ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

набор синтетичеcких олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (filaginella uliginosa (l.) opiz)

Классы МПК:G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот
C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-05-30
публикация патента:

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии и предназначено для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для ПЦР с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, включающий прямой и обратный праймеры и разрушаемый зонд. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет быстро и достоверно провести идентификацию лекарственного растения. 1 ил., 1 пр.

Рисунки к патенту РФ 2535063

набор синтетичеcких олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности   сушеницы болотной (filaginella uliginosa (l.) opiz), патент № 2535063

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени, и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля. При проведении анализа методов детекции продукта полимеразной цепной реакции выбран метод на основе разрушаемого зонда, так как он относится к специфичным методам детекции, возможно свободное использование без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].

Прототип - рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers//Planta Med. 2007, Oct; 73(13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. В прототипе используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений.

Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируется лекарственное растение с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров, отличных от заявленных. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, для идентификации данного растения используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом. 1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя - BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав).

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) не известны.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.

Пример:

1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 10 сек, 58°С - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь, конечным объемом 25 мкл, содержит: 14,1 мкл Н2O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgC12; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис.1.

Для выявления сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-СAACGGATATCTCGGCTCАС-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GTACGACTCAAGACGCACAA-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).

Гаситель располагается на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов.

Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, отличающийся тем, что для идентификации используют видоспецифичные участки для создания прямого, обратного праймеров и разрушаемого зонда, где в качестве прямого праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CAACGGATATCTCGGCTCAC-3'; обратного праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GTACGACTC AAGACGC АСАА-3'; разрушаемого зонда - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2535063

patent-2535063.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Патенты РФ в классе G01N33/68:
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка -  патент 2528908 (20.09.2014)
способ диагностики генетической предрасположенности к нарушениям сердечной проводимости -  патент 2528900 (20.09.2014)
способ прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии -  патент 2527768 (10.09.2014)
способ прогнозирования риска развития рестеноза коронарных артерий после их стентирования у пациентов с ишемической болезнью сердца -  патент 2523391 (20.07.2014)
способ определения индивидуальной радиочувствительности больных злокачественными новообразованиями при проведении лучевой терапии -  патент 2522507 (20.07.2014)
способ прогнозирования прерывания беременности в первом триместре -  патент 2522244 (10.07.2014)
способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления -  патент 2522231 (10.07.2014)
способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью -  патент 2521202 (27.06.2014)
способы и применения, включающие гемсвязывающий белок 1 -  патент 2520748 (27.06.2014)
композиции и мультипараметричекие способы анализа для измерения биологических медиаторов физиологического здоровья -  патент 2520080 (20.06.2014)

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

Патенты РФ в классе C12Q1/68:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)


Наверх