Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа

Классы МПК:G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого
G01N33/543 с нерастворимым носителем для иммобилизации иммунологических материалов
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Марданлы Сейфаддин Гашим оглы (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-07-19
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики вируса простого герпеса первого типа методом твердофазного иммуноферментного анализа. Изобретение представляет собой способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий предварительную обработку полимерного твердофазного носителя, на который сорбируется антиген вируса герпеса 1 типа, водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), с последующей адсорбцией на носителе в 0,2M карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа, приготовленного из штамма вируса простого герпеса 1 типа - АТСС VR-539, отмывку, лиофильную сушку, инкубацию сорбированных антигенов с блокирующим раствором. Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа АТСС-VR-539 позволяет значительно повысить чувствительность анализа, система блокировки на основе триса позволяет нейтрализовать нежелательные неспецифические реакции. Также использование изобретения приводит к улучшению условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя, уменьшению расхода реагентов. Использование полиэтиленгликоля при обработке планшета повышает специфичность и чувствительность набора. 1 табл., 1 пр.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики вируса простого герпеса первого типа методом твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, который является наиболее используемым при диагностике различных вирусных, бактериальных и других инфекций. Метод удобен для выполнения большого числа однотипных исследований.

Предшествующий уровень техники

Известен способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита C (патент РФ № 2095815, класс МКИ G01N 33/543). Сущность способа заключается в том, что лунки полистиролового планшета обрабатывают вирусспецифическим белком (ФАВ), инкубируют при заданной температуре, избыток ФАВ удаляют, промывают планшет фосфатным буфером и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания лунки планшета обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота. Затем планшет герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты. Иммуносорбент (твердофазный носитель с иммобилизованным антигеном) сохраняет высокую специфическую активность в течение года.

Недостатком этого способа является то, что в качестве вирусспецифического антигена используют рекомбинантный штамм E.coli, использование которого не гарантирует высокой чувствительности теста.

Известен также способ получения иммуносорбента для диагностики текущей инфекции ЦМВ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (патент РФ № 2028156, класс МКИ A61K 39/245). Сущность способа заключается в том, что из ядерной фракции клеток, инфицированных ЦМВ, через 48-72 ч после их инфицирования выделяют вирусспецифические "ранние" белки, которые адсорбируют в лунках 96-луночных полистироловых пластин. Заражают перевиваемую линию клеток фибробластов эмбриона человека цитомегаловирусом, штамм AD-169, который был получен из Американской коллекции вирусов и в настоящее время поддерживается в лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИ вирусных препаратов Российской АМН СССР. Через 48-72 ч после заражения проводят выделение ядерной фракции клеток. Для этого инфицированные вирусом клетки отделяют от стекла раствором трипсина и однократно промывают фосфатно-буферным раствором pH 7.4 (ФСБ). Осадок клеток, разведенный в дважды дистиллированной воде, содержащей 2% фетальной телячьей сыворотки, инкубируют в течение 15 минут в ледяной бане. Затем добавляют равный объем 1% раствора неионного детергента (NP-40) и полученную смесь гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса. Ядра отделяют от цитоплазматических осколков центрифугированием через 22,5% раствор Ficoll 400, приготовленного на ФСБ, pH 7,4, при 1800 g в течение 15 мин при 4°C. Осадок однократно промывают ФСБ, pH 7,4, ресуспендируют в том же буфере и обрабатывают ультразвуком (три цикла по 30 с с интервалом между циклами в 1 мин). Полученный "ядерный" антиген, содержащий ранние белки ЦМВ, осветляют центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин. Для получения иммуносорбента в лунки нечетных рядов (A, C, E, G) полистироловых 96-луночных микротитровальных пластин вносят по 100 мкл (0,1 мл) вирусного антигена в концентрации не менее 1 мкг на лунку. В лунки четных рядов (B, D, F, H) вносят по 100 мкл контрольного антигена, выделенного из незараженной культуры клеток тем же способом, что и вирусный антиген. Пластины, закрытые крышками, инкубируют при 4-10°С в течение 18-20 ч. После 3-кратного промывания дистиллированной водой, содержащей 2% твина-20, пластины с нагруженными антигенами хранят при 4-10°С до использования. Срок хранения иммуносорбента 6 мес.

Недостатком этого способа является короткий срок хранения предлагаемого иммуносорбента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий шесть этапов - сорбция антигена, отмывка, лиофильная сушка в атмосфере азота, инкубация с блокирующим раствором, повторная лиофильная сушка в атмосфере азота и запайка планшетов в вакуумных пакетах, в качестве антигенов использованы высокоочищенные натуральные антигены ВПГ-1 штаммов MS и G, полученные на фирме Viro-Immun из разрушенных ультразвуком культур клеток почки обезьяны (Герпетическая инфекция (простой герпес). Этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, лечение, С.Г. Марданлы, Г.И. Кирпичникова, В.А. Неверов. - Электрогорск: ЗАО «ЭКОлаб», 2011).

Недостатком этого способа является то, что в нем отсутствует стадия предварительной подготовки (активации) полимерного твердофазного носителя перед адсорбцией антигена, что приводит к увеличению расхода антигена при последующей обработке. Кроме того, практическое применение штаммов MS и G показало их нестабильность при хранении более 6 месяцев. Следует также отметить, что условия приготовления иммуносорбента оставляют возможность для неспецифического связывания компонентов реакционной смеси.

Цель и сущность изобретения

Целью настоящего изобретения явилось совершенствование способа получения иммуносорбента.

Сущность изобретения заключается в предварительной подготовке (активации) полимерного твердофазного носителя водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), сушке с последующей адсорбцией на выделенных лунках планшета антигенов вируса герпеса 1 типа.

Далее проводят сорбцию 96-луночного разборного полистиролового планшета фирмы Nunc Maxi Sorp (Дания) в 0,2М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатным высокоочищенным антигеном вируса герпеса 1 типа, приготовленным по следующей схеме: используют штамм вируса простого герпеса 1 типа McIntyre [коллекция АТСС -VR-539]. Вирус выращивается на культуре эпителиальных клеток почек зеленых мартышек Vero-B, предоставленных доктором Ходавандом, компания Viro-Immun, Германия. Данную культуру с посевной концентрацией 120 кл/мл выдерживают в «матрацах» при температуре 37±1°C в течение 4-х дней до образования плотного монослоя клеток. Затем вносят вирус герпеса 1-го типа в дозе 0,2 ТЦД (титр цитопатического действия) 90/клетку и проводят его адсорбцию. Зараженную культуру инкубируют 2 суток до полного разрушения монослоя в результате цитопатического действия вируса. С поверхности инфицированного клеточного монослоя удаляется ростовая среда и вносится фосфатно-солевой буферный раствор. После этого содержимое культурального флакона подвергают однократно замораживанию при -40°C и оттаиванию при комнатной температуре. Для окончательного высвобождения вируса из клеток данную вируссодержащую суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин 30 с при частоте 20 Гц. Высокоскоростным центрифугированием (8000 об/мин, 30 мин, при 4±1°C) отделяют остатки разрушенных клеток (детрит), осадок удаляют, а полученный супернатант, содержащий антиген, замораживают при -70°C. Полученный таким способом антиген размораживается, разводится в КББ (карбонат-бикарбонатном буфере) до концентрации белка 2 мкг/мл, вносится в лунки по 100 мкл, инкубируется при температуре (22±4)°C в течение (20-24) часов, отмывается дистиллированной водой, обрабатывается блокирующим раствором и лиофильно высушивается на машине лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK, при вакууме в 0,06 mbar в течение 3-х часов.

В качестве блокирующего неспецифические реакции раствора используется раствор следующего состава: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА (бычий сывороточный альбумин) - 5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой. Планшеты снова инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°C. Содержимое планшетов вытряхивают в контейнер для сброса, затем планшеты лиофильно сушат на машине DELTA 1-24 LSK в течение 3-х часов.

Готовые иммуносорбенты вкладывают в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и размещают вертикально в камере машины лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK. Выбирают режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Режим сушки - main drying. Продолжительность сушки - от 3 до 20 часов. Вакуум - 0,06 mbar. После этого производят вакуумную запайку иммуносорбентов. Планшеты вкладывают по одной штуке в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и запаивают с помощью устройства для вакуумной запайки планшетов. В течение процесса сушки периодически контролируют работу оборудования. По окончании сушки камеру заполняют очищенным азотом. Основные параметры процесса сушки иммуносорбента регистрируют в журнале учета работы лиофилизатора.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемому изобретению. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию - новизна.

Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа АТСС - VR-539 позволяет значительно повысить чувствительность анализа, специальная система блокировки на основе триса позволяет нейтрализовать нежелательные неспецифические реакции, которые могли бы возникнуть при использовании натуральных антигенов.

Кроме того, дополнительным техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является улучшение условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя (1 год в сравнении с 6 мес.), уменьшение расхода реагентов (за счет использования высокоиммуногенных белков в вирусном лизатном антигене). Использование полиэтиленгликоля при обработке планшета повышает специфичность и чувствительность набора.

Иммуносорбент, получаемый по предлагаемому способу, найдет широкое применение в здравоохранении, в частности в клинических лабораториях, для проведения химического, иммунохимического и иммунологического анализа и может быть использован для детектирования маркера вируса герпеса 1 типа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

Способ применения иммуносорбента осуществляется следующим образом.

Пример. Проведение анализа с использованием иммуносорбента, полученного по предлагаемому способу.

Вносят контрольные и исследуемые образцы (соблюдая указанную последовательность): в одну лунку (например, A1) - 100 мкл раствора для разведения образца (РРО); в две лунки (например, B1, C1) - по 100 мкл контрольного положительного образца (К+), в две лунки (например, D1, E1) - по 100 мкл контрольного «порогового» образца (К+способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 пор), в две лунки (например, F1, G1) - по 100 мкл отрицательного контрольного образца (K-), в следующие лунки - по 100 мкл рабочих разведений (1:100) исследуемых образцов (по 1 лунке на образец). При использовании вспомогательного планшета для разведения образцов в соответствующие лунки иммуносорбента вносят по 90 мкл РРО, а затем - по 10 мкл образцов, разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешивают пипетированием. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют образцы из лунок, 4 раза промывают планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме "Overflow", используют именно этот режим. По окончании промывки удаляют остатки влаги из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют жидкость из лунок, 4 раза промывают планшет. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают 10-15 мин при температуре от 21 до 25°C. Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор) вносят по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешивают содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступают к учету результатов.

Исследуемые образцы учитываются:

как положительные при ОП>1,1×ОП(К+пор),

как отрицательные при ОП<0,9×ОП(К+пор).

Образцы с ОП в пределах от 0,9×ОП(К+пор) до 1,1×ОП(К+пор), т.е. в так называемой "серой" зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы.

При повторном получении указанного результата рекомендуется мониторинг наличия антител у пациента для исключения неспецифических реакций, которые также могут давать сомнительные результаты.

Проведенные нами испытания с использованием иммуносорбента по настоящему изобретению (с использованием лизатных натуральных антигенов АТСС-VR-539) и иммуносорбента (по прототипу) на клиническом материале и на сыворотках доноров показали более высокую чувствительность и специфичность. Данные результаты отражены в сводной сравнительной таблице 1 по чувствительности и специфичности ИФА.

Дополнительно хотелось бы отметить, что проведенные нами испытания установили, что заявленная технология приготовления иммуносорбента позволила добиться сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя в течение 1 года.

Таблица 1
Заявляемый иммуносорбент«ИФА-ВПГ 1-IgG»
№ образцаТитр в ИФА (по калибр. графику)Результат № образцаТитр в ИФА Результат
396 160Положительный 396100отрицательный
473460 положительный473 400положительный
514390 положительный514 300положительный
515390 положительный515 300положительный
480320 положительный480 200положительный
485160 положительный485 100отрицательный
425180 положительный425 100отрицательный
468370 положительный468 300положительный
430420 положительный430 300положительный
461190 положительный461 100отрицательный
505160 положительный505 100отрицательный
512460 положительный512 400положительный
421230 положительный421 200положительный
435180 положительный435 200положительный
452170 положительный452 100отрицательный
501370 положительный501 300положительный
424190 положительный424 200положительный
528160 положительный528 100сомнительный
480370 положительный480 300положительный
491170 положительный491 100отрицательный
472180 положительный472 100отрицательный
478180 положительный478 200положительный
473500 положительный473 500положительный
514420 положительный514 400положительный
515430 положительный515 300положительный
480310 положительный480 200положительный
485170 положительный485 100отрицательный
425220 положительный425 200положительный
468340 положительный468 300положительный
донорыспособ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896
100 образцов способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 2 образца определены как положительные с титром 1:200100 образцов способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого   герпеса 1 типа, патент № 2528896 5 образцов определены как положительные с титром 1:200 (3 образца) и 2 образца с титром 1:300

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий предварительную обработку полимерного твердофазного носителя, на который сорбируется антиген вируса герпеса 1 типа водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), с последующей адсорбцией на носителе в 0,2 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа, приготовленного из штамма вируса простого герпеса 1 типа - АТСС VR-539, отмывку, лиофильную сушку, инкубацию сорбированных антигенов с блокирующим раствором, который готовится следующим образом: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА-5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой, после чего носитель повторно лиофильно высушивают.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2528896

patent-2528896.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого

Патенты РФ в классе G01N33/53:
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529795 (27.09.2014)
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529794 (27.09.2014)
способ оценки острой соматической боли -  патент 2529793 (27.09.2014)
способ оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса (впг) in vitro -  патент 2529792 (27.09.2014)
способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша -  патент 2529788 (27.09.2014)
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка -  патент 2528908 (20.09.2014)
способ прогнозирования риска развития тяжелого поражения нервной системы у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде -  патент 2528907 (20.09.2014)
способ прогнозирования развития психической дезадаптации -  патент 2528886 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)

Класс G01N33/543 с нерастворимым носителем для иммобилизации иммунологических материалов

Патенты РФ в классе G01N33/543:
способ детекции аналита из раствора на частицах и устройство для его реализации -  патент 2528885 (20.09.2014)
вращающееся магнитное поле для улучшенного детектирования при анализе кластеров -  патент 2528102 (10.09.2014)
иммунологический тест для определения аутоантител против антигенов семенников -  патент 2528060 (10.09.2014)
устройство для анализов и способ выполнения биологических анализов -  патент 2527686 (10.09.2014)
возбуждение магнитных шариков с использованием обратной связи для биосенсора на основе нпво -  патент 2526198 (20.08.2014)
магнитоуправляемый сорбент для удаления билирубина из биологических жидкостей -  патент 2524620 (27.07.2014)
приведение в действие импульсным магнитным полем для чувствительных анализов -  патент 2520607 (27.06.2014)
система биосенсора для приведения в действие магнитных частиц -  патент 2519655 (20.06.2014)
способы определения эффективности лиганда натрий-протонного антипортера -  патент 2519345 (10.06.2014)
высокочувствительный способ определения иммуноглобулин-протеиназной активности с использованием полимерных матриц -  патент 2519071 (10.06.2014)


Наверх