фармацевтический состав, содержащий нейротоксин ботулина

Формула изобретения

1. Фармацевтический состав, содержащий нейротоксин ботулина, обладающий способностью ингибировать сердечные аритмии, включающий активный агент и физиологически приемлемый наполнитель, который в качестве нейротоксина ботулина содержит ботулотоксин типа А, в качестве активного агента - мукополисахарид, выбранный из группы, содержащей хитозан, гепарин, надропарин, гиалуроновую кислоту, взятые в соотношении 1:(10³-10⁹), предпочтительно 1:(10⁶-10⁸) по массе, соответственно, при следующем содержании компонентов:

ботулотоксин типа А	1-200 ЕД/мл
мукополисахарид	0,1-50 мг/мл
физраствор	0,1-50 мл

2. Фармацевтический состав по п.1, в котором мукополисахарид выбран из группы, включающей хитозан, гепарин, надропарин и гиалуроновую кислоту.

3. Фармацевтический состав по п.1, в котором мукополисахаридом является хитозан.

4. Фармацевтический состав по п.1, содержащий:

ботулотоксин типа А	20 ЕД/мл (0,5 нг/мл)
хитозан	22 мг/мл
физраствор	0,5 мл

5. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

ботулотоксин типа А	50 ЕД/мл (1,25 нг/мл)
хитозан	22 мг/мл
физраствор	до 2 мл

6. Применение фармацевтического состава, содержащего нейротоксин ботулина, включающего активный агент и физиологически приемлемый наполнитель, который в качестве нейротоксина ботулина содержит ботулотоксин типа А, в качестве активного агента мукополисахарид, выбранный из группы, содержащей хитозан, гепарин, надропарин, гиалуроновую кислоту, взятые в соотношении 1:(10³-10⁹ ), предпочтительно 1:(10⁶-10⁸) по массе, соответственно, при следующем содержании компонентов:

ботулотоксин типа А1	200 ЕД/мл
мукополисахарид	0,1-50 мг/мл
физраствор	0,1-50 мл

для получения фармацевтической композиции для лечения сердечных аритмий.

7. Применение по п.6, в котором мукополисахаридом является хитозан.

8. Применение по п.7, в котором сердечными аритмиями является мерцательная аритмия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению фармацевтического состава, содержащего нейротоксин ботулина для использования в медицинской практике, предпочтительно в кардиологии для лечения нарушений сердечного ритма.

В настоящее время наиболее часто применяемый нейротоксин ботулина - нейротоксин ботулина типа А (ботулотоксин типа А). Этот нейротоксин получают в процессе брожения в присутствии штаммов Clostridium botulinum.

В клинической практике используется несколько препаратов на основе ботулотоксина типа А [Ботокс (Botox), Диспорт (Dysport), Ксеомин (Xeomin), Лантокс (Lantox)]. Помимо зарегистрированных в ряде стран применений существуют и пока не зарегистрированные области применения этих препаратов (Sheng Chen Clinical Uses of Botulinum Neurotoxins: Current Indications, Limitations and Future Developments // Toxins 2012. V. 4. P. 913-939.). К зарегистрированным FDA применениям относятся: в офтальмологии - лечение косоглазия; в неврологии - лечение блефароспазма, гемифациального спазма, спастической кривошеи (цервикальной дистонии), хронической мигрени (краниалгии), повышенной активности мышц-сжимателей, локального мышечного спазма у взрослых и детей старше 2 лет (в т.ч. детского церебрального паралича и мышечной спастичности), подмышечного гипергидроза, гиперсаливации; в эстетической медицине - ликвидация мимических морщин; в урологии -лечение нарушений нижнего отдела мочевого тракта; в гастроэнтерологии - лечение нарушений желудочно-кишечного тракта; в отоларингологии -лечение спазматической дисфонии.

В настоящий момент находятся в стадии изучения следующие области применения препаратов на основе ботулотоксина типа А: в стоматологии - лечение дисфункции височно-нижнечелюстного сустава; в неврологии - лечение хронических мускульно-скелетных болей и диабетической нейропатии; в гинекологии - лечение вагинизма; в травматологии и общей хирургии - улучшение заживления ран; в кардиологии - лечение нарушений сердечного ритма.

Нарушения ритма сердца - широко распространенная и сложная группа патологий сердца. Единственный эффективный и целесообразный хирургический метод лечения данных заболеваний - радиочастотная аблация (прижигание аритмогенных зон сердца при помощи высокочастотного электрического тока). Однако данный метод не обладает достаточной эффективностью (менее 60%) и имеет высокий риск осложнений, более 30% (Guidelines for the management of atrial fibrillation ESC/EHRA/EACTS 2010 R.Cappato. European Afib survey, Circulation 2010).

В последнее время в мировых публикациях появились работы, посвященные устранению нарушений сердечного ритма при помощи нейротоксина ботулина, однако эффект подавления индукции фибрилляции предсердий сохранялся не более чем 1 неделю (Botulinum Toxin Injection in Epicardial Autonomic Ganglia Temporarily Suppresses Vagally Mediated. Atrial Fibrillation. Seil Oh; Eue-Keun Choi;Youhua Zhang; Todor N. Mazgalev. Circ Arrhythm Electrophysiol. 4, 560-565, 2011). Продолжительность данного периода неприемлема в клинической практике.

В настоящий момент производители препаратов на основе ботулотоксина занимаются поиском стабилизирующих агентов, представляющих различные белки, аминокислоты, полисахариды и другие компоненты для повышения срока сохранности токсина, а также его эффективной доставки к органу-мишени.

Известен фармацевтический состав, включающий нейротоксин ботулина, выделенный из серотипов А, В, С, D. Е, F или G C.botulinum, иполиаминокислоту, выбранную из группы полилизин, полиаргинин, полигистидин или полиорнитин (заявка RU 2011125775 А, оп.10.02.2013).

Недостатком известного состава является то, что он не обладает пролонгированным действием, не увеличивает терапевтический эффект ботулотоксина и не предназначен для лечения нарушения сердечного ритма.

Известна фармацевтическая композиция, включающая ботулотоксин типа А в количестве от 6 пг до 30 нг с биологической активностью приблизительно 50-250 Ед LD₅₀, а также дополнительные компоненты, такие как буфер рН, наполнитель, разбавитель, криопротекторное средство и/или стабилизатор, выбранный из группы гиалуроновая кислота, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль (патент RU 2453333 С2, опубл. 20.06.2012).

Недостатком известной композиции является то, что она не обладает пролонгированным действием, не увеличивает терапевтический эффект ботулотоксина и не предназначена для лечения нарушения сердечного ритма.

Наиболее ближайшим к заявляемому составу - прототипом является фармацевтический состав, содержащий нейротоксин ботулина, представляющий собой жидкий фармацевтический состав, содержащий: (а) комплекс нейротоксина ботулина (типа А, В, С, D, Е, F или G) или высокочистый нейротоксин ботулина (типа А, В, С, D, Е, F или G) в концентрации от 50 до 10000 единиц LD5o на 1 мл раствора, (б) стабилизирующий агент, содержащий поверхностно-активное вещество (ПАВ), преимущественно полисорбат-80 в количестве от 0,005 до 0,02 об.%, (в) хлорид натрия в качестве кристаллического агента в концентрации 0,15 до 0,3 М; (г) дисахарид, преимущественно сахарозу, в концентрации 10-20 мМ; (д) буфер, преимущественно гистидиновый, для поддержания рН 5,5-7,5 и воду (патент RU 2407541 С2, опубл. 27.12.2010).

Недостатком известного состава является то, что он не предназначен для лечения нарушения сердечного ритма, а также то, что он обладает только свойством лучшего сохранения активности ботулотоксина без каких-либо указаний на пролонгацию действия, уменьшение терапевтической дозы и побочных эффектов.

Задачей изобретения является создание фармацевтического состава на основе нейротоксина ботулина, пригодного для лечения нарушения сердечного ритма, обладающего высоким терапевтическим эффектом, повышенной длительностью (пролонгацией) действия и минимальным побочным эффектом.

Технический результат: повышение фармакологической активности состава на основе ботулотоксина типа А, уменьшение необходимой разовой дозы для достижения необходимого терапевтического эффекта, пролонгация действия ботулотоксина, уменьшение побочных эффектов ботулотоксина, возможность приготовления состава с необходимыми для персональной медицины свойствами непосредственно в клинике и увеличенное время сохранения активности готового к введению раствора.

Поставленная задача решается предлагаемым составом, содержащим ботулотоксин типа А и мукополисахарид, взятые в соотношении 1: (103-10), предпочтительно 1:(10-10) по массе соответственно, и фармацевтически приемлемый наполнитель при следующем содержании компонентов:

ботулотоксин типа А	1-200 ЕД/мл
мукополисахарид	0,1-50 мг/мл
физиологический раствор	0,1-50 мл

В качестве ботулотоксина типа А могут быть использованы коммерчески доступные препараты на основе ботулотоксина типа А, например «Ботокс», «Диспорт», «Ксеомин», «Лантокс» и др. В качестве мукополисахарида предпочтительно используют хитозан, гепарин, надропарин. В качестве фармацевтически приемлемого наполнителя преимущественно используют физиологический раствор (0.9% раствор хлорида натрия). Заявляемый состав может включать, но не обязательно, дополнительные компоненты, такие как буфер рН, наполнитель, разбавитель, криопротекторное средство и/или стабилизатор.

Заявляемый состав готовят путем смешивания водных растворов компонентов состава в заданных пропорциях.

Определяющими отличиями заявляемого состава от прототипа являются:

1) в качестве нейротоксина ботулина используют чистый ботулотоксин типа А либо коммерчески доступный препарат на основе ботулотоксина типа А, что позволяет производить приготовление необходимого раствора непосредственно в клинической практике из доступных компонентов;

2) в качестве второго активного компонента состава используют мукополисахарид (гликозаминогликан), выбранный из группы хитозан, гепарин, надропарин, гиалуроновая кислота, взятый в соотношении с ботулотоксином типа А, равном 1:(10³-10⁹ ), предпочтительно 1:(10⁶-10⁸) по массе соответственно, что позволяет увеличить продолжительность действия препарата, повысить его биологическую активность, снизить побочные эффекты в виде системного эффекта и выработки иммунорезистентности.

Преимущество предлагаемых составов ботулотоксина с мукополисахаридом состоит в том, что одновременно достигаются два значимых фактора - уменьшение необходимой терапевтической дозы с увеличением продолжительности действия препарата, а также уменьшение побочных действий в виде нежелательной денервации не задействованных в эксперименте мышц и развития системных эффектов.

Дополнительным преимуществом состава является возможность его приготовления непосредственно в клинике из коммерчески доступных препаратов ботулотоксина и мукополисахарида, что дает возможность тонкой настройки необходимых свойств.

При увеличении соотношения активных компонентов в составе (ботулотоксин типа А/мукополисахарид) выше 1:109 по массе возникают сложности с приготовлением терапевтически приемлемых инъекций. Например, при соотношении ботулотоксин типа А/хитозан, равном 1:10 ⁹ _, и активности ботулотоксина 40 ЕД (соответствует 1 нг), необходимое количество хитозана составляет 1 г, что для клинически приемлемых концентраций хитозана в инъекции 2% приводит к объему инъекции порядка 50 мл. Такой объем является избыточным для терапии. При уменьшении соотношения активных компонентов в составе (ботулотоксин типа А/ мукополисахарид) ниже 1:10 ³ по массе эффективность состава значительно снижается и приближается к таковой для обычных препаратов ботулотоксина типа А.

Ботулотоксин серотипа А имеет молекулярную массу приблизительно 150 кДа и представляет собой белок в форме двойной полипептидной цепи, состоящей из тяжелой цепи и легкой цепи, которые связаны дисульфидным мостиком. У людей тяжелая цепь обуславливает закрепление с пресинаптическими холинергическими нервными окончаниями и поглощение клеткой токсина. Легкая цепь, как полагают, ответственна за токсические эффекты, действуя как цинк-эндопептидаза и расщепляя определенные белки, ответственные за мембранное слияние. Нарушая процесс мембранного слияния в пределах клеток, ботулотоксины предотвращают высвобождение ацетилхолина в синаптической щели. Полный эффект ботулотоксина в нервно-мышечной передаче должен прервать нервно-мышечную передачу и в действительности денервировать мышцы. У ботулотоксина также имеется активность в других периферических холинергических синапсах, вызывающая уменьшение слюноотделения или потоотделения.

Мукополисахариды (гликозаминогликаны) представляют собой полимеры, состоящие из повторяющихся звеньев - остатков уроновых кислот (D-глюкуроновой или L-идуроновой) и сульфатированных и ацетилированных аминосахаров (могут встречаться и остатки других, минорных сахаров). Мукополисахариды широко представлены в живых организмах, например, они содержатся в различных видах соединительной ткани и некоторых жидкостях организма (синовиальная жидкость суставов, стекловидное тело глаза) и выполняют множество важных функций от противосвертывающей активности (гепарин) до участия в иммунных реакциях.

Гепарин - мукополисахарид, антикоагулянт прямого действия, характеризуется молекулярной массой, сравнимой с молекулярной массой ботулотоксина;

Надропарин - мукополисахарид, антикоагулянт прямого действия, является низкомолекулярным гепарином с молекулярной массой, более чем на порядок меньше, чем у ботулотоксина;

Хитозан - мукополисахарид, имеющий молекулярную массу, сравнимую с молекулярной массой ботулотоксина. По своему строению близок к полимеру, выстилающему интиму сосудов, обладает полной биосовместимостью с тканями человека, отличается низкой токсичностью.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление фармацевтического состава ( № 1), содержащего ботулотоксин типа А и хитозан в соотношении 1 к 4,4×10⁷ по массе.

Для приготовления раствора ботулотоксина типа А во всех экспериментах использовали препарат «Ксеомин» производства MERZ PHARMA GmbH & Co., KGaA (Германия), регистрационный номер ЛСР-004746/08, вспомогательные вещества сахароза и сывороточный альбумин человека, или препарат «Лантокс» производства Lanzhou Institute of Biological Products, (Китай), регистрационный номер ЛСР-001587/08, вспомогательные вещества: желатин, декстран и сахароза.

В обоих случаях использовали флаконы, содержащие по 100 ЕД ботулотоксина, в каждый флакон добавляли по 1000 мкл стерильного физраствора. Полученные растворы использовали для смешивания с раствором хитозана.

Для приготовления 2.75% раствора хитозана использовали препарат «Хитозоль» производства ООО "Биоаванта" (наукоград Кольцове, Новосибирская область). Степень дезацетилирования не менее 90%, мол. вес ~500 kDa.

Фармацевтический состав готовили путем смешения в шприце объемом 1 мл, снабженном системой Luer-Lok Tip, 100 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 10 ЕД или 0,25 нг ботулотоксина типа А) и 400 мкл 2,75% раствора хитозана (содержит 11 мг хитозана). В результате получили жидкий фармацевтический состав, содержащий следующие компоненты:

ботулотоксин типа А	20 ЕД/мл (0,5 нг/мл)
хитозан	22 мг/мл
физраствор	до 0,5 мл

Пример 2. Приготовление фармацевтического состава ( № 2), содержащего ботулотоксин типа А и хитозан в соотношении 1 к 1,76×10⁷ по массе.

Фармацевтический состав готовили путем смешения в шприце объемом 2 мл. Приготовили раствор 100 ед. ботулотоксина в 400 мкл физраствора и использовали его (содержит 100 ЕД или 2,5 нг ботулотоксина типа А) для смешивания с 1600 мкл 2,75% раствора хитозана (содержит 44 мг хитозана).

В результате получили жидкий фармацевтический состав, содержащий следующие компоненты:

ботулотоксин типа А	50 ЕД/мл (1,25 нг/мл)
хитозан	22 мг/мл
физраствор	до 2 мл

Пример 3. Приготовление фармацевтического состава ( № 3), содержащего ботулотоксин типа А и гепарин в соотношении 1 к 1,6×10⁷.

Для эксперимента использовали раствор гепарина с концентрацией 5000 МЕ/мл производства ОАО «Синтез» г.Курган, регистрационный номер Р N000116/01. Одна единица действия гепарина равна 0,0077 мг международного стандарта гепарина, т.е. в 1 мг препарата содержится 130 ME (Першин Г.Н., Гвоздева Е.И. Учебник фармакологии. - Москва: Медгиз, 1961. - С.405).

Для получения фармацевтического состава смешали 100 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 10 ЕД или 0,25 нг ботулотоксина типа А), 104 мкл раствора гепарина, содержащего 4 мг гепарина(~520 ME) и физраствор до 500 мкл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	20 ЕД/мл (0,5 нг/мл)
гепарин	1040 МЕ/мл (8 мг/мл)
физраствор	до 0,5 мл

Пример 4. Приготовление фармацевтического состава ( № 4), содержащего ботулотоксин типа А и гепарин в соотношении 1 к 5,3×10⁶.

Аналогично примеру 3 для получения фармацевтического состава смешали 300 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 30 ЕД или 0,75 нг ботулотоксина типа А), 104 мкл раствора гепарина, содержащего 4 мг гепарина(~520 ME) и физраствор до 500 мкл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	60 ЕД/мл (1,5 нг/мл)
гепарин	1040 МЕ/мл (8 мг/мл)
физраствор	до 500 мкл

Пример 5. Приготовление фармацевтического состава ( № 5), содержащего ботулотоксин типа А и надропариан в соотношении 1 к 8×10⁶.

Для эксперимента использовали раствор фраксипарина (надропарин) производства Санофи Винтроп Индустрия, Франция, регистрационный номер П N012486/01 с концентрацией 9500 ME в мл. Одна единица действия низкомолекулярного гепарина - надропарина (средняя молекулярная масса 4000-7000 дальтон) была принята нами равной одной единице действия гепарина, т.е. 0,0077 мг.

Для получения фармацевтического состава смешали 100 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 10 ЕД или 0,25 нг ботулотоксина типа А), 27 мкл раствора надропарина, содержащего 2 мг надропарина (-260 ME) и физраствор до 500 мкл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	20 ЕД/мл (0,5 нг/мл)
надропарин	520 МЕ/мл (4 мг/мл)
физраствор	до 0,5 мл

Пример 6. Приготовление фармацевтического состава ( № 6), содержащего ботулотоксин типа А и надропариан в соотношении 1 к 2,67×10⁶.

Для получения фармацевтического состава смешали 300 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 30 ЕД или 0,75 нг ботулотоксина типа А), 27 мкл раствора надропарина, содержащего 2 мг надропарина(~260 ME) и физраствор до 500 мкл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	60 ЕД/мл (1,5 нг/мл)
надропарин	520 МЕ/мл (4 мг/мл)
физраствор	до 0,5 мл

Пример 7. Приготовление фармацевтического состава № 7, содержащего ботулотоксин типа А и гепарин в соотношении 1 к 10⁹ _.

Для получения фармацевтического состава № 7 смешали 10 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 1 ЕД или 0,025 нг ботулотоксина типа А), 650 мкл раствора гепарина, содержащего 25 мг гепарина(~3250 ME) и физраствор до 1 мл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	1 ЕД/мл (0,025 нг/мл)
гепарин	3250 МЕ/мл (25 мг/мл)
физраствор	до 1 мл

Пример 8. Приготовление фармацевтического состава № 8, содержащего ботулотоксин типа А и гепарин в соотношении 1 к 7×10⁵

Для получения фармацевтического состава № 8 смешали 800 мкл раствора ботулотоксина типа А, приготовленного из 200 ЕД препарата Ксеомин и физраствора (содержит 5 нг ботулотоксина типа А), 100 мкл раствора гепарина, содержащего 3,8 мг гепарина(~500 ME) и физраствор до 1 мл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	200 ЕД/мл (5 нг/мл)
гепарин	500 МЕ/мл (3,8 мг/мл)
физраствор	до 1 мл

Пример 9. Приготовление фармацевтического состава № 9, содержащего ботулотоксин типа А и гепарин в соотношении 1 к 1,54×10⁸.

Для получения фармацевтического состава № 9 смешали 1000 мкл раствора ботулотоксина типа А (содержит 100 ЕД или 2,5 нг ботулотоксина типа А), 10 мл раствора гепарина, содержащего 385 мг гепарина(~50000 ME) и физраствор до 50 мл. Получили фармацевтический состав, содержащий:

ботулотоксин типа А	2 ЕД/мл (0,05 нг/мл)
гепарин	1000 МЕ/мл (7,7 мг/мл)
физраствор	до 50 мл

Пример 10. Приготовление фармацевтического состава № 10, содержащего ботулотоксин типа А и хитозан в соотношении 1 к 2×10⁸ по массе.

Аналогично примеру 1 приготовили раствор 5% хитозана в физрастворе. 10 мл этого раствора использовали для растворения 100 ЕД ботулотоксина типа А (содержит 100 ЕД или 2,5 нг ботулотоксина типа А и 500 мг хитозана). В результате получили жидкий фармацевтический состав, содержащий следующие компоненты:

ботулотоксин типа А	10 ЕД/мл (0,25 нг/мл)
хитозан	50 мг/мл
физраствор	до 10 мл

Пример 11. Биологические испытания полученных фармацевтических составов.

Оценка эффективности и безопасности применения ботулотоксина тип А в фармацевтических составах ( № 1-6) производилась по сравнению с растворами коммерческих препаратов ботулотоксина типа А в физрастворе в той же дозе, выраженной в ЕД.

Исследование проводилось в рамках «Good Laboratory Practice)), в соответствии с правовыми и этическими нормами обращения с животными, и одобрением локального этического комитета. Для каждого эксперимента использовали две группы экспериментальных животных по 10 крыс Вистар в каждой. Каждой группе в правое бедро вводился ботулотоксин типа А, разведенный в 0,9% растворе натрия хлорида (физ раствор); в левое бедро вводился фармацевтический состав ( № 1-6).

Наркоз: эфир.

Объем инъекции: 0,5 мл в каждое бедро.

Метод введения: в/м, в три инъекционные точки (задняя, медиальная, латеральная поверхности бедра) по 0,16 мл в каждую.

Сравнение результатов проводили методом оценки сокращения мышц бедра в ответ на электростимуляции. Сравнивалось изменение минимального порога внутримышечной электростимуляции с течением времени. Измерение порога электростимуляции проводилось внутримышечно при помощи двух стерильных стальных микроэлектродов и аппарата ERA 300 (Biotronic, США). Данные микроэлектроды временно, на период измерения, вводились внутримышечно на глубину около 4 мм в область наружной поверхности бедра мыши, на расстоянии 10 мм друг от друга. Увеличение минимального порога внутримышечной электростимуляции, выраженное в вольтах, свидетельствует о наступлении денервации мышц. Степень денервации, а следовательно, и физиологическое действие ботулотоксина и составов на его основе оценивались численно по соотношению полученного значения к сравнительному. Например, если минимальный порог внутримышечной электростимуляции составлял для состава № 1: 4,0±0,2 В, а у контроля 2,0±0,12 В, то физиологическое действие состава № 1 в данный момент измерений повышено в 2 раза по сравнению с коммерческим препаратом ботулотоксина.

Перед инъекциями в разных группах наблюдалась общая высокая активность экспериментальных животных. В первый день после инъекций наблюдалась наркотическая седация. Через неделю после инъекций объективно паралич всех нижних конечностей, передвижение за счет верхних конечностей у всех крыс. Крысы после инъекций 10 ЕД ботулотоксина типа А умеренно заторможены, крысы после инъекций 30 ЕД ботулотоксина типа А выраженно заторможены. Минимальные пороги внутримышечной электростимуляции составляли для состава № 1 4,0±0,1 В (контроль 2,5±0,1 В, исходно 1,5±0,1 В), состава № 2 10,0±0,4 В (контроль 3,0±0,1 В, исходно 1,0±0,1 В).

Через 2 недели после инъекций объективно паралич всех нижних конечностей, передвижение за счет верхних конечностей у всех крыс. Крысы после инъекций 10 ЕД ботулотоксина типа А умеренно заторможены, крысы после инъекций 25 ЕД ботулотоксина типа А выражено заторможены. Крысы потеряли в весе, отказ от пищи и воды. Минимальные пороги внутримышечной электростимуляции составляли для состава № 1 6,0±0,3 В (контроль 2,5±0,2 В), состава № 2 10,0±0,5 В (контроль 2,3±0,1 В).

Через 3 недели после инъекций объективно паралич всех нижних конечностей, передвижение за счет верхних конечностей у всех крыс. В динамике активность крыс выросла. Активно пьют, едят. Минимальные пороги внутримышечной электростимуляции составляли для состава № 1 4,0±0,1 В (контроль 2,0±0,1 В), состава № 2 5,0±0,2 В (контроль 1,8±0,1 В).

Через 4 недели после инъекций объективно: крысы активны, парез нижних конечностей. Минимальные пороги внутримышечной электростимуляции составляли для состава № 1 4,0±0,2 В (контроль 2,0±0,12 В), состава № 2 5,0±0,3 В (контроль 2,0±0,2 В).

Для составов № 3-6 обнаружилось влияние на высвобождение ботулотоксина: максимум эффекта наблюдался не на первой неделе после инъекции, а на второй неделе, но абсолютное значение отличий от контроля было не столь велико, как в случае хитозана. Так, для состава № 3 минимальные пороги внутримышечной электростимуляции на второй неделе составляли 1,8±0,1 В (контроль 2,3±0,1 В, исходно 1,0±0,1 В), а для состава № 5 2,2±0,1 В (контроль 1,5±0,1 В, исходно 1,2± 0,1 В). Аналогичные результаты были получены и для составов № 4 и № 6. Вероятно, гепарин довольно прочно удерживает ботулотоксин типа А, препятствуя его биологическому действию, по сравнению с коммерческими препаратами, тогда как низкомолекулярный надропарин напротив - усиливает действие ботулотоксина.

Токсическое действие новых составов оценивалось по гисто-морфологическому исследованию. Для оценки общетоксического действия ботулотоксина и его комплексов было проведено гистологическое исследование внутренних органов экспериментальных животных, крыс Вистар. При микроскопическом анализе формалин-фиксированных и заключенных в парафин образцов тканей печени, почек, селезенки, сердца, скелетной мускулатуры и головного мозга не было обнаружено никаких морфологических признаков патологических изменений. Поэтому было сделано заключение об отсутствии поражающего воздействия препаратов ботулотоксина типа А и заявляемых фармацевтических составов на его основе в исследуемых дозировках на ткани и органы экспериментальных животных.

Пример 12. Исследование подавления индукции фибрилляции предсердий путем инъекции фармацевтического состава, содержащего ботулотоксин типа А в эпикардиальные жировые подушки.

Испытание проводили на группе из 10 собак с использованием фармацевтического состава № 2. Эпикардиальные жировые подушки, содержащие правые центры ганглионарных сплетений левого предсердия были выделены через правую боковую торакотомию. В группе опыта (5 собак) в каждую из двух правых жировых подушек вводилось по 1 мл раствора 50 ЕД ботулотоксина типа А+хитозан (в общей сложности 100 ЕД ботулотоксина типа А - 2 мл, фармсостав № 2). В группе контроля (5 собак) в каждую из двух жировых подушек водилось по 1 мл раствора 50 ЕД ботулотоксина типа А+0,9% раствор натрия хлорида (в общей сложности 100 ЕД ботулотоксина типа А - 2 мл).

Электрофизиологические эффекты были оценены через 1, 2, 3 и 4 недели с и без шейной стимуляцией блуждающего нерва. Эффект повышении степени индукции фибрилляции предсердий за счет шейной стимуляции блуждающего нерва был достигнут в обеих группах собак. Данный эффект был блокирован введением опытного и контрольного раствора ботулотоксина в целевых дозах, в вышеописанные зоны, в обеих группах. В группе контроля блок вагусного эффекта исчез на 8-й день периода наблюдения. В группе опыта блок вагусного эффекта сохранялся более 30 дней периода наблюдения. Таким образом, временное подавление эффекта снижения степени индукции фибрилляции предсердий инъекцией ботулотоксина в эпикардиальные жировые подушки левого предсердия было продлено более чем до 30 дней (не менее чем в 4 раза) применением фармсостава № 2.

Использование предлагаемого фармацевтического состава, содержащего ботулотоксин типа А, позволит повысить фармакологическую активность последнего, уменьшить необходимую разовую дозу для достижения необходимого терапевтического эффекта, обеспечить пролонгацию действия ботулотоксина, уменьшить побочные эффекты ботулотоксина.