env или его фрагмент может быть любым белком Env ВИЧ, тем не менее, предпочтительным белком Env является gpl40.

В одном примере осуществления настоящего изобретения белок Env или его фрагмент является олигомером gpl40. Олигомер может включать тримеры, димеры и мономеры gpl40. Олигомеры могут быть очищены от супернатанта трансфицированных клеток HeLa и 293, например, методом аффинной хроматографии с использованием лектина чечевицы и методом гель-фильтрации. Белок Env или его фрагмент может являться белком (Env) вирусной оболочки штамма клады Л, клады В или клады С ВИЧ или его фрагментом.

В одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты способны связываться с белком Env из гетерологичной клады ВИЧ или гетерологичного штамма ВИЧ.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может быть выработано путем иммунизации животного с использованием белка (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагмента. Животное может быть иммунизировано gpl40, рекомбинантным gpl40 или олигомерным gpl40. Рекомбинантный gpl40 не может быть получен из культуры вириона. Животное может быть иммунизировано с использованием белка (Env) вирусной оболочки ВИЧ или его фрагмента и адъювантом. В одном примере осуществления настоящего изобретения адъювантом является вода в масляной эмульсии.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может присутствовать в птичьем яйце или может быть получен из птичьего яйца либо может присутствовать в гипериммунном молозиве или гипериммунном молоке животного или получено из них. Животным может являться корова.

Композиция может быть составлена для местного применения, и в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения композиция составлена для вагинального или ректального введения. Композиция может быть выполнена в виде геля или в виде крема, мази, лосьона или пены для топического применения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - схема вакцинации gpl40.

Фиг.2 - схема вакцинации gpl40.

Фиг.3 - IgG из сыворотки или молозива связывается с gpl40 Env клады А, В и С.

Фиг.4 - очищенный IgG молозива от нестельных коров задерживает связывание с gp140 Env и демонстрирует активность гетерологического связывания.

Фиг.5 - бычий IgG блокирует связывание моноклонального Ab b12 с сайтом связывания CD4 gp140.

Фиг.6 - молозиво от стельных коров, вакцинированных gpl40 клад А/В/С и от нестельных коров, вакцинированных gpl40 клады В, проявляет широкую активность гетерологической нейтрализации.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основывается частично на открытии, заключающимся в том, что высокоспецифичные антитела молозива, связывающиеся с белком Env ВИЧ, могут быть выработаны путем вакцинации стельных животных. Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предусматривается создание композиции для предотвращения передачи ВИЧ-инфекции, включающей поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с белком (Env) вирусной оболочки вируса иммунодефицита человека или его фрагментом. Белок Env или его фрагмент может быть любым белком Env ВИЧ, тем не менее, предпочтительно, чтобы белок Env являлся gpl40. Не ограничивая себя теорией, предполагается, что действие поликлональных антител обеспечивает связывание вирионов ВИЧ, тем самым ингибируя перемещение ВИЧ через клетки, которые образуют барьерный слой на поверхностях слизистой оболочки. В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция способна предотвратить инфицирование клетки вирусом иммунодефицита человека. В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция способна ингибировать или предотвратить перемещение ВИЧ через эпителиальные клетки, именно такие клетки, которые образуют барьерный слой на поверхностях слизистой оболочки. Указанный подход к составлению композиций и способ для предотвращения передачи ВИЧ отличаются от подходов известного уровня техники и, безусловно, противоречат общей идеи известного уровня техники, существовавшего до настоящего изобретения.

Термин "предотвращение передачи" в соответствии со значением, используемым в настоящем контексте, в целом относится к полному предотвращению, а также частичному предотвращению передачи ВИЧ. Полное предотвращение указывает па то, что вирус полностью не в состоянии успешно инфицировать и (или) реплицироваться и (или) далее инфицировать другие клетки. Полное предотвращение может быть определено с помощью ряда методов на клеточном уровне и (или) на уровне всего организма квалифицированным практикующим врачом. Один из методов определения полного предотвращения заключается в том, что из клетки-хозяина невозможно получить инфекционный ВИЧ. Другой такой метод заключается в определении непроникновения ВИЧ в клетку-хозяина. На уровне всего организма могут быть использованы стандартные методы для проведения анализа на инфицирование ВИЧ (например, проведение анализа на наличие антител к ВИЧ в организме человека). Частичное предотвращение относится к поддающемуся измерению, статистически значимому снижению способности ВИЧ инфицировать и (или) реплицироваться и (или) далее инфицировать другие клетки по сравнению с соответствующей контрольной группой, которая не была подвергнута лечению, описание которого приведено в настоящем патенте. Одним из примеров является требование в отношении более высоких уровней воздействия или более длительных сроков воздействия ВИЧ для успешного инфицирования.

Термин "способный связываться" в соответствии со значением, используемым в настоящем контексте, обычно относится к антителу, которое связывается с gpl40 клады ВИЧ, например, к антителу, описание которого приведено в настоящем патенте. Связывание с gpl40 клады ВИЧ может быть продемонстрировано в соответствии с описанием в приведенных ниже примерах. В приведенных примерах осуществления настоящего изобретения антитела или их фрагменты связываются с gpl40 штамма или клады ВИЧ, против которого продуцированы нейтрализующие ВИЧ антитела, а также связываются с gpl40 штамма или клады ВИЧ, против которого не продуцированы нейтрализующие ВИЧ антитела. В других примерах осуществления настоящего изобретения антитела или их фрагменты связываются с gpl40 клады ВИЧ, против которого продуцированы нейтрализующие ВИЧ антитела, и также связываются с gpl40 гетерелогичной клады ВИЧ.

Термин "клада (-ы)" в соответствии со значением, используемым в настоящем контексте, обычно охватывает подтипы или рекомбинантные формы ВИЧ.

В предыдущей работе было указано о необходимости создания усовершенствованных композиций, обеспечивающих защиту от ВИЧ и (или) предотвращение передачи ВИЧ. В частности, существует необходимость в создании композиций, защищающих от ВИЧ, не нарушая целостность внутреннего защитного поверхностного слоя влагалища или прямой кишки. Работы в этом направлении были сосредоточены на прививочном иммунитете (например, вакцины), тем не менее, при использовании антител против ВИЧ в композициях против ВИЧ указанные антитела продуцируют с использованием антигена ВИЧ, в результате чего возникли бы сложности с получением разрешения регуляторного органа на их использование ввиду риска инфицирования и технологических проблем при их получении в большом количестве. В противоположность идеям известного уровня техники настоящее изобретение основывается на формировании пассивного гетероиммунитета, при котором антитела, продуцированные в конкретном организме, используют для защиты другого организма, обычно другого вида.

Внеклеточная часть вируса Env известна как gpl40, который содержит как gpl20, так и усеченный gp41 (отсутствие трансмембранных доменов и цитоплазмических хвостов). В одном примере осуществления настоящего изобретения белок Env или его фрагмент является олигомером gpl40. Олигомер может включать тримеры, димеры и мономеры gpl40. Олигомеры могут быть очищены от супернатанта трансфицированных клеток (например, HeLa и 293), например, методом аффинной хроматографии с использованием лектина чечевицы и методом гель фильтрации. Белок Env или его фрагмент может являться белком вирусной оболочки (Env) штамма клады А, клады В или клады С ВИЧ или его фрагментом.

В родственной заявке (PCT/AU2009/001218, инкорпорированной в настоящее описание путем отсылки), заявители продемонстрировали, что существуют различия Envs у штаммов ВИЧ-1.

В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А, клады В или клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А и клады В.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады В и клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А и клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А, клады В и клады С.

В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, продуцированные против gpl40 клады В, способные связываться с гетерологичным gp140 клады А, клады В или клады С.

В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, которые конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, продуцированные против gpl40 клады В, которые способны связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С, в которой антитела или их фрагменты конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

Заявители продемонстрировали молозиво, и IgG, очищенный от молозива, полученного от коров, вакцинированных олигомерами gpl40 Env ВИЧ одной клады, может связываться с gpl40 Env ВИЧ другой клады, несмотря на разнообразие в последовательности Env и гликозилирование штаммов ВИЧ. Кроме того, заявители продемонстрировали молозиво, и IgG, очищенный от молозива, полученного от коров, вакцинированных олигомерами gpl40 Env ВИЧ одной клады, может связываться с gpl 40 и нейтрализовать ВИЧ другой клады, несмотря на разнообразие в последовательности Env и гликозилирование штаммов ВИЧ.

Молочные коровы были вакцинированы во втором триместре стельности высококачественным растворимым олигомерным ВИЧ-1 Env (gpl40) для продуцирования молозива, содержащего высокие уровни ВИЧ-1 Env-специфических поликлональных нейтрализующих антител для использования в качестве композиции, ингибирующей трансмиссию ВИЧ. Изобретатели продемонстрировали, что анти-ВИЧ Env IgG синергизируется с врожденными антивирусными компонентами в бычьем молозиве для агрессивной нейтрализации ВИЧ-1.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает преимущество, заключающееся в получении килограммовых количеств бычьего IgG. Не ограничиваясь теорией, предполагается, что композиции настоящего изобретения обладают высокой способностью нейтрализовать ВИЧ и тем самым обеззараживать вирус для восприимчивых клеток in vitro.

В одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты являются нейтрализующими антителами.

Термин "нейтрализация" в соответствии со значением, используемым в настоящем контексте, обычно относится к антителам или их фрагментам, способным связываться с молекулой настоящего изобретения и препятствовать ее биологической активности. Термин включает антитела или их фрагменты, блокирующие вирус, например ВИЧ, и препятствующие инфицированию клетки, например, путем блокирования gpl40, связывающегося с CD4 на клетке.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может быть продуцировано путем иммунизации животного белком вирусной оболочки (Env) ВИЧ или его фрагментом.

Животное может быть иммунизировано gpl40, рекомбинантным gpl40 или олигомерным gpl40.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В и продуцированными антителами, способными связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В и продуцированными антителами, способными связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В, и продуцированные антитела конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

Животное может быть иммунизировано gpl40 клады В и продуцированными антителами, способными связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С, при этом продуцированные антитела конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

В одном примере осуществления настоящего изобретения продуцированные поликлональные антитела или их фрагменты являются нейтрализующими антителами.

В одном примере осуществления настоящего изобретения продуцированные поликлональные антитела или их фрагменты блокируют связывание gpl40 с CD4 на клетке.

В одном примере осуществления настоящего изобретения рекомбинантный gpl40 не может быть получен из культуры вириона.

Env полипептид, приемлемый для генерирования иммунного ответа, является Env полипептидом, обладающим, по меньшей мере, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной идентичностью с gpl40. gpl40 содержит фрагмент gpl20 из данного штамма ВИЧ и фрагмент gp41 из того же штамма ВИЧ, при этом растворимый фрагмент gp41 не имеет трансмембранного домена. Полипептиды gp140, способные формировать олигомерные структуры, могут быть экспрессированы из конструкции. Таким образом, образуется нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид gpl40, и экспрессионная конструкция, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид gpl40. Экспрессионная конструкция может являться конструкцией для транзиторного использования или может быть в большей степени приемлема для стабильной трансфекции и сохранения внутри клетки-мишени либо в виде эписомально реплицирующей конструкции либо в интегрированной форме.

В одном примере осуществления настоящего изобретения предусматривается создание полипептида gpl40 и экспрессионной конструкции, экспрессирующей полипептид gpl40. В другом примере осуществления настоящего изобретения предусматривается создание гликозилированного полипептида gpl40, который был изготовлен или экспрессирован в экспрессионной системе, дополняющей нативную клеточную гликозиляцию.

Рекомбинантный gp140 может быть продуцирован с использованием псевдовирусов, несущих Env из различных клад/штаммов, использующих векторы экспрессии, приведенные в таблице 1.

gpl40 может быть очищен с использованием ряда различных методов. Например, содержащие gpl40 супернатанты тканевой культуры могут быть пропущены через аффинные колонки с лектином чечевицы, благодаря чему опосредуется захват гликопротеинов, в том числе gpl 40, за счет сродства лектина чечевицы к углеводу. После промывки проводится конкурентное элюирование gpl40 из колонки путем добавления 0,5М метил-Э-маннопиранозида (Sigma). Выход продукта, полученный с помощью указанной системы, в отношении других штаммов gpl40 находился в пределах от 0,4 до 1,0 миллиграмма на 100 миллилитров супернатанта тканевой культуры. Далее элюат может подвергнуться концентрированию и дополнительной очистке методом гель фильтрации, путем пропускания через колонку Superdex 200. gpl40 очищают от супернатантов тканевой культуры в олигомерной форме.

Растворимые Env gpl40 олигомеры были получены из штаммов ВИЧ-1 клад А, В и С из клеток HeLa и (или) 293Т и очищены методом аффинной хроматографии с использованием лектина чечевицы или методом гель-фильтрационной хроматографии.

Четыре коровы (две стельные во втором семестре и две первоначально нестельные) были вакцинированы 100 мкг очищенного олигомера ВИЧ-1 Env gpl40, составленного с адъювантом Montanide. Две группы из двух коров (одна стельная и одна нестельная) были вакцинированы Env gpl40 (UG8, AD8 и MW) (называемые «тримиксами»), либо только клады В (AD8), либо равными количествами (33,33 мкг) клад А, В и С. Всем четырем коровам были сделаны, по меньшей мере, три прививки, в то время как последнюю прививку сделали за четыре недели до отела. Все четыре коровы были сероконвертированы в течение девяти недель. Реципрокные титры конечных точек сыворотки IgG составляли приблизительно 1×102,5 для стельных коров и приблизительно lxlO5 для нестельных коров и были определены с помощью вновь разработанного специфического иммуносорбентного ферментного анализа Env gpl40 ВИЧ-1 анти-IgG. Нагнетание антител IgG сыворотки в молозиво приблизительно за четыре недели до отела позволило найти объяснение ожидаемого низкого титра сыворотки IgG у стельных коров.

У всех стельных коров, которым была сделана прививка, было собрано и пастеризовано ВИЧ-иммунное бычье молозиво после отела, в результате чего были обнаружены относительно низкие ответы с реципрокными титрами IgG<10 2 (вакцинирование кладой В) и 1×104,5 (вакцинирование тримиксом). Реципрокный титр IgG молозива коров, вакцинированных до стельности, составил 105 (вакцинирование кладой В) и 104'5 (вакцинирование тримиксом). Результаты вестерн-блоттинг анализа подтвердили, что IgG молозива всех четырех коров оказалось специфичным против gpl40 Env ВИЧ-1. Был проведен тест нефракционировапного молозива на нейтрализующую активность при проведении анализа Env-псевдотипированного вируса-репортера ВИЧ-1.

Короче говоря, анализ Env-псевдотипированного вируса-репортера позволяет обнаружить наличие вирус-нейтрализующих антител к белку оболочки ВИЧ-1. Частицы псевдовируса репортера усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), экспрессирующие ВИЧ-1 Env, полученный предпочтительно из штаммов/клад, используют для инфицирования клеток-мишеней Env-зависимым образом. При проведении одного анализа частицы псевдовируса репортера инкубировали в течение 1 часа до добавления клеток-мишеней (Cf2th-CD4/CCR5/CXCR4; CF2 клетки) при 2×104/лунку в 96-луночной плашке. После 2-часовой спинокуляции при 1200-х г при комнатной температуре остаточный псевдовирус и антитело были удалены, и к клеткам добавили свежую среду. Спустя два дня, был проведен анализ клеток-мишеней на экспрессию усиленного зеленого флуоресцентного белка путем флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS). При наличии молозива или IgG молозива, продуцированного против растворимых олигомеров ВИЧ-1 Env gpl40, степени снижения уровня инфекции был определен путем измерения процентного сокращения положительных клеток усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Процент нейтрализации представляет собой соотношение между уровнями инфекции, наблюдаемыми в сыворотке мышей до вакцинации (сыворотка крови, полученная до иммунизации) и в сыворотке мышей 2 недели спустя после буст-вакцинации белком.

Было проведено тестирование вирусов псевдотипа клады А/Е, клады В и клады С, включающих стандартизованную панель Национального института здравоохранения в отношении вирусов клад В и С (всего n=27) и их сравнение с неиммунным бычьим молозивом, которое уже обладало естественной блокирующей инфекцию активностью ввиду наличия лактоферрина и иных биоактивных пептидов. Нефракционированное молозиво от коров, вакцинированных тримиксом в период стельности, проявило высокую степень нейтрализации до 50% в отношении всех псевдовирусов клады В (n=15), а также в отношении большинства псевдовирусов клады С (n=l1) и клады А/Е (n=1) при разведении в отношении 1:16. Первая вакцинированная кладой В корова оказалась низкоотвечающей особью, однако недавно от обеих коров, вакцинированных до периода стельности и имеющих телят, был получен высокий ответ. Вплоть до указанного момента наблюдалась широкая нейтрализация в отношении коровы, вакцинированной кладой В, у которой проявилась 50-80% нейтрализация в отношении псевдовирусов (n=9) (разведение в отношении 1:16) для клады В (n=12) и клады С (таблица 1). IgG Abs от первой пары коров подвергся очистке от молозива, и нейтрализующая активность сохранялась для очищенного IgG приблизительно до 50% нейтрализации в отношении тримикс-IgG по сравнению с неиммунным IgG при 500 мкг/мл. Результаты профиля нейтрализации двух образцов гипериммунного бычьего молозива gpl40 Env ВИЧ в отношении псевдовирусов различных клад приведены в таблице 1 (см. Пример 2). Указанный результат явился неожиданным, так как не ожидалось, что антитела, продуцированные против gpl40, будут прочно связываться с вирусами различных клад и в значительной степени нейтрализовать их, так как существуют значительные эпитопные различия между gpl40 различных клад.

Вышеизложенные результаты являются убедительным доводом в пользу указанного способа продуцирования высоких уровней нейтрализующих антител и нейтрализующих антител, способных связываться с гетерологичным и штаммами ВИЧ. Таким образом, в одном примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты способны связываться с белком Env из гетерологичной клады ВИЧ или гетерологичного штамма ВИЧ.

В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А, клады В или клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А и клады В.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады В и клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А и клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с gpl40 клады А, клады В и клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, продуцированные против gpl4 клады В, способные связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, конкурирующие с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с to gpl40.

В другом примере осуществления настоящего изобретения поликлональные антитела или их фрагменты являются нейтрализующими антителами.

В другом примере осуществления настоящего изобретения композиция включает поликлональные антитела или их фрагменты, продуцированные против gpl40 клады В, способные связываться с гетерологичным gpl40 клады А, клады В или клады С, в котором поликлональные антитела или их фрагменты конкурируют с моноклональным антителом Ab b12, связывающимся с gpl40.

Антитело или его фрагмент или его функциональный эквивалент может при