рекомбинантная плазмидная днк per-ta1 gyra-acser, кодирующая сериновую ацетилтрансферазу, способную in vivo ацетилировать n-концевой серин дезацетилтимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-TA1GyrA-AcSer, предназначенная для одновременного биосинтеза двух белков - гибридного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="/images/img_patents/2/2593/2593003/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека и интеина, и фермента E. coli - сериновой ацетилтрансферазы, имеющая молекулярную массу 5,04 МДа; состоящая из:

BsaBI/NdeI-фрагмента ДНК плазмиды pTWTN-1, содержащего последовательность промотора Т7 и оператора lacO; NdeI/PstI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного белка, включающего в себя адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="/images/img_patents/2/2593/2593003/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, последовательность интеина Мхе GyrA и последовательность хитинсвязывающего домена; PstI/NcoI-фрагмента ДНК, кодирующего ослабленную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин; NcoI/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы; фрагмента ДНК, содержащего в качестве генетического маркера ген 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="/images/img_patents/2/2593/2593003/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; ДНК фрагмента, содержащего последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмента, кодирующего последовательность лактозного репрессора LacI.

2. Штамм Escherichia coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="/images/img_patents/2/2593/2593003/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека и интеина, а также сериновую ацетилтрансферазу, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli С3030 рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TA1GyrA-AcSer по п. 1.

3. Способ получения рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="/images/img_patents/2/2593/2593003/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека, включающий трансформацию штамма Escherichia coli С3030 полученной плазмидной ДНК pER-TA1GyrA-AcSer по п. 1, культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer по п. 2, отделение гибридного белка TA1GyrA в растворимой форме после разрушения клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора в буферном растворе (50 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ), адсорбирование гибридного белка TA1GyrA на колонке с хитиновым сорбентом, индуцирование автокаталитического расщепления белка TA1GyrA буферным раствором, содержащим дитиотреитол, инкубирование на сорбенте в течение 24 ч при 25°С, элюирование целевого пептида и очистку целевого продукта обращенно-фазовой хроматографией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного человеческого тимозина альфа 1.

Тимозин альфа 1 - это полипептид, вырабатываемый тимусовой железой, который влияет на клетки иммунной системы, участвующие в противовирусном ответе, а также прямо воздействует на инфицированные вирусом гепатоциты. Иммуномодулирующий эффект тимозина альфа 1 проявляется в повышении количества CD4, CD8 лимфоцитов и NK клеток, а также в приведении иммунного ответа к подтипу Th1. Противовирусное действие выражено в увеличении экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости 1-го класса на инфицированных клетках и прямом подавлении размножения вируса.

Тимозин альфа 1 человека представляет собой 28-членный полипептид, ацетилированный по N-концевой 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -аминогруппе (SEQ ID NO 2).

В мировой практике тимозин альфа 1 выделяют из природных источников либо получают химическим синтезом.

Известен способ получения тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 из тимуса теленка при помощи многостадийной хроматографической очистки

(Goldstein, A.L., Т.L.K. Low, М. Mcadoo, J. Mcclure, G.В. Thurman, J.L. Rossro, C.Y. Lai, D. Chang, S.S. Wang, C. Harvey, A.H. Ramel & J. Meienhofer. 1977. Proc. Nat. Acad. Sci. US 74: 725).

Недостатком метода является сложность очистки и дороговизна получаемого пептида.

Альтернативным способом получения тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 является биотехнологический путь с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактериях.

Известен способ получения тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, в котором осуществлен микробиологический синтез гибридного белка, включающего в себя аминокислотную последовательность тимозин альфа 1 и бета-галактозидазу Escherichia coli

(Wetzel, R., Heyneker, H.L., Goeddel, D.V., Jhurani, P., Shapiro, J., Crea, R., Low, T.L.K., McClure, J.E., Thurman, G.В., & Goldstein, A.L. Biochem. 1980. V. 19. P. 6096-6104).

Описанная в этой работе конструкция обладает рядом недостатков. Во-первых, гибридный белок 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -галактозидаза - тимозин 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 содержит в своем составе 24 метионина, что приводит после обработки бромцианом к сложной смеси продуктов, выделение из которой целевого продукта практически невозможно. Во-вторых, доля целевого пептида в гибридном белке составляет не более 3%, что обесценивает высокую экспрессию гибридного белка в клетках бактерий.

Известен способ, в котором вместо «носителя» использовался белок небольшого размера - фактор некроза опухолей

(В.Г. Коробко, Е.Ф. Болдырева, С.А. Филиппов, Н.П. Беркова, В.Н. Добрынин, В.А. Шмелев, С.Г. Попов, С.И. Евсегнеев, Л.Ю. Носова. Биоорг. химия 1992. V. 18. N 5 Р. 646-659), (Шмелев В.А., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.Ю. Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 1995. V1. С 9-14).

Недостатком данного способа стало уменьшение эффективности расщепления гибридного белка по сравнению с бета-галактозидазой. Расщепление гибридного белка происходило с малым выходом целевого пептида и сопровождалось образованием трудно отделяемых продуктов неспецифических реакций.

Известна более перспективная конструкция гибридного белка с модифицированным интеином Sce VMA, способного к автокаталитическому отщеплению в присутствии тиольного реагента

(Р.С. Есипов, А.И. Гуревич, В.Н. Степаненко, Л.А. Чупова, Д.В. Чувиковский, А.И. Мирошников. Биоорг. химия 2004. V. 30 N5. Р. 481-486).

Недостаток данного способа заключался в том, что процесс расщепления гибридного белка происходил неконтролируемо - на стадии in vivo и последующих стадиях очистки гибридного белка, без добавления тиольного реагента.

Недостатком всех вышеописанных способов была необходимость химического ацетилирования пептида для получения нативной структуры тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1.

Наиболее близкий к заявленному способу получения тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 описан в работе (YuantaoRen, Xueqin Yao, Hongmei Dai, Shulong Li, Hongqing Fang, Huipeng Chen and Changlin Zhou. Microbial Cell Factories 2011. 10:26). В данной работе ацетилирование N-концевого серина тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 проводили in vivo аланиновой N-ацетилтрансферазой из E. coli. Для этого в многокопийную плазмиду pET22b(+) клонировали последовательность модифицированного интеина Spl DnaX и тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, а последовательность аланиновой ацетилтрансферазы (RimJ) - в низкокопийную плазмиду pACYCDuet-1. Затем трансформировали полученными плазмидами штамм E. coli BL21 (DE3).

Недостаток такого способа получения ацетилированного пептида заключается в том, что наличие двух плазмид в штамме-продуценте требует присутствия двух разных антибиотиков, что при масштабировании увеличивает затраты на производство. Также недостаток данного метода заключается в выборе аланиновой ацетилтрансферазы в качестве ацетилирующего фермента, которая неспецифична серину - N-концевой аминокислоте.

Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный человеческий тимозин 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что:

1. Конструируют экспрессионную плазмиду ДНК pER-TA1GyrA путем клонирования гена тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 в векторную плазмиду pTWIN1. Участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин, синтезируют из двух олигонуклеотидов и клонируют в вектор pER-TA1GyrA. Далее с помощью искусственно синтезированных олигонуклеотидов амплифицируют участок генома Escherichia coli, кодирующий сериновую ацетилтрансферазу, и клонируют в векторную плазмиду pER-TA1GyrA-RBS. Таким образом, получают вектор pER-TA1GyrA-AcSer.

2. Путем трансформации плазмидной ДНК pER-TA1GyrA-AcSer клеток Escherichia coli С3030 получают штамм-продуцент,

3. При индуцированном культивировании полученного штамм-продуцента происходит биосинтез рекомбинантной сериновой ацетилтрансферазы и накопление in vivo ацетилированного по N-концевой 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -аминогруппе растворимого гибридного белка TA1GyrA, содержащего наряду с тимозином альфа 1 человека последовательность мини-интеина Мхе Gyr А.

4. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе и выделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок TA1GyrA. Гибридный белок TA1GyrA наносят на хитиновый сорбент уравновешенный в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, промывают буфером, содержащим 2 М мочевину, и уравновешивают в буфере, содержащем 100 мМ ДТТ, тем самым индуцируют автокаталитическое расщепление гибридного белка, затем инкубируют 24 ч при 25°С. Отщепленный тимозин альфа 1 затем элюируют в том же буфере. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификацию образующегося рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 проводят с помощью масс-спектрометрии.

Техническим результатом автокаталитического расщепления гибридного белка является образование тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, выход которого достигает 3% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.

Чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как энтерокиназа, фактор X и др., а также с целью удешевления этой стадии используют в составе гибридного белка мини-интеин GyrA из Mycobacterium xenopi (Telenti, A., Southworth, М., Alcaide, F., Daugelat, S., Jacobs, W.R. Jr. and Perler, F.B. (1997). J. Bacteriol.. 179, 6378-6382.) для направленного автокаталитического расщепления гибрида на целевой полипептид и интеин. Для этой цели амплифицируют ген тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 (SEQ ID NO 1) с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, и клонируют его в векторную плазмиду pTWIN1, содержащую ген интеина из Mycobacterium xenopi GyrA, и участок связывания с хитином (Chitin-Binding Domen) из Bacillus circulans (Telenti, A., Southworth, M., Alcaide, F., Daugelat, S., Jacobs, W.R. Jr. and Perler, F.B. (1997). J. Bacteriol.. 179, 6378-6382; Evans, J, T.C., Bermer, J., Xu, M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., 274, 18359-18363), по сайтам рестриктаз NdeI и SapI. Далее для получения полицистронной конструкции участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно, нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин и сайты эндонуклеаз рестрикции NcoI и XhoI, синтезируют из двух олигонуклеотидов и клонируют в вектор pTWIN1 по сайтам эндонуклеаз рестриции Pst I и BamHI. Далее с помощью искусственно синтезированных олигонуклеотидов амплифицируют участок генома Escherichia coli, кодирующий сериновую ацетилтрансферазу, и клонируют в полученную до этого векторную плазмиду pER-TA1GyrA-RBS по сайтам эндонуклеаз рестрикции NcoI и XhoI. Полученной экспрессионной плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer, строение которой приведено на фиг. 1, трансформируют клетки E. coli С3030.

Образующийся при экспрессии рекомбинантного гена гибридный белок TA1GyrA далее in vivo процессируется с отщеплением N-формилметионина и селективно ацетилируется по N-концевому серину. Этот гибридный белок способен к автокаталитическому расщеплению на тимозин 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека и интеин. Выход тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 высокой степени чистоты (98%) после обращенно-фазовой хроматографии достигает 3% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli С3030, содержащий плазмидную ДНК pER-TA1GyrA-AcSer для суперпродукции и продукции двух белков: гибридного белка TA1GyrA, содержащего последовательность тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека и интеин Мхе GirA, и фермента - сериновой ацетилтрансферазы E. coli соответственно.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TA1GyrA-AcSer

- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1;

- состоящую из из BsaBI/NdeI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащего последовательность промотора Т7 и оператора lacO; NdeI/PstI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного белка, включающего в себя адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1, последовательность интеина Мхе GyrA и последовательность хитинсвязывающего домена; PstI/NcoI-фрагмента ДНК, кодирующего ослабленную последовательность Шайна-Дальгарно и нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин; NcoI/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы;

- содержащая в качестве генетического маркера ген 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TA1GyrA-AcSer обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка TA1GyrA, содержащего на 5 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конце ген тимозина альфа 1, соединенного с геном Мхе GyrA. Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Ген человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 получают амплификацией участка плазмиды pIntTim3 (Р.С. Есипов, А.И. Гуревич, В.Н. Степаненко, Л.А. Чупова, Д.В. Чувиковский, А.И. Мирошников. Биоорг. химия 2004. V. 30 N5. Р. 481-486). Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты эндонуклеаз рестриции, вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и B1 (SEQ ID NO 3) и затем ген клонируют в векторную плазмиду pTWIN1.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент E. coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer отличается от штамма-реципиента E. coli С3030 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-TA1GyrA-AcSer, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E. coli С3030 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки E. coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer являются одновременно суперпродуцентом и продуцентом. При индукции изопропилтио- 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка TA1GyrA, который накапливается в клетках в количестве 15% суммарного белка клетки в растворимом виде. Продукция фермента составляет 6% по отношению к общим белкам клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-TA1GyrA-AcSer, для чего ген рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 3), содержащими сайты рестриктаз NdeI (N-конец гена, праймер А1) и SapI (С-конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pTWIN1. Далее участок, кодирующий измененную последовательность Шайна-Дальгарно, нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин и сайты эндонуклеаз рестриции PstI и BamHI, NcoI и XhoI (SEQ ID NO 6), синтезируют из двух олигонуклеотидов и клонируют в полученную плазмиду pER-TA1GyrA по сайтам рестрикции PstI и BamH1. Ген сериновой ацетилтрансферазы получают амплификацией генома E. coli с помощью ПЦР с праймерами В3 и A3 (SEQ ID NO 5), содержащими сайты эндонуклеаз рестриции NcoI и XhoI. Полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам плазмидой pER-TA1GyrA-RBS. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli С3030 и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.

Штамм-продуцент E. coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио- 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

На (SEQ ID NO 1) изображена структура гена рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1. На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого тимозина альфа 1.

Изобретение иллюстрируют следующие рисунки.

Фиг 1. Физическая карта плазмиды pER-TA1GyrA-AcSer.

Фиг 2. Электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E. coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer,

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -конца к 5 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -диметокситритил-N-ацил-2 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -дезоксинуклеозид-3 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -O-( 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0"> ), к которому через 3 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl ₂, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NdeI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Для приготовления гена тимозина альфа 1 проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

ДНК, содержащую измененную последовательность Шайна-Дальгарно, нестандартную в качестве старт-кодона аминокислоту валин, а также сайты эндонуклеаз рестрикции получают из двух синтетических олигонуклеотидов А2 и В2 (SEQ ID NO 4). Олигонуклеотиды смешивают в эквимольном количестве (по 600 пмоль), денатурируют при 90°С и подвергают отжигу при медленном понижении температуры до 30°С.

Плазмиду pER-TA1GyrA (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой PstI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой BamHII (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Полученный синтетический фрагмент с измененной последовательностью Шайна-Дальгарно (SEQ ID NO 6) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. В результате получается плазмида pER-TA1GyrA-RBS.

Плазмиду pER-TA1GyrA-RBS (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NcoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой XhoI (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Для приготовления гена сериновой ацетилтрансферазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК E. coli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды A3 и В3 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Фрагмент длиной 564 п.о. после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpin Extract II. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора.

Полученный синтетический фрагмент с последовательностью сериновой ацетилтрансферазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli С3030. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pER-TA1GyrA-AcSer и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI, SapI, PstI, BamHI, NcoI и XhoI. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pER-TA1GyrA-AcSer представлена на фиг. 1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации пзамиды. Ap^R - ген устойчисовсти к ампицилину. LacI - ген репрессора лактозного оперона. TA1GyrA - ген рекомбинантного белка, кодирующий тимозин альфа 1 человека и интеин GyrA. serAc - ген, кодирующий сериновую ацетилтрансферазу.

Пример 2

Получение штамма-продуцента E. coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer и определение его продуктивности.

Штамм-продуцент E. coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer получают трансформацией компетентных клеток E. coli С3030 плазмидой pER-TA1GyrA-AcSer, как описано в примере 1. Клетки E. coli С3030, несущие плазмиду, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются продуцентами двух белков.

Штамм продуцент E. coli С3030/pER-TA1GyrA-AcSer выращивают при 37°С в 100 мл LB-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио- 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А ₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А ₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. На фиг. 2. представлена электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E. coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer, где М - стандарт молекулярных масс, L - лизат клеток, 1 - гибридный белок, содержащий тимозин альфа 1, 2 - сериновая ацетилтрансфераза.

Пример 3

Получение гибридного белка TA1GyrA, его автокаталитическое расщепление и выделение рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека.

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка TA1GyrA (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ) и выделяют центрифугированием (15000 g, 45 мин) осветленный клеточный лизат. Наносят на хитиновый сорбент уравновешенный в буфере, содержащем 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, промывают буфером, содержащим 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, 2 М мочевину, и уравновешивают в буфере, содержащем 50 мМ Трис/HCl, 100 мМ NaCl, 100 мМ ДТТ, тем самым индуцируют автокаталитическое расщепление гибридного белка, затем инкубируют 24 ч при 25°С. Дальнейшую очистку рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 человека проводят посредством обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. Анализ полученного продукта проводят при помощи ОФ ВЭЖХ. Фракции с содержанием белка ТА1 не менее 98% объединяют и лиофилизуют. Выход рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 составляет 3 мг из 100 г клеток или 3% суммарного белка клеток.

Идентификацию образующегося рекомбинантного человеческого тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224. Полученный сигнал рекомбинантного тимозина 1 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина 1 человека, штамм eschrichia coli c3030/per-ta1gyra-acser - продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина 1 человека, патент № 2593172" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 соответствует расчетному значению массы 3108,31 Да.