способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток

Формула изобретения

1. Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, представляющих клеточную линию человека, включающий стадии:

a. культивирования плюрипотентных клеток, и

b. обработки плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион.

2. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки представляют собой клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток.

3. Способ по п.2, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, выбранных из группы, состоящей из: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tral-60 и Tral-81.

4. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.

5. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 1 до 72 часов.

6. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 12 до 48 часов.

7. Способ по п.1, где плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение 48 часов.

8. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 100 нМ до 100 мкМ.

9. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 1 мкМ до 10 мкМ.

10. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации 10 мкМ.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обработки плюрипотентных клеток, позволяющему эффективно размножать плюрипотентные клетки в культуре и дифференцировать их путем обработки ингибитором активности фермента GSK-3B.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета I типа и нехватка островков Лангеранса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулинопродуцирующих клеток или -клеток, которые могли бы использоваться для трансплантации. Одним из возможных подходов является генерация функциональных -клеток из плюрипотентных клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3 beta, GATA-4, Mixl1, CXCR4 и SOX-17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX-1. В отсутствие PDX-1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорсального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX-1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

Для получения достаточного количества клеточного материала для трансплантации необходим источник требуемого клеточного материала, который можно было бы эффективно размножать в культуре, а затем эффективно дифференцировать в требуемые ткани, например в функциональные -клетки.

Известные на сегодняшний день способы культивации эмбриональных стволовых клеток человека достаточно сложны и требуют применения экзогенных факторов или культуральной среды химически определенного состава для поддержания пролиферации клеток без потери их плюрипотентности. Кроме того, дифференцирование эмбриональных стволовых клеток часто приводит к сокращению количества клеток, доступных для дальнейшего размножения в культуре.

В одном примере, в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005), описывается не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной заменяющей сыворотку среде (SR) с добавлением различных факторов роста, способных запускать самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере, US 20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может быть использована при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе данная среда является существенно изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. При культивировании клеток указанная среда содержит основную среду и количества bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточные для поддержания роста зародышевых стволовых клеток без их существенного дифференцирования.

В другом примере, WO 2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним из членов семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF ), одним из членов семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Известно, что ингибиторы гликогенсинтазы киназы-3 (GSK-3) стимулируют пролиферацию и размножение стволовых клеток взрослой особи. В одном примере, Tateishi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635), показано, что ингибирование GSK-3 повышает эффективность роста и выживаемость сердечных стволовых клеток человека (hCSCs), выделенных из сердца новорожденного или взрослого человека и обладающих мезенхимальными признаками.

Например, в работе Rulifson et al. (PNAS 144, 6247-6252, (2007)) утверждается, что активация каскада передачи сигнала Wnt стимулирует пролиферацию островковых -клеток.

В другом примере, WO 2007016485, утверждается, что добавление ингибиторов GSK-3 к культуре неэмбриональных стволовых клеток, включая мультипотентные клетки-предшественники взрослых особей, приводит к поддержанию плюрипотентного фенотипа в процессе размножения и позволяет получить более четко выраженный дифференцировочный отклик.

В другом примере, US 2006030042, используется способ ингибирования GSK-3 путем добавления либо Wnt, либо низкомолекулярного ингибитора активности фермента GSK-3 для поддержания эмбриональных стволовых клеток без использования слоя питающих клеток.

В другом примере, WO 2006026473, сообщается о добавлении ингибитора GSK-3B для стабилизации плюрипотентных клеток через транскрибционную активацию c-myc и стабилизации белка c-myc.

В другом примере, WO 2006100490, сообщается об использовании культуральной среды для стволовых клеток, содержащей ингибитор GSK-3 и агонист gp130, для поддержания самовозобновляющейся популяции плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки мыши или человека.

В другом примере, Sato et al. (Nature Medicine (2004) 10:55-63), показано, что ингибирование GSK-3 специфическим фармакологическим препаратом может сохранять недифференцированный фенотип эмбриональных стволовых клеток и поддерживать уровень экспрессии специфичных для плюрипотентного состояния факторов транскрипции, таких как Oct-3/4, Rex-1 и Nanog.

В другом примере, Maurer et al. (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208), показано, что обработанные ингибитором GSK-3 нервные стволовые клетки взрослой особи демонстрируют более высокую эффективность нейронального дифференцирования, в особенности путем стимулирования транскрипции целевых генов -катенина и торможения апоптоза.

В другом примере, Gregory et al. (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106), сообщается, что ингибиторы GSK-3B повышают эффективность остеогенеза in vitro.

В другом примере, Feng et al. (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339), показано, что гемопоэтическое дифференцирование эмбриональных стволовых клеток связано с понижением эффективности каскада Wnt/ -катенин, где Wnt представляет собой естественный ингибитор GSK3.

Поэтому сохраняется значительная потребность в разработке способов обработки плюрипотентных стволовых клеток для их размножения с последующим использованием в клинических целях и при этом с сохранением их способности к дифференцированию в панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки или панкреатические секретирующие гормоны клетки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток путем обработки упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

а. культивирование плюрипотентных клеток, и

b. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки человека или могут быть экспрессирующими маркеры плюрипотентности производными от эмбриональных стволовых клеток человека клетками в соответствии со способами, раскрытыми в публикации 60/913475.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 показан эффект добавления соединения JNJ 17189731 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 2 показан эффект добавления соединения JNJ 17163796 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 3 показан эффект добавления соединения JNJ 17223375 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 4 показан эффект добавления соединения JNJ 18157698 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 5 показан эффект добавления соединения JNJ 26158015 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 6 показан эффект добавления соединения JNJ 26483197 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 7 показан эффект добавления соединения JNJ 26483249 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 8 показан эффект добавления соединения JNJ 10220067 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 9 приведены уровни экспрессии CXCR4 на поверхности клеток, определенные способами иммунофлюоресцентного окрашивания и проточной цитометрии, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 10 приведены уровни экспрессии CXCR4 (часть A), HNF-3 beta (часть B) и Sox-17 (часть C), определенные методом ПЦР в реальном времени, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 11 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Pdx-1, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводились на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 12 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и HNF-6 (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 13 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 14 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и инсулина (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 15 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 11.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, приведенное ниже подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования клетки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин « -клеточная линия дифференцирования» относится к клеткам, положительным по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и как минимум одного из следующих транскрипционных факторов: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для -клеточной линии дифференцирования, включают -клетки.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включают клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэндодермы и клетки сформированной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX-1, HNF-1 beta, PTF-1 alpha, HNF-6 и HB9. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, включают клетки панкреатической эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки, включают панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки и панкреатические секретирующие гормоны клетки, а также клетки -клеточной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, церберус, OTX2, гузекоид, C-Kit, CD99 и Mixl1.

Используемый в настоящей заявке термин «внеэмбриональная эндодерма» относится к популяции клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX-7, AFP и SPARC.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка мезэндодермы» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» или «панкреатическая экспрессирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая секретирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal и FGF8

Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like или FGF4.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, заключающийся в обработке упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

c. культивирование плюрипотентных клеток, и

d. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбраны из группы, включающей следующие маркеры: SOX17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. В рамках настоящего изобретения возможно использование клеток - производных плюрипотентных клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно одного до приблизительно 72 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно 12 до приблизительно 48 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение приблизительно 48 часов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 100 нМ до приблизительно 100 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации приблизительно 10 мкМ.

Соединения, пригодные для применения в способах, составляющих предмет настоящего изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

,

где:

R₁ представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5 алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила;

R₂ представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила, который необязательно несет в качестве заместителя C_1-4алкил, и по меньшей мере один из заместителей R₁ и R₂ представляет собой пиримидинил;

R₃ представляет собой водород, 2-(триметилсилил)этоксиметил, C_1-5алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, арил-C _1-5алкилоксикарбонил, арил-C_1-5алкил, замещенный арил-C_1-5алкил, где упомянутые один или несколько заместителей для арильного фрагмента каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C_1-5алкил, C _1-5алкокси, галоген, амино, C_1-5алкиламино и ди-C_1-5алкиламино, фталимидо-C_1-5алкил, амино-C_1-5алкил, диаминоC_1-5алкил, сукцинимидо-C _1-5алкил, C_1-5алкилкарбонил, арилкарбонил, C _1-5алкилкарбонил-C_1-5алкил и арилоксикарбонил-C _1-5алкил;

R₄ представляет собой фрагмент -(A)-(CH₂)_q-X;

A представляет собой винилен, этинилен или ;

R₅ выбран из следующей группы заместителей: водорода, C_1-5алкила, фенила и фенил-C _1-5алкила;

q равен 0-9;

X выбран из следующей группы заместителей: водорода, гидрокси, винила, замещенного винила, где один или несколько заместителей для винильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, этинила, замещенного этинила, где заместители для этинильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, C_1-5алкила, замещенного C_1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкокси, тригалоалкила, фталимидо и амино, C_3-7циклоалкила, C_1-5алкокси, замещенного C_1-5алкокси, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фталимидо и амино, фталимидоокси, фенокси, замещенный фенокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, галогена и C_1-5алкокси, фенила, замещенного фенила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, галогена и C_1-5алкокси, арил-C_1-5алкила, замещенного арил-C_1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для арильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, галогена и C_1-5 алкокси, арилокси-C_1-5алкиламино, C_1-5алкиламино, ди-C_1-5алкиламино, нитрила, оксима, бензилоксиимино, C_1-5алкилоксиимино, фталимидо, сукцинимидо, C _1-5алкилкарбонилокси, фенилкарбонилокси, замещенного фенилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5 алкила, галогена и C_1-5алкокси, фенил-C_1-5 алкилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, галогена и C_1-5алкокси, аминокарбонилокси, C_1-5алкиламинокарбонилокси, ди-C_1-5алкиламинокарбонилокси, C_1-5алкоксикарбонилокси, замещенного C_1-5 алкоксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: метила, этила, изопропила и гексила, феноксикарбонилокси, замещенного феноксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C_1-5алкила, C_1-5алкокси и галогена, C _1-5алкилтио, замещенного C_1-5алкилтио, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: гидрокси и фталимидо, C_1-5алкилсульфонила, фенилсульфонила, замещенного фенилсульфонила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: брома, фтора, хлора, C_1-5алкокси и трифторметила; с тем условием, что если A представляет собой , q равен 0, и X представляет собой H, то R₃ не может представлять собой 2-(триметилсилил)этоксиметил; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R₁ представляет собой замещенный фенил и R₂ представляет собой пиримидин-3-ил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R₁ представляет собой 4-фторфенил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R₃ представляет собой водород, арил-C_1-5алкил или замещенный арил-C_1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R ₃ представляет собой водород или фенил-C_1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где A представляет собой этинилен и q равен 0-5.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где X представляет собой сукцинимидо, гидрокси, метил, фенил, C_1-5алкилсульфонил, C_3-6циклоалкил, C_1-5алкилкарбонилокси, C_1-5алкокси, фенилкарбонилокси, C_1-5алкиламино, ди-C_1-5алкиламино или нитрил.

Соединения формулы (I) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6214830, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение	Название
1	5(4)-(4-фторфенил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
2	4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
3	5-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-4-(4-пиридил)имидазол,
4	4-(4-фторфенил)-2-йод-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
5	4-(4-фторфенил)-2-(4-гидроксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
6	4-(4-фторфенил)-5-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
7	5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
8	5-(4-фторфенил)-2-йод-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
9	5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-(триметилсилил)этинил-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
10	2-(2-хлорвинил)-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)имидазол,
11	5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
12	2-[2,2-дибромэтилен-1-ил]-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
13	5(4)-(4-фторфенил)-2-(3-гидрокси-3-фенилпропин-1-ил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
14	5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-2-оксиминоимидазол,
15	5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-имидазола оксим,
16	2-(5-хлорпентин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
17	4-(4-фторфенил)-2-(4-N-фенилкарбамоилоксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
18	2-(4-хлорбутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол и
19	2-(4-диметиламинобутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение представляет собой соединение 5 формулы:

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

,

где:

R выбран из следующей группы заместителей: R_a, -C_1-8 алкил-R_a, -C_2-8алкенил-R_a, -C _2-8алкинил-R_a и циано;

R _a выбран из следующей группы заместителей: циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R¹ выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8 алкил-R⁵, -C_2-8алкенил-R⁵, -C _2-8алкинил-R⁵, -C(O)-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-O-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -C(O)-NH(C_1-8 алкил-R⁹), -C(O)-NH(арил-R⁸), -C(O)-N(C _1-8алкил-R⁹)₂, -SO₂-(C _1-8)алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸ , -циклоалкил-R⁶, -гетероциклил-R⁶, -арил-R ⁶ и -гетероарил-R⁶; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента;

R⁵ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C_1-8)алкила, -O-(C _1-8)алкил-OH, -O-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8 )алкил, -O-(C_1-8)алкил-NH₂, -O-(C_1-8 )алкил-NH(C_1-8алкил), -O-(C_1-8)алкил-N(C _1-8алкил)₂, -O-(C_1-8)алкил-S-(C _1-8)алкил, -O-(C_1-8)алкил-SO₂-(C _1-8)алкил, -O-(C_1-8)алкил-SO₂-NH ₂, -O-(C_1-8)алкил-SO₂-NH(C_1-8 алкил), -O-(C_1-8)алкил-SO₂-N(C_1-8 алкил)₂, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C_1-8)алкил, -O-C(O)-NH₂, -O-C(O)-NH(C_1-8алкил), -O-C(O)-N(C _1-8алкил)₂, -O-(C_1-8)алкил-C(O)H, -O-(C_1-8)алкил-C(O)-(C_1-8)алкил, -O-(C _1-8)алкил-CO₂H, -O-(C_1-8)алкил-C(O)-O-(C _1-8)алкил, -O-(C_1-8)алкил-C(O)-NH₂ , -O-(C_1-8)алкил-C(O)-NH(C_1-8алкил), -O-(C _1-8)алкил-C(O)-N(C_1-8алкил)₂, -C(O)H, -C(O)-(C_1-8)алкил, -CO₂H, -C(O)-O-(C _1-8)алкил, -C(O)-NH₂, -C(NH)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8алкил), -C(O)-N(C_1-8алкил) ₂, -SH, -S-(C_1-8)алкил, -S-(C_1-8)алкил-S-(C _1-8)алкил, -S-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8 )алкил, -S-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8)алкил-OH, -S-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8)алкил-NH₂ , -S-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8)алкил-NH(C _1-8алкил), -S-(C_1-8)алкил-O-(C_1-8 )алкил-N(C_1-8алкил)₂, -S-(C_1-8 )алкил-NH(C_1-8алкил), -SO₂-(C_1-8 )алкил, -SO₂-NH₂, -SO₂-NH(C _1-8алкил), -SO₂-N(C_1-8алкил) ₂, -N-R⁷, циано, (гало)_1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R⁶, -гетероциклил-R⁶ , -арил-R⁶ и -гетероарил-R⁶;

R⁶ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8алкила, -C _2-8алкенила, -C_2-8алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C _1-8)алкила, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-8)алкила, -C(O)-NH₂, -C(NH)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8 алкила), -C(O)-N(C_1-8)алкил)₂, -SO ₂-(C_1-8)алкила, -SO₂-NH₂ , -SO₂-NH(C_1-8алкила), -SO₂-N(C _1-8алкил)₂, -(C_1-8)алкил-N-R ⁷, -(C_1-8)алкил-(гало)_1-3, -(C _1-8)алкил-OH, -арил-R⁸, -(C_1-8)алкил-арил-R ⁸ и -(C_1-8)алкил-гетероарил-R⁸; с тем условием, что когда заместитель R⁶ присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R⁶ может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C_1-8 алкокси, -(C_1-8)алкокси-(гало)_1-3, -SH, -S-(C_1-8)алкила, -N-R⁷, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R⁸;

R ⁷ представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8алкила, -C_2-8алкенила, -C_2-8алкинила, -(C_1-8 )алкил-OH, -(C_1-8)алкил-O-(C_1-8)алкила, -(C_1-8)алкил-NH₂, -(C_1-8)алкил-NH(C _1-8алкил), -(C_1-8)алкил-N(C_1-8алкил) ₂, -(C_1-8)алкил-S-(C_1-8)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C_1-8)алкила, -C(O)-O-(C_1-8)алкила, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8алкил), -C(O)-N(C _1-8алкил)₂, -SO₂-(C_1-8 )алкила, -SO₂-NH₂, -SO₂-NH(C _1-8алкил), -SO₂-N(C_1-8алкил) ₂, -C(N)-NH₂, -циклоалкил-R⁸, -(C _1-8)алкил-гетероциклил-R⁸, -арил-R⁸ , -(C_1-8)алкил-арил-R⁸ и -(C_1-8 )алкил-гетероарил-R⁸;

R⁸ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8алкила, -(C _1-8)алкил-(гало)_1-3 и -(C_1-8)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R⁸ присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R⁸ может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C_1-8 алкокси, -NH₂, -NH(C_1-8алкил), -N(C _1-8алкил)₂, циано, гало, -(C_1-8)алкокси-(гало) _1-3, гидрокси и нитро;

R⁹ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8алкокси, -NH ₂, -NH(C_1-8алкил), -N(C_1-8алкил) ₂, циано, (гало)_1-3, гидрокси и нитро;

R² представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-8алкил-R⁵, -C_2-8алкенил-R⁵, -C_2-8алкинил-R ⁵, -C(O)H, -C(O)-(C_1-8)алкил-R⁹, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8алкил-R⁹ ), -C(O)-N(C_1-8алкил-R⁹)₂, -C(O)-NH(арил-R ⁸), -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R ⁸, -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸ , -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-8)алкил-R⁹ , -C(O)-O-арил-R⁸, -SO₂-(C_1-8 )алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸, -циклоалкил-R ⁶, -арил-R⁶ и -(C_1-8)алкил-N-R ⁷; с тем условием, что когда заместитель R² присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R² может также выбираться из следующей группы заместителей: -C _1-8алкокси-R⁵, -N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R⁶ и -гетероарил-R ⁶;

R³ представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C _1-8алкил-R¹⁰, -C_2-8алкенил-R ¹⁰, -C_2-8алкинил-R¹⁰, -C_1-8 алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -C(O)-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8алкил-R ⁹), -C(O)-N(C_1-8алкил-R⁹)₂ , -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R⁸ , -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸, -C(NH)-NH ₂, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -SO₂-(C_1-8 )алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸, -N-R ⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R ⁸, -гетероциклил-R⁸, -арил-R⁸ и -гетероарил-R ⁸;

R⁴ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C _1-8алкил-R¹⁰, -C_2-8алкенил-R ¹⁰, -C_2-8алкинил-R¹⁰, -C_1-8 алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -C(O)-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-8алкил-R ⁹), -C(O)-N(C_1-8алкил-R⁹)₂ , -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R⁸ , -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸, -C(NH)-NH ₂, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-8)алкил-R ⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -SH, -S-(C_1-8 )алкил-R¹⁰, -SO₂-(C_1-8)алкил-R ⁹, -SO₂-арил-R⁸, -SO₂-NH ₂, -SO₂-NH(C_1-8алкил-R⁹ ), -SO₂-N(C_1-8алкил-R⁹) ₂, -N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R⁸, -гетероциклил-R⁸, -арил-R ⁸ и -гетероарил-R⁸;

R¹⁰ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH₂, -NH(C_1-8алкил), -N(C_1-8алкил)₂ , циано, (гало)_1-3, гидрокси, нитро и оксо; и

Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); а также их фармацевтически приемлемые соли.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R выбран из следующей группы заместителей: R_a, -C_1-4 алкил-R_a, -C_2-4алкенил-R_a, -C _2-4алкинил-R_a и циано.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R_a выбран из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила и гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R_a выбран из следующей группы заместителей: дигидропиранила, фенила, нафтила, тиенила, пирролила, имидазолила, пиразолила, пиридинила, азаиндолила, индазолила, бензофурила, бензотиенила, дибензофурила и дибензотиенила.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R¹ выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4 алкил-R⁵, -C_2-4алкенил-R⁵, -C _2-4алкинил-R⁵, -C(O)-(C_1-4)алкил-R ⁹, -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-O-(C_1-4)алкил-R ⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -C(O)-NH(C_1-4 алкил-R⁹), -C(O)-NH(арил-R⁸), -C(O)-N(C _1-4алкил-R⁹)₂, -SO₂-(C _1-4)алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸ , -циклоалкил-R⁶, -гетероциклил-R⁶, -арил-R ⁶ и -гетероарил-R⁶; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R¹ выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R⁵, -арил-R⁶ и -гетероарил-R⁶; где гетероарил присоединен к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R ¹ выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C _1-4алкил-R⁵ и -нафтил-R⁶.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁵ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C_1-4)алкила, -O-(C_1-4)алкил-OH, -O-(C_1-4)алкил-O-(C_1-4)алкила, -O-(C _1-4)алкил-NH₂, -O-(C_1-4)алкил-NH(C _1-4алкил), -O-(C_1-4)алкил-N(C_1-4алкил) ₂, -O-(C_1-4)алкил-S-(C_1-4)алкил, -O-(C_1-4)алкил-SO₂-(C_1-4)алкил, -O-(C_1-4)алкил-SO₂-NH₂, -O-(C _1-4)алкил-SO₂-NH(C_1-4алкил), -O-(C _1-4)алкил-SO₂-N(C_1-4алкил)₂ , -O-C(O)H, -O-C(O)-(C_1-4)алкила, -O-C(O)-NH₂ , -O-C(O)-NH(C_1-4алкил), -O-C(O)-N(C_1-4 алкил)₂, -O-(C_1-4)алкил-C(O)H, -O-(C _1-4)алкил-C(O)-(C_1-4)алкил, -O-(C_1-4 )алкил-CO₂H, -O-(C_1-4)алкил-C(O)-O-(C _1-4)алкил, -O-(C_1-4)алкил-C(O)-NH₂ , -O-(C_1-4)алкил-C(O)-NH(C_1-4алкил), -O-(C _1-4)алкил-C(O)-N(C_1-4алкил)₂, -C(O)H, -C(O)-(C_1-4)алкила, -CO₂H, -C(O)-O-(C _1-4)алкила, -C(O)-NH₂, -C(NH)-NH₂ , -C(O)-NH(C_1-4алкил), -C(O)-N(C_1-4алкил) ₂, -SH, -S-(C_1-4)алкила, -S-(C_1-4 )алкил-S-(C_1-4)алкил, -S-(C_1-4)алкил-O-(C _1-4)алкила, -S-(C_1-4)алкил-O-(C_1-4 )алкил-OH, -S-(C_1-4)алкил-O-(C_1-4)алкил-NH ₂, -S-(C_1-4)алкил-O-(C_1-4)алкил-NH(C _1-4алкил), -S-(C_1-4)алкил-O-(C_1-4 )алкил-N(C_1-4алкил)₂, -S-(C_1-4 )алкил-NH(C_1-4алкил), -SO₂-(C_1-4 )алкил, -SO₂-NH₂, -SO₂-NH(C _1-4алкил), -SO₂-N(C_1-4алкил) ₂, -N-R⁷, циано, (гало)_1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R⁶, -гетероциклил-R⁶ , -арил-R⁶ и -гетероарил-R⁶.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R ⁵ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C _1-4)алкила, -N-R⁷, гидрокси и -гетероарил-R ⁶.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁵ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C_1-4)алкила, -N-R⁷, гидрокси, -имидазолил-R ⁶, -триазолил-R⁶ и -тетразолил-R⁶ .

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁶ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкила, -C_2-4алкенила, -C _2-4алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C_1-4)алкила, -CO ₂H, -C(O)-O-(C_1-4)алкила, -C(O)-NH₂ , -C(NH)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-4алкил), -C(O)-N(C _1-4)алкил)₂, -SO₂-(C_1-4 )алкила, -SO₂-NH₂, -SO₂-NH(C _1-4алкил), -SO₂-N(C_1-4алкил) ₂, -(C_1-4)алкил-N-R⁷, -(C_1-4 )алкил-(гало)_1-3, -(C_1-4)алкил-OH, -арил-R ⁸, -(C_1-4)алкил-арил-R⁸ и -(C _1-4)алкил-гетероарил-R⁸; с тем условием, что когда заместитель R⁶ присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R⁶ может также выбираться из следующей группы заместителей: -C_1-4алкокси, -(C _1-4)алкокси-(гало)_1-3, -SH, -S-(C_1-4 )алкила, -N-R⁷, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R⁸.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁶ представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁷ представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкила, -C _2-4алкенила, -C_2-4алкинила, -(C_1-4 )алкил-OH, -(C_1-4)алкил-O-(C_1-4)алкила, -(C_1-4)алкил-NH₂, -(C_1-4)алкил-NH(C _1-4алкил), -(C_1-4)алкил-N(C_1-4алкил) ₂, -(C_1-4)алкил-S-(C_1-4)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C_1-4)алкила, -C(O)-O-(C_1-4)алкила, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-4алкил), -C(O)-N(C _1-4алкил)₂, -SO₂-(C_1-4 )алкила, -SO₂-NH₂, -SO₂-NH(C _1-4алкил), -SO₂-N(C_1-4алкил) ₂, -C(N)-NH₂, -циклоалкил-R⁸, -(C _1-4)алкил-гетероциклил-R⁸, -арил-R⁸ , -(C_1-4)алкил-арил-R⁸ и -(C_1-4 )алкил-гетероарил-R⁸.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁷ представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкила, -C(O)H, -C(O)-(C _1-4)алкила, -C(O)-O-(C_1-4)алкила, -SO₂ -NH₂, -SO₂-NH(C_1-4алкил) и -SO ₂-N(C_1-4алкил)₂.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁸ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкила, -(C_1-4)алкил-(гало)_1-3 и -(C_1-4)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R⁸ присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R⁸ может также выбираться из следующей группы заместителей: -C_1-4алкокси, -NH₂, -NH(C_1-4 алкил), -N(C_1-4алкил)₂, циано, гало, -(C _1-4)алкокси-(гало)_1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁸ представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁹ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкокси, -NH₂, -NH(C_1-4 алкил), -N(C_1-4алкил)₂, циано, (гало) _1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁹ представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R² представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R⁵, -C_2-4 алкенил-R⁵, -C_2-4алкинил-R⁵, -C(O)H, -C(O)-(C_1-4)алкил-R⁹, -C(O)-NH ₂, -C(O)-NH(C_1-4алкил-R⁹), -C(O)-N(C _1-4алкил-R⁹)₂, -C(O)-NH(арил-R ⁸), -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R ⁸, -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸ , -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-4)алкил-R⁹ , -C(O)-O-арил-R⁸, -SO₂-(C_1-4 )алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸, -циклоалкил-R ⁶, -арил-R⁶ и -(C_1-4)алкил-N-R ⁷; с тем условием, что когда заместитель R² присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R² может также выбираться из следующей группы заместителей: -C _1-4алкокси-R⁵, -N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R⁶ и -гетероарил-R ⁶.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R² представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R ⁵, -C_2-4алкенил-R⁵, -C_2-4 алкинил-R⁵, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-4 )алкил-R⁹, -циклоалкил-R⁶, -арил-R ⁶ и -(C_1-4)алкил-N-R⁷; с тем условием, что когда заместитель R² присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R² присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R² может также выбираться из следующей группы заместителей: -C_1-4алкокси-R ⁵, -N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R⁶ и -гетероарил-R⁶ .

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R² представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R ⁵ и -арил-R⁶; с тем условием, что когда заместитель R² присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R ² присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R² может также выбираться из следующей группы заместителей: -N-R⁷, галогена, гидрокси и -гетероарил-R⁶ .

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R³ представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R¹⁰, -C_2-4алкенил-R ¹⁰, -C_2-4алкинил-R¹⁰, -C_1-4 алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -C(O)-(C_1-4)алкил-R ⁹, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C_1-4алкил-R ⁹), -C(O)-N(C_1-4алкил-R⁹)₂ , -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R⁸ , -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸, -C(NH)-NH ₂, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-4)алкил-R ⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -SO₂-(C_1-8 )алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸, -N-R ⁷, -(C_1-4)алкил-N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R⁸, -гетероциклил-R ⁸, -арил-R⁸ и -гетероарил-R⁸.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R³ представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R¹⁰, -C_2-4 алкенил-R¹⁰, -C_2-4алкинил-R¹⁰ , -C_1-4алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -CO₂ H, -NH₂, -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4 алкил)₂, циано, галогена, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R ³ представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R¹⁰, -NH₂ , -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4алкил)₂ , галогена и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R⁴ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R¹⁰, -C_2-4 алкенил-R¹⁰, -C_2-4алкинил-R¹⁰ , -C_1-4алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -C(O)-(C _1-4)алкил-R⁹, -C(O)-NH₂, -C(O)-NH(C _1-4алкил-R⁹), -C(O)-N(C_1-4алкил-R ⁹)₂, -C(O)-циклоалкил-R⁸, -C(O)-гетероциклил-R ⁸, -C(O)-арил-R⁸, -C(O)-гетероарил-R⁸ , -C(NH)-NH₂, -CO₂H, -C(O)-O-(C_1-4 )алкил-R⁹, -C(O)-O-арил-R⁸, -SH, -S-(C _1-4)алкил-R¹⁰, -SO₂-(C_1-4 )алкил-R⁹, -SO₂-арил-R⁸, -SO ₂-NH₂, -SO₂-NH(C_1-4алкил-R ⁹), -SO₂-N(C_1-4алкил-R⁹ )₂, -N-R⁷, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R⁸, -гетероциклил-R⁸, -арил-R ⁸ и -гетероарил-R⁸.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁴ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C_1-4алкил-R¹⁰, -C_2-4 алкенил-R¹⁰, -C_2-4алкинил-R¹⁰ , -C_1-4алкокси-R¹⁰, -C(O)H, -CO₂ H, -NH₂, -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4 алкил)₂, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкила, -гетероциклила, -арила и -гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R⁴ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C_1-4алкил-R¹⁰, C_1-4 алкокси-R¹⁰, -NH₂, -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4алкил)₂, галогена и гидрокси.

В одном из вариантов осуществлении настоящего изобретения R⁴ представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C_1-4алкил-R¹⁰, C_1-4 алкокси-R¹⁰, -NH₂, -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4алкил)₂, хлора, фтора и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R¹⁰ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH₂, -NH(C_1-4алкил), -N(C_1-4алкил)₂, циано, (гало)_1-3 , гидрокси, нитро и оксо.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R¹⁰ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (гало)_1-3.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R ¹⁰ представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (фтор) ₃.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z каждый независимо выбран из группы O и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z представляют собой атомы O.

Соединения формулы (II) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 7125878, полное раскрытие которого включено в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение	Название
1	3-(2-хлорфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
2	3-(2-хлорфенил)-4-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
3	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
4	3-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
5	3-(5-хлорбензо[ b]тиен-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
6	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(1H-индазол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
7	3-(1-этил-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
8	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
9	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(3-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
10	3-(2-хлор-4-фторфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
11	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-[2-(трифторметил)фенил]-1 H-пиррол-2,5-дион,
12	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(2-пиридинил)-1H-пиррол-2,5-дион,
13	3-[3-хлор-5-(трифторметил)-2-пиридинил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
14	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-тиенил)-1H -пиррол-2,5-дион,
15	3-(2,5-дихлор-3-тиенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
16	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пиразол-3-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
17	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1H-имидазол-2-ил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
18	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
19	3-[1-(2-гидроксиэтил)-1 H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
20	3-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1 H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
21	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
22	3-[( E)-2-(4-фторфенил)этенил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H -пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
23	3-(3,4-дигидро-2 H-пиран-6-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
24	4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-[3,3'-би-1H-пиррол]-2,5-дион,
25	3-(2-бензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
26	3-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H -пиразол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
27	2,5-дигидро-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-2,5-диоксо-1H -пиррол-3-карбонитрил,
28	3-дибензо[b,d]тиен-4-ил-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
29	3-(4-дибензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
30	3-(2-гидроксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
31	3-(3,4-диметоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
32	3-(3,4-дигидроксифенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
33	3-(2-метоксифенил)-4-[1-(2-нафталенил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
34	[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1 H-пиррол-3-ил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]-карбаминовой кислоты 2-метилпропиловый эфир,
35	3-[1-(3-аминопропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
36	N -[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]ацетамид,
37	N -[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]сульфамид,
38	3-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(1 H-тетразол-1-ил)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1 H-пиррол-2,5-дион,
39	3-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(2H-тетразол-2-ил)пропил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
40	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-пиразин-2-ил-пиррол-2,5-дион,
41	3-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
42	4-{3-[4-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил,
43	4-{3-[4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил и
44	3-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-(1-фенэтил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)пиррол-2,5-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

,

где

фрагменты A и E каждый независимо выбран из фрагмента CH и атома азота; где выбран из следующей группы: 1H-индола, 1H- пирроло[2,3-b]пиридина, 1H-пиразоло[3,4-b ]пиридина и 1H-индазола;

Z представляет собой атом O; в качестве альтернативы Z представляет собой два атома водорода, где каждый атом водорода присоединен через одинарную связь;

R₄ и R₅ каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_2-8алкенила и C_2-8алкинила, необязательно несущие в качестве заместителей оксогруппы;

R ₂ выбран из следующей группы заместителей: -C_1-8 алкил-, -C_2-8алкенил-, -C_2-8алкинил-, -O-(C _1-8)алкил-O-, -O-(C_2-8)алкенил-O-, -O-(C _2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C_1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп представляет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси(C_1-8 )алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, -C(O)O-(C _1-8)алкила, -C_1-8алкил-C(O)O-(C_1-8 )алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкил), галогена, (гало)_1-3(C _1-8)алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C_1-8)алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C_1-8)алкила, арил-(C _1-8)алкила, гетероарил-(C_1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C _1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C_1-8)алкила, (гало)_1-3 (C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8 )алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила (где циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C _1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C _1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C _1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C _1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C_1-8 )алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы), -(O-(CH₂ )_1-6)_0-5-O-, -O-(CH₂)_1-6 -O-(CH₂)_1-6-O-, -O-(CH₂) _1-6-O-(CH₂)_1-6-O-(CH₂) _1-6-O-, -(O-(CH₂)_1-6)_0-5 -NR₆-, -O-(CH₂)_1-6-NR₆ -(CH₂)_1-6-O-, -O-(CH₂)_1-6 -O-(CH₂)_1-6-NR₆-, -(O-(CH ₂)_1-6)_0-5-S-, -O-(CH₂) _1-6-S-(CH₂)_1-6-O-, -O-(CH₂ )_1-6-O-(CH₂)_1-6-S-, -NR ₆-, -NR₆-NR₇-, -NR₆-(CH ₂)_1-6-NR₇-, -NR₆-(CH ₂)_1-6-NR₇-(CH₂)_1-6 -NR₈-, -NR₆-C(O)-, -C(O)-NR₆ -, -C(O)-(CH₂)_0-6-NR₆-(CH ₂)_0-6-C(O)-, -NR₆-(CH₂ )_0-6-C(O)-(CH₂)_1-6-C(O)-(CH ₂)_0-6-NR₇-, -NR₆-C(O)-NR ₇-, -NR₆-C(NR₇)-NR₈-, -O-(CH₂)_1-6-NR₆-(CH₂ )_1-6-S-, -S-(CH₂)_1-6-NR ₆-(CH₂)_1-6-O-, -S-(CH₂ )_1-6-NR₆-(CH₂)_1-6 -S-, -NR₆-(CH₂)_1-6-S-(CH ₂)_1-6-NR₇- и -SO₂- (где R₆, R₇ и R₈ независимо выбираются из следующей группы заместителей: водорода, C_1-8алкила, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксил-(C _1-8)алкила, амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), гидрокси-(C_1-8)алкила, гетероциклил-(C_1-8)алкила, арил-(C_1-8)алкила и гетероарил-(C_1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C _1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C _1-8)алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); с тем условием, что если в качестве A и E выбраны фрагменты CH, то заместитель R₂ выбран из следующей группы заместителей: -C_2-8алкинил-, -O-(C_1-8)алкил-O-, -O-(C _2-8)алкенил-O-, -O-(C_2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C _1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп предсталяет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C _1-8)алкила, -C(O)O-(C_1-8)алкила, -C_1-8 алкил-C(O)O-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C_1-8)алкила, (гало)_1-3 (C_1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C_1-8 )алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C _1-8)алкила, арил-(C_1-8)алкила, гетероарил-(C _1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C _1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C _1-8)алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8)алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкил (где циклоалкил необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C _1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C_1-8)алкила, (гало)_1-3 (C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8 )алкила), -(O-(CH₂)_1-6)_1-5-O-, -O-(CH₂)_1-6-O-(CH₂)_1-6 -O-, -O-(CH₂)_1-6-O-(CH₂) _1-6-O-(CH₂)_1-6-O-, -(O-(CH₂ )_1-6)_1-5-NR₆-, -O-(CH₂ )_1-6-NR₆-(CH₂)_1-6 -O-, -O-(CH₂)_1-6-O-(CH₂) _1-6-NR₆-, -(O-(CH₂)_1-6 )_0-5-S-, -O-(CH₂)_1-6-S-(CH ₂)_1-6-O-, -O-(CH₂)_1-6-O-(CH ₂)_1-6-S-, -NR₆-NR₇-, -NR ₆-(CH₂)_1-6-NR₇-, -NR ₆-(CH₂)_1-6-NR₇-(CH ₂)_1-6-NR₈-, -NR₉-C(O)-, -C(O)-NR₉-, -C(O)-(CH₂)_0-6-NR ₆-(CH₂)_0-6-C(O)-, -NR₆ -(CH₂)_0-6-C(O)-(CH₂)_1-6 -C(O)-(CH₂)_0-6-NR₇-, -NR ₆-C(O)-NR₇-, -NR₆-C(NR₇ )-NR₈-, -O-(CH₂)_1-6-NR₆ -(CH₂)_1-6-S-, -S-(CH₂)_1-6 -NR₆-(CH₂)_1-6-O-, -S-(CH ₂)_1-6-NR₆-(CH₂)_1-6 -S- и -NR₆-(CH₂)_1-6-S-(CH ₂)_1-6-NR₇- (где R₆, R ₇ и R₈ каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C_1-8алкила, C_1-8 алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), гидрокси-(C_1-8)алкила, гетероциклил-(C _1-8)алкила, арил-(C_1-8)алкила и гетероарил-(C _1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C _1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C _1-8)алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно дополнительно несет в качестве заместителей оксогруппы); и где R₉ выбран из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси-(C_1-8 )алкила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино-(C_1-8 )алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), гидрокси-(C_1-8)алкила, гетероциклил-(C_1-8 )алкила, арил-(C_1-8)алкила и гетероарил-(C_1-8 )алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C _1-8алкила, C_1-8алкокси, C_1-8алкокси-(C _1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C_1-4алкила, амино-(C_1-8 )алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C_1-8)алкила, (гало) _1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C _1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); и,

R₁ и R₃ каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C_1-8алкила, C_2-8алкенила, C _2-8алкинила (где алкил, алкенил и алкинил необязательно несут заместитель, выбранный из следующей группы заместителей: C_1-8алкокси, алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C_1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), (гало) _1-3, (гало)_1-3(C_1-8)алкила, (гало) _1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C _1-8)алкила и оксо), C_1-8алкокси, C_1-8 алкоксикарбонила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, C_1-8алкилтио, арила, гетероарила (где арил и гетероарил необязательно несут заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C_1-8алкила, C_1-8алкокси, алкокси-(C_1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C _1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), амино-(C_1-8)алкил (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), галогена, (гало)_1-3(C _1-8)алкила, (гало)_1-3(C_1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C_1-8)алкила), амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C_1-4алкила), циано, галогена, гидрокси и нитро; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбираемое из следующей группы соединений:

,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбранное из следующей группы соединений:

,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Соединения формулы (III) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6828327, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение	Название
1	6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23 H-5,26:17,22-диметено-5H-дипиридо[2,3-k:3',2'- q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
2	10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1 H-дипиридо[2,3-n:3',2'-t]пирроло[3,4- q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2H )-дион,
3	10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1 H-дипиридо[2,3-q:3',2'-w]пирроло[3,4- t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2 H)-дион,
4	6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-дибензо[h,n]пирроло[3,4-k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21 H)-дион,
5	6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
6	10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1 H-дибензо[n,t]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2 H)-дион,
7	10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1 H-дибензо[q,w]пирроло[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2 H)-дион,
8	12-гидро-6H,19H-5,22:13,18:7,11-триметенопиридо[2,3- j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20 H)-дион,
9	12-гидро-6H,19H-5,22:13,18-диметено-7,11-нитрилопиридо[2,3- j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20 H)-дион,
10	6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-пиридо[2,3-k]пирроло[3,4-n][4,7,1,10]бензодиоксадиазациклооктадецин-20,22(21 H)-дион,
11	6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-пиридо[2,3-n]пирроло[3,4-q][4,7,10,1,13]бензотриоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
12	11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
13	6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23 H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k ,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
14	6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(1-метилэтил)-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
15	7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-8,11,14-триметил-6 H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[n,t ]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13]пентаазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
16	6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23H-5,26-метено-17,22-нитрило-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
17	11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23 H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[ k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
18	11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4- n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H )-дион,
19	6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4- n][1,7,4,10,19]диоксатиадиазациклогенейкозан-23,25(24H )-дион,
20	7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-(6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3- n:3',2'-t]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
21	11-этил-7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-6H,23H -5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3-n:3',2'-t ]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
22	6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22H-5,25:16,21-диметено-5 H-дипиридо[2,3-m:3',2'-s]пирроло[3,4- p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23H)-дион,
23	10-этил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22 H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3-m:3',2'- s]пирроло[3,4-p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23 H)-дион,
24	7,8,9,15,16,17,18-гептагидро-6H,25H-5,28:19,24-диметено-10,14-нитрилодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклотрикозан-25,27(26 H)-дион,
25	7,8,9,10,11,13,14,15,16-нонагидро-6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклогенейкозан-12,23,25(24 H)-трион,
26	7,8,9,11,12,13,14-гептагидро-6H,21H-5,24:15,20-диметенодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклононадецин-10,21,23(22 H)-трион,
27	6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-7,14-дигидрокси-(7R ,14R)-22H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклоэйкозан-22,24(23 H)-дион,
28	6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-дипиридо[2,3-h:3',2'-n]пирроло[3,4- k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
29	6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-метоксиэтил)-23 H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[ k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
30	6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-гидроксиэтил)-23H -5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k, q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион и
31	6,7,9,10,12,13,14,15,16,17-декагидро-14-метил-24H-5,27:18,23-диметено-5 H-дибензо[l,r]пирроло[3,4-o][1,4,7,11,20]диоксатриазациклодокозан-24,26(25 H)-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

Соединение	Название
1a	Будет представлено позднее
2a	3-[1-[3-[(2-гидроксиэтил)метиламино]пропил]-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(3-пиридинил)-1H-индол-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
3a	3,5-дихлор-N-[3-хлор-4-[(3,4,12,12a-тетрагидро-1H-[1,4]тиазино[3,4-c][1,4]бензодиазепин-11(6H)-ил)карбонил]фенил]-бензамид,
4a	3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
5a	3-(2-метоксифенил)-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
6a	6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]-3-пиридинкарбонитрил,
7a	3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-имидазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
8a	3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
9a	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
10a	Будет представлено позднее
11a	3-[1-(3-гидрокси-3-метилбутил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
12a	3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
13a	3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
14a	(11Z)-8,9,10,13,14,15-гексагидро-2,6:17,21-ди(метено)пирроло[3,4-h][1,15,7]диоксазациклотрикозан-22,24(1H,23H)-дион,
15a	3-(5-хлор-1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
16a	3-(2-метоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1H-пирроло[3,2-c]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
17a	3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(тетрагидропиран-4-ил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
18a	2-{3-[4-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]-индазол-1-ил}-N-(2-гидроксиэтил)-ацетамид,
19a	4-(3-хлорфенил)-6-(3-диметиламинопропил)-5,6-дигидро-4H-2,4,6-триазациклопента[c]фтор-1,3-дион,
20a	14-этил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
21a	14-бензил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
22a	3-(1-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)-этокси]-этил}-1H-индол-3-ил)-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
23a	6,7,8,9,10,11,12,13-октагидро-8,11-диметил-5,23:14,19-диметено-20H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10]тетраазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
24a	7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-декагидро-8,17-диметил-15H,26H-5,29:20,25-диметено-6H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19,22]диоксатетраазациклотетракозан-26,28(27H)-дион,
25a	14-(2-фурилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
26a	14-(2-тиенилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
27a	14-(1-нафтилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
28a	14-(пиридин-4-илметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
29a	3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этокси]-этокси}-этил)-1H-индол-3-ил]-4-{1-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этил]-1H-индол-3-ил}-пиррол-2,5-дион,
30a	3-[1-(3-диметиламинофенил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
31a	3-[5-хлор-1-(6-диметиламинопиридин-3-ил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион и
32a	5-(5-хлор-3-{4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил}-индол-1-ил)-никотиновой кислоты метиловый эфир.

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

Клетки, пригодные для обработки, согласно способам, составляющим предмет настоящего изобретения

Плюрипотентные клетки, пригодные для использования в целях настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки. В альтернативном варианте осуществления упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, являющиеся производными от эмбриональных стволовых клеток человека. В одном из вариантов осуществления упомянутые эмбриональные стволовые клетки представляют собой клетки человека.

Выделение, размножение и культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Характеристика эмбриональных стволовых клеток человека: Эмбриональные стволовые клетки человека могут экспрессировать один или несколько стадий-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также обнаруживаемые антителами маркеры, обозначаемые как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (при ее наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. Недифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека, как правило, обладают щелочно-фосфатазной активностью, которую можно обнаружить путем фиксирования клеток 4% раствором параформальдегида с последующим проявлением с использованием красителя Vector Red в качестве субстрата, следуя рекомендациям производителя (Vector Laboratories, Бурлингем, Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые методом ОТ-ПЦР.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных эмбриональных стволовых клеток человека является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток человека может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для поиска клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциируемых с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии эмбриональных стволовых клеток человека могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получать клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники эмбриональных стволовых клеток человека: К типам эмбриональных стволовых клеток человека, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими настоящее изобретение примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые непосредственно из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивируемых в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовятся, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (U.S. Pat. № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека: В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эмбриональные стволовые клетки человека культивируют в культуральной системе, существенно свободной от питающих клеток, но, тем не менее, способной поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования. Рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

В альтернативном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека исходно культивируются на слое питающих клеток, который поддерживает эмбриональные стволовые клетки человека в различных отношениях. Затем эмбриональные стволовые клетки человека переносятся в культуральную систему, существенно свободную от питающих клеток, но тем не менее способную поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования.

Примеры соответствующей целям настоящего изобретения кондиционированной среды раскрыты в следующих публикациях: US 20020072117, US 6642048, WO 2005014799 и Xu et al. (Stem Cells 22:972-980, 2004).

Пример соответствующей целям настоящего изобретения среды с химически определенным составом можно найти в US 20070010011.

Соответствующая целям настоящего изобретения культуральная среда может быть приготовлена из следующих компонентов, таких как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092; модифицированная по способу Дульбекко нокаут-среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018; основная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; -меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека высевают на соответствующий культуральный субстрат, предварительно обработанный перед проведением обработки в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления упомянутая предварительная обработка состоит в нанесении компонента внеклеточного матрикса, такого как, например, полученного из базальной мембраны компонента или компонента, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления упомянутый соответствующий культуральный субстрат представляет собой субстрат, обработанный препаратом MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Engelbreth-Holm-Swarm, который при комнатной температуре превращается в гель, образуя восстановленную базальную мембрану.

В качестве альтернативы в этих целях могут использоваться и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. Последние могут включать ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.д. как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

Эмбриональные стволовые клетки человека высевают на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Выделение, размножение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека,

b. дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы, и

c. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека, и

b. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Культивирование клеток в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 1 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 5 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение приблизительно 15 дней.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 1% O₂ до приблизительно 20% O₂. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 2% O₂ до приблизительно 10% O₂. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода приблизительно 3% O₂.

Клетки могут быть культивированы в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку, Activin A и лиганд Wnt. В качестве альтернативы упомянутая среда может также содержать IGF-1.

Концентрация сыворотки в упомянутой культуральной среде может находиться в диапазоне от приблизительно 2% до приблизительно 5%. В альтернативном варианте осуществления концентрация сыворотки может составлять приблизительно 2%.

Activin A может использоваться в концентрации от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. В альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 1 мкг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять приблизительно 100 нг/мл.

Упомянутый лиганд Wnt может выбираться из следующей группы лигандов: Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-7a. В одном из вариантов осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-1. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-3a.

Упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация лиганда Wnt составляет приблизительно 20 нг/мл.

IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация IGF-1 составляет приблизительно 50 нг/мл.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, способны к размножению при культивировании в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы маркеров: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример описанного способа раскрыт в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 24:1392-1401, (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбираются из группы, включающей Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 и PROX1. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбираются из группы, включающей NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. В одном из вариантов осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать как минимум один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую экспрессирующую гормоны клетку. В качестве альтернативы панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую секретирующую гормоны клетку.

В одном из аспектов настоящего изобретения упомянутая панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для -клеточной линии дифференцирования. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для -клеточной линии дифференцирования, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для -клеточной линии дифференцирования, представляет собой -клетку.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, может быть обнаружено путем проверки на наличие соответствующих маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Например, характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих факторов: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.

После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной области, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, характерным для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. К маркерам, характерным для линии панкреатических эндокринных клеток, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN-3, NeuroD, Islet-1.

Маркеры, характерные для клеток -клеточной линии дифференцирования, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для -клеточной линии дифференцирования. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные -клеточной линии дифференцирования. К специфичным характеристикам -клеточной линии дифференцирования относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Pdx1 (ген панкреатического и дуоденального гомеобокса-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3beta и MafA, а также иных факторов. Такие факторы транскрипции широко используются в данной области для идентификации эндокринных клеток. См., например, обзор Edlund (Nature Reviews Genetics 3:524-632 (2002)).

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В качестве альтернативы эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для -клеточной линии дифференцирования.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение далее иллюстрируют, помимо прочих, следующие примеры.

Пример 1

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 были получены из института WiCell Research Institute, Inc., (Мэдисон, Висконсин, США) и культивировались в соответствии с инструкциями, предоставленными указанным выше институтом. Коротко говоря, клетки культивировали на питающем слое из мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в среде для эмбриональных стволовых клеток, содержащей DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) с добавлением 20% нокаут заменителя сыворотки, 100 нМ раствора заменимых аминокислот MEM, 0,5 мМ бетамеркаптоэтанола, 2мМ L-глутамина и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (bFGF) (все производства компании Invitrogen/GIBCO). Мышиные эмбриональные фибробласты, выделенные из мышиных эмбрионов E13-13,5, были приобретены в Charles River. Мышиные эмбриональные фибробласты размножали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Hyclone), 2 мМ глутамина и 100 мМ заменимых аминокислот MEM. Субконфлюэнтные культуры мышиных эмбриональных фибробластов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина C (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 3 часов для остановки деления клеток, затем обработали трипсином и высеяли с плотностью 2×10⁴/см ² на чашки, покрытые слоем 0,1% бычьего желатина. В качестве питающего слоя использовали мышиные эмбриональные фибробласты со второго по четвертый пассажи. Эмбриональные стволовые клетки человека, высеянные на питающий слой мышиных эмбриональных фибробластов, культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO ₂/ в инкубаторе с увлажнением для тканевых культур. При начале слияния культур (приблизительно через 5-7 дней после нанесения) эмбриональные стволовые клетки человека обработали раствором коллагеназы типа IV с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen/GIBCO) в течение 5-10 мин и затем осторожно соскоблили с поверхности при помощи 5-мл пипетки. Клетки осадили центрифугированием при 900 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировали и снова высеяли с соотношением клеток от 1:3 до 1:4 в свежую культуральную среду.

Параллельно эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 также высеяли на носителе, покрытом слоем препарата MATRIGEL с пониженным содержанием факторов роста (BD Biosciences), в разведении 1:30 и культивировали в кондиционируемой среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Культивированные на препарате MATRIGEL клетки стандартно пассировали с использованием коллагеназы IV (Invitrogen/GIBCO), диспазы (BD Biosciences) или ферментативной смеси LIBERASE (Source). Некоторые культуры эмбриональных стволовых клеток человека инкубировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O₂).

Пример 2

Получение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Клетки линий H1 и H9 эмбриональных стволовых клеток человека различных пассажей (пассажи 30-54) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O₂) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1.

Затем клетки обрабатывали средой DMEM/F12 с добавлением 0,5% FBS, 20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота, США) и 100 нг/мл Activin A (R&D Systems, Миннесота, США) в течение двух дней с последующей обработкой средой DMEM/F12 с добавлением 2% FBS и 100 нг/мл Activin A (AA) в течение еще 3-4 дней. Описанный протокол привел с существенному повышению уровней экспрессии маркеров сформированной эндодермы.

Затем клетки обработали раствором TrypLE Express (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см² в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A в условиях гипоксии (приблизительно 3% O₂) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Для некоторых культур в среду также добавили 10-50 нг/мл IGF-I (инсулиновый фактор роста-I, R&D Systems, Миннесота, США) или 1X ITS (инсулин, трансферрин и селен, Invitrogen, Калифорния, США). Для некоторых культур в основную среду (DM-F12+2% FBS) также добавили 0,1 мМ меркаптоэтанола (Invitrogen, Калифорния, США) и раствор заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США).

Через 5-15 дней культивирования на носителях образовались хорошо определенные колонии клеток, окруженные большим количеством клеток увеличенного размера, которые находились в фазе старения. При степени слияния 50-60% полученные культуры пассировали путем обработки раствором TrypLE Express в течение 5 минут при комнатной температуре. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM-F12+2% FBS, восстановили центрифугированием, высеяли с плотностью 10000 клеток/см ² в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+/-50 нг/мл IGF-I. Указанная среда будет далее именоваться «ростовая среда».

Пример 3

Получение экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных из одноклеточной суспензии эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Эмбриональные стволовые клетки человека линий H1 (P33) и H9 (P45) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O₂) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1. При степени слияния приблизительно 60% полученные культуры обрабатывали раствором TrypLE Express (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см² в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I+0,1 мМ меркаптоэтанол (Invitrogen, Калифорния, США) и растворе заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США) в условиях гипоксии (приблизительно 3% O₂) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Клетки первого пассажа обозначаются P1.

Пример 4

Различные ростовые среды, пригодные для размножения экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности производные от эмбриональных стволовых клеток человека клетки успешно культивировали в средах перечисленного ниже состава в течение по меньшей мере 2-30 пассажей:

1. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A

2. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

3. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

4. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

5. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

6. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

7. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

8. Среда определенного состава HEScGRO (Chemicon, Калифорния, США)

Основной компонент перечисленных выше сред может быть заменен на другие подобные среды, такие как RPMI, DMEM, CRML, Knockout DMEM и F12.

Пример 4

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3 на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток

Получение и поддержание экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток проводили, как описано в примере 2. Клетки выращивали в среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (Invitrogen), 100 нг/мл Activin A, 20 нг/мл Wnt-3a и 50 нг/мл IGF(R&D Biosystems). Клетки высеяли с плотностью 10000 клеток/см² в полистирольные флаконы типа Falcon и выращивали в монослойной культуре при температуре 37°C, в атмосфере 5% CO₂ и пониженной концентрации кислорода. При достижении степени слияния 60-70% полученные клетки пассировали путем промывания монослоя раствором PBS и инкубирования с раствором TrypLE (Invitrogen) в течение 3-5 минут для открепления клеток и получения одноклеточной суспензии.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрации 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Для проведения анализа экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки промыли, подсчитали и высеяли в нормальной культуральной среде с плотностью 20000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, состоящие из непрозрачных лунок с прозрачным дном (Costar). Предварительные эксперименты показали, что указанная плотность посева дает оптимальное образование монослоя при культивировании в течение одной ночи. На следующий день культуральную среду удалили, монослои клеток трижды промыли раствором PBS и в лунки добавили 80 мкл аликвоты испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа до конечной концентрации 10 мкМ. На 2 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на свежую аликвоту испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа. Среда для проведения анализа на 1 и 2 день культивирования состояла из среды DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A. На 3 и 4 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемых соединений). На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15 мкл MTS (Promega), планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов, и затем измерили оптические плотности лунок на длине волны 490 нм с помощью анализатора SpectraMax (Molecular Devices). Для каждого дублирующего набора рассчитали статистические характеристики: среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Для каждой лунки с испытываемым образцом также рассчитали токсичность относительно положительного контрольного образца (лунки, обработанные Activin A и Wnt3a на 1 и 2 день культивирования).

Сводка всех результатов скрининга приведена в таблице II. В данном анализе экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки изначально высеяли в виде слитного монослоя, поэтому полученные результаты адекватно отражают степень токсичности за четырехдневный период культивирования. Полученные результаты представлены в виде процентной доли выживаемости клеток по отношению к контрольному образцу и демонстрируют различную токсичность некоторых соединений при использованных для скрининга концентрациях 10 мкМ. Большинство испытанных соединений показали минимальную токсичность или оказались нетоксичны в проведенном клеточном анализе.

Небольшой набор выбранных соединений повторно проверили в узком диапазоне дозировок с использованием экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток в анализе, аналогичном описанному выше. В таблице III приведены полученные в этом анализе результаты, свидетельствующие о наличии эффекта варьирования дозировки для испытанного набора токсичных и нетоксичных соединений.

Пример 5

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3 на дифференцирование и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью одновременного многопараметрического анализа

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линия H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в увлажняемом боксе.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрацией 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Испытание соединений проводили в двух или трех повторностях. Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems), плюс 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS и только Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a (без обработки). На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемого соединения или Wnt3a); лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 2% FCS, без Activin A (без обработки).

По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы клетки зафиксировали ледяным 70% спиртом в течение ночи при температуре -20°C, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали раствором 0,5% Triton X-100 в течение 5 минут при температуре 4°C. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17 и козий античеловеческий HNF-3beta; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 5 мМ Draq5 (Alexis Biochemicals) на пять минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Draq5 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок с вторичными антителами только для необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по двенадцать проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность клеток для Sox-17 и HNF-3beta измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для повторностей рассчитали средние значения и их стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и их стандартных отклонений.

В таблице IV приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице V приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик. Параллельно в данном анализе значительное число соединений индуцировали дифференцирование, измеряемое по уровню экспрессии белков факторов транскрипции Sox17 и Hnf-3b.

Пример 6

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3 на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью спектрофотометра вертикального сканирования

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линии H9 или H1) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 площади монослоя для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в этих примерах линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в увлажняемом боксе.

Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems) и 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a. Скрининг соединений проводили в трех повторностях. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, за исключением лунок с отрицательными контрольными образцами, которые поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15-20 мкл MTS (Promega) и инкубировали планшеты при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов. Оптические плотности лунок на длине волны 490 нм измерили с помощью спектрофотометра вертикального сканирования Molecular Devices. Для каждого дублирующего набора рассчитали среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Результаты для каждой лунки с испытываемым образцом сравнили с результатом для положительного контрольного образца Activin A/Wnt3a и рассчитали степень пролиферации как процентную величину по отношению к контрольному образцу.

В таблице VI приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице VII приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик.

Пример 7

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3 на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека: титрование дозы эффективных соединений

Было важно подтвердить активность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, и далее титрованием дозы проанализировать диапазон активности. Свежие образцы выбранного подмножества соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, получили в виде сухих порошков, растворили для получения свежих маточных растворов и разбавили для проведения вторичных подтверждающих анализов по оценке их воздействия на эмбриональные стволовые клетки человека.

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека двух линий (H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии на покрытых препаратом Matrigel ^TM (Invitrogen) полистирольных носителях, используя для покрытия поверхности разведение 1:30 препарата Matrigel^TM в среде DMEM:F12. Клетки разделили ферментативным пассированием со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании монослой клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-60 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линий H1 или H9 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом Matrigel ^TM 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO ₂ в увлажняемом боксе.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных подтверждающих анализов использовали подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Двадцать соединений, доступных в виде сухих порошков, растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили 1:1000 до получения 10 мкМ раствора испытываемого соединения в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems). Полученные растворы далее последовательно разбавили вдвое, получив для каждого соединения кривые разбавления из семи точек, также используя для разбавления основную среду DMEM:F12 с 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A.

Вторичный скрининговый анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 100 мкл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами, в качестве необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Sox-17 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значение и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Sox17 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Приведены результаты для восьми ингибиторов фермента GSK-3B, где титрованием в описанном вторичном анализе была подтверждена активность ингибитора и определена его эффективность. Приведенные данные демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток и интенсивность Sox17, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии Sox17 является индикатором дифференцирования в линию сформированной эндодермы. Результаты по количеству клеток и интенсивности Sox17, полученные для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, приведены в таблицах VIII и IX, соответственно. Результаты для линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека приведены в таблицах X и XI. Величины для положительных контрольных образцов нормированы на 1,000 для численности клеток и интенсивности Sox17. Величины для отрицательных контрольных образцов составили менее чем 0,388 для численности клеток и менее чем 0,065 для интенсивности Sox17 для обеих клеточных линий. Графическое изображение полученных данных, со сравнением двух линий эмбриональных стволовых клеток человека и включением титрования дозы для каждого соединения, приведено на фиг. 1-8. Численность клеток представлена в части A; интенсивность Sox17 представлена в части B каждого рисунка. Приведенные данные подтверждают, что каждое соединение может стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека и их дифференцирование в клетки линии сформированной эндодермы, и указывают оптимальные диапазоны активности.

Пример 8

Эффект ингибиторов фермента GSK-3 на уровни экспрессии дополнительных маркеров, ассоциируемых с линией дифференцирования сформированной эндодермы

Было важно показать способность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, в дополнение к фактору транскрипции Sox17 индуцировать также другие маркеры, характерные для дифференцирования по линии сформированной эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию CXCR4, белка поверхностного рецептора и HNF-3 beta, фактора транскрипции, который также ассоциирован с дифференцированием по линии сформированной эндодермы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL^TM (в разбавлении 1:30) 6-луночные планшеты (Corning) в объемах 2 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из семи соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5мкМ в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems).

Анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 2 мл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов с 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду, и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования монослои клеток промыли раствором PBS и собрали с культуральных планшетов путем инкубации с раствором TrypLE Express (Invitrogen) в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в кондиционированной среде MEF и разделили на пары равных образцов. Один набор образцов далее окрасили с помощью меченных различными флюоресцентными метками антител и анализировали способом проточной цитометрии (FACS). Второй параллельный набор образцов анализировали способом количественного ПЦР.

Клетки для цитометрического анализа промыли в растворе PBS и в течение 15 минут блокировали при температуре 4°C в 0, 125% растворе гамма-глобулина человека (Sigma, Кат. № G-4386), разведенного в растворе PBS и буфере для окрашивания BD FACS. Аликвоты клеток (приблизительно 10⁵ клеток каждая) окрашивали в течение 30 минут при температуре 4°C антителами, непосредственно сопряженными с флюоресцентной меткой и специфичными по отношению к CD9 PE (BD № 555372), CD99 PE (Caltag № MHCD9904) или CXCR-4 APC (R&D Systems, Кат. № FAB173A). После ряда промывок в окрашивающем буфере BD FACS клетки окрасили 7-AAD (BD № 559925) для оценки их жизнеспособности и анализировали на анализаторе BD FACS Array (BD Biosciences), накапливая не менее 10000 событий. Для получения процентной доли положительных клеток использовали мышиные IgG₁k изотипические контрольные антитела к PE и APC.

Клетки для количественного ПЦР обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (зондовая часть № 450025, прямая и обратная часть № 4304971).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct ( Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2- Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

На фиг. 9 приведены результаты цитометрического анализа (FACS) процента положительных клеток с экспрессией поверхностного рецептора CXCR4 после обработки различными ингибиторами GSK3. Приведены данные для двух концентраций каждого соединения в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в сравнении с необработанной популяцией клеток (отрицательный контрольный образец) и клетками, обработанными Activin A и Wnt3 (положительный контрольный образец). На фиг. 10A, B и C приведены данные ПЦР в реальном времени для CXCR4, Sox17 и HNF3beta, которые также рассматриваются в качестве маркеров сформированной эндодермы. И цитометрический анализ, и анализ ПЦР в реальном времени свидетельствуют о значительном росте каждого из указанных маркеров в дифференцированных клетках относительно необработанных контрольных клеток. В ряде случаев уровни экспрессии указанных маркеров сформированной эндодермы оказались эквивалентны соответствующим уровням в положительных контрольных образцах, тем самым демонстрируя, что ингибитор GSK3 может заменить Wnt3a на этой стадии клеточной дифференцирования.

Пример 9

Эффект ингибиторов фермента GSK-3 на формирование панкреатической эндодермы

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3 на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, клетки панкреатической эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию PDX1 и HNF6, ключевых факторов транскрипции, ассоциированных с дифференцированием по линии панкреатической эндодермы.

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линий H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL ^TM (в разбавлении 1:30) 24-луночные планшеты (черные лунки; Arctic White) в объеме 1 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Во втором эксперименте кластеры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека высеяли на 96-луночные планшеты с нанесенным питающим слоем из мышиных эмбриональных фибропластов, инактивированных обработкой митомицином C (Sigma Chemical Co). Культуральная среда для эмбриональных стволовых клеток человека на монослоях мышиных эмбриональных фибробластов состояла из среды DMEM:F12 с 20% нокаут-заменителем сыворотки (Invitrogen) с добавлением минимально необходимых незаменимых аминокислот (Invitrogen), L-глутамина и 2-меркаптоэтанола. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из восьми соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в основной среде с добавками.

Анализ: В этом анализе ингибиторы GSK3 вводили только на 1 и 2 день стадии дифференцирования по линии сформированной эндодермы, заменяя ими Wnt3a. Анализ культур эмбриональных стволовых клеток на покрытых препаратом MATRIGEL^TM носителях начали, как описано в примерах 7 и 8 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ циклопамина 3-кето-N-(аминоэтил-аминокапроил-дигидроциннамоила (KAAD) (EMD Biosciences) и 20 нг/мл фактора роста фибробластов FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Параллельно на питающих слоях мышиных эмбриональных фибробластов выращивали культуры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека и дифференцировали их в клетки панкреатической эндодермы. Дифференцирование сформированной эндодермы провели путем культивирования клеток в среде, состоящей из основной среды RPMI-1640 (Invitrogen), не содержащей сыворотки на 1 день и содержащей 0,2% FCS на 2 и 3 дни, с добавлением различных концентраций испытываемых ингибиторов и 100 нг/мл Activin A. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки) с 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки), без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой RPMI-1640 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 день поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS. Клетки дифференцировали в клетки линии панкреатической эндодермы путем четырехдневной обработки, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 50 нг/мл фактора роста фибробластов FGF10 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 50 нг/мл FGF10. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании дифференцирования клетки проанализировали методом ПЦР в реальном времени на уровни экспрессии генов, как описано в примере 8 выше. Для флюоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, снова трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Pdx1; Santa Cruz) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на два часа при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку после трехкратной промывки клеток раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Pdx1 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Pdx1 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E) и HNF6 (Hs00413554_m1).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct ( Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2- Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3 . Представленные на фиг. 11 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность Pdx1 (часть B) для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 12 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект описываемых низкомолекулярных ингибиторов на индуцированную экспрессию двух факторов транскрипции, Pdx1 и HNF6. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и HNF6 являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы. В проведенных анализах соединения-ингибиторы GSK3 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования; формируемые при этом клетки сохраняют способность к образованию панкреатической эндодермы в ходе последующих стадий дифференцирования.

Пример 10

Эффект ингибиторов фермента GSK-3 на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3 на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, панкреатических эндокринных клеток или клеток, вырабатывающих инсулин. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию панкреатических гормонов.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примере 9 способами (культивированные на 96-луночных и 24-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGEL ^TM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на стадиях 2 и 3 все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems). Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примерах 7 и 8 выше, для анализа методами одновременного многопараметрического анализа или ПЦР в реальном времени.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM®7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN®использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), Insulin (Hs00355773) и GAPDH (4310884E).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла C_t как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения C_t. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение C_t эндогенного контрольного образца вычитали из значения C_t целевого гена и получали величину дельта C_t ( C_t). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2- Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3B. Представленные на фиг. 13 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 14 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект соединений для Pdx1 и инсулина. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и инсулина являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы и выработки гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и могут индуцировать и поддерживать формирование панкреатических бета-клеток в ходе последующих стадий дифференцирования, как показывают результаты и инсулинового иммуноокрашивания, и ПЦР в реальном времени.

Пример 11

Аддитивные эффекты ингибиторов фермента GSK-3 на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3 может улучшить дифференцирование панкреатических бета клеток, если ингибиторы добавляются на нескольких стадиях коммитирования клеток. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили методом последовательного добавления на способность повышать уровень экспрессии инсулина, ассоциируемый с панкреатическими гормон-положительными клетками.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примерах 9 и 10 способами (культивированные на 96-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGEL^TM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich) и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного шестидневного периода ингибиторы GSK3 добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems), и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного трехдневного периода ингибиторы GSK3 добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Лунки с параллельными положительными контрольными образцами обрабатывали в присутствии или в отсутствии 20 нг/мл Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примере 10 выше, для анализа методом одновременного многопараметрического анализа.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки опять трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3 . Представленные на фиг. 15 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии инсулина является индикатором дифференцирования в линию панкреатических гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и, при добавлении на более поздних стадиях, стимулируют повышение уровня экспрессии инсулина по отношению к положительному контрольному образцу.

Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты настоящего изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения определяется не упомянутым выше описанием, а следующими ниже пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Таблица IA Список первичных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
Антитело	Поставщик	Изотип	Клон
SSEA-1	Chemicon (Калифорния, США)	Мышиный IgM	MC-480
SSEA-3	Chemicon (Калифорния, США)	Мышиный IgG3	MC-631
SSEA-4	Chemicon (Калифорния, США)	Крысиный IgM	MC-813-70
TRA 1-60	Chemicon (Калифорния, США)	Мышиный IgM	TRA 1-60
TRA 1-81	Chemicon (Калифорния, США)	Мышиный IgM	TRA 1-81
TRA 1-85	Chemicon (Калифорния, США)	Мышиный IgG1	TRA 1-85
AP	R&D systems	Мышиный IgG1	B4-78
HNF3	R&D systems	Козий IgG
PDX1	Santa Cruz Biotechnology, INC	Козий IgG	A-17
GATA4	R&D systems	Козий IgG
Sox 17	R&D systems	Козий IgG
CD 9	BD	Мышиный IgG1	M-L13

Таблица IB Список вторичных сопряженных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
Вторичное сопряженное антитело	Поставщик	Разведе-ние
Козий антимышиный IgG, сопряженный с APC	Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)	1:200
Козий антимышиный IgG, сопряженный с PE	Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)	1:200
Ослиный антикроличий IgG, сопряженный с PE или APC	Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)	1:200
Ослиный антикозий IgG, сопряженный с PE или APC	Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)	1:200
Козий анти-мышиный IgM, сопряженный с PE	SouthernBiotech (Алабама, США)	1:200
Козий антикрысиный IgM, сопряженный с PE	SouthernBiotech (Алабама, США)	1:200
Козий антимышиный IgG3, сопряженный с PE	SouthernBiotech (Алабама, США)	1:200

Таблица II Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
	Исходные данные		Среднее значение	Среднеквадра-тическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
	(дублир.)
JNJ5226780	0,785	0,790	0,788	0,00382	0,48	94,0
JNJ10179026	0,148	0,152	0,150	0,00247	1,65	4,8
JNJ17154215	0,427	0,462	0,444	0,02496	5,62	46,0
JNJ17205955	0,643	0,638	0,641	0,00368	0,57	73,5
JNJ180125	0,762	0,762	0,762	0,00007	0,01	90,4
JNJ18157646	0,850	0,824	0,837	0,01824	2,18	101,0

JNJ19370026	0,911	0,884	0,898	0,01881	2,10	109,5
JNJ19567340	0,723	0,743	0,733	0,01421	1,94	86,4
JNJ7830433	0,161	0,169	0,165	0,00559	3,39	6,9
JNJ10179130	0,767	0,789	0,778	0,01556	2,00	92,6
JNJ17154215	0,512	0,555	0,533	0,03048	5,72	58,4
JNJ17205955	0,282	0,293	0,288	0,00792	2,75	24,1
JNJ18014061	0,764	0,723	0,743	0,02892	3,89	87,9
JNJ18157698	0,853	0,858	0,855	0,00382	0,45	103,5
JNJ19376240	0,832	0,837	0,834	0,00361	0,43	100,6
JNJ19567405	0,726	0,725	0,725	0,00042	0,06	85,3
JNJ8706646	0,132	0,137	0,134	0,00368	2,74	2,6
JNJ10182562	0,797	0,793	0,795	0,00346	0,44	95,1
JNJ17157659	0,776	0,787	0,782	0,00792	1,01	93,2
JNJ17205994	0,164	0,148	0,156	0,01131	7,24	5,6
JNJ18014074	0,475	0,383	0,429	0,06548	15,26	43,8
JNJ18157698	0,823	0,774	0,798	0,03444	4,31	95,6
JNJ19386042	0,781	0,729	0,755	0,03649	4,83	89,5
JNJ19573541	0,143	0,149	0,146	0,00396	2,72	4,2
JNJ8710481	0,716	0,716	0,716	0,00014	0,02	84,1
JNJ10182562	0,804	0,802	0,803	0,00148	0,18	96,2
JNJ17163042	0,900	0,877	0,888	0,01626	1,83	108,2
JNJ17226703	0,824	0,799	0,812	0,01725	2,13	97,4
JNJ18018338	0,744	0,819	0,781	0,05261	6,73	93,2
JNJ18157711	0,952	0,966	0,959	0,00933	0,97	118,1
JNJ19410833	0,952	0,919	0,935	0,02277	2,43	114,8
JNJ19574867	0,776	0,777	0,777	0,00042	0,05	92,5
JNJ8710481	0,691	0,617	0,654	0,05254	8,03	75,4
JNJ10184655	0,162	0,134	0,148	0,02022	13,66	4,5

JNJ10166565	0,791	0,608	0,700	0,12947	18,50	81,8
JNJ17982133	0,153	0,129	0,141	0,01676	11,87	3,5
JNJ18018351	0,731	0,585	0,658	0,10317	15,68	75,9
DMSO	0,789	0,700	0,744	0,06279	8,44	88,0
JNJ19410859	0,909	0,675	0,792	0,16546	20,88	94,7
JNJ19574880	0,164	0,151	0,157	0,00926	5,89	5,8
JNJ10148307	0,706	0,672	0,689	0,02404	3,49	83,9
JNJ10222784	0,641	0,601	0,621	0,02878	4,63	73,7
JNJ17174664	0,882	0,748	0,815	0,09504	11,66	102,5
JNJ17989049	0,822	0,802	0,812	0,01400	1,72	102,1
JNJ18047991	0,777	0,764	0,771	0,00919	1,19	95,9
DMSO	0,798	0,771	0,785	0,01916	2,44	98,0
JNJ19410872	0,791	0,789	0,790	0,00134	0,17	98,7
JNJ20948798	0,628	0,640	0,634	0,00806	1,27	75,6
JNJ10164830	0,149	0,135	0,142	0,00969	6,81	2,7
JNJ10222927	0,803	0,782	0,792	0,01492	1,88	99,1
JNJ17187027	0,125	0,129	0,127	0,00318	2,51	0,4
JNJ17994873	0,315	0,542	0,428	0,15995	37,34	45,2
JNJ18055726	0,820	0,748	0,784	0,05091	6,49	97,9
JNJ18157711	0,154	0,165	0,160	0,00806	5,05	5,3
JNJ19558929	0,737	0,730	0,734	0,00481	0,66	90,4
JNJ21192730	0,659	0,647	0,653	0,00813	1,25	78,5
JNJ10164895	0,165	0,154	0,159	0,00785	4,93	5,2
JNJ10231273	0,637	0,554	0,595	0,05876	9,87	69,9
JNJ17187053	0,684	0,588	0,636	0,06809	10,71	76,0
JNJ17994899	0,750	0,624	0,687	0,08945	13,02	83,5
JNJ18077800	0,678	0,618	0,648	0,04285	6,61	77,8
JNJ19363357	0,777	0,667	0,722	0,07757	10,74	88,7

DMSO	0,799	0,649	0,724	0,10564	14,59	89,0
JNJ21194667	0,648	0,625	0,636	0,01662	2,61	76,0
JNJ10172058	0,601	0,620	0,611	0,01308	2,14	72,2
JNJ10259847	0,695	0,702	0,698	0,00552	0,79	85,2
JNJ17193774	0,568	0,709	0,639	0,09956	15,59	76,4
JNJ17994912	0,623	0,765	0,694	0,10041	14,46	84,6
JNJ18157074	0,758	0,762	0,760	0,00297	0,39	94,3
JNJ19369233	0,487	0,434	0,461	0,03769	8,18	49,9
JNJ19567314	0,690	0,686	0,688	0,00262	0,38	83,7
JNJ21196227	0,535	0,550	0,543	0,01089	2,01	62,1
JNJ10178727	0,743	0,638	0,691	0,07446	10,78	84,1
JNJ10259847	0,694	0,603	0,649	0,06449	9,94	77,8
JNJ17200976	0,160	0,186	0,173	0,01824	10,56	7,2
JNJ17994925	0,662	0,566	0,614	0,06788	11,05	72,7
JNJ18157087	0,600	0,514	0,557	0,06102	10,96	64,2
JNJ19369246	0,685	0,524	0,605	0,11427	18,90	71,3
JNJ19567327	0,731	0,525	0,628	0,14552	23,18	74,7
JNJ24843611	0,715	0,596	0,655	0,08436	12,87	78,8
JNJ24843611	0,592	0,572	0,582	0,01393	2,39	70,0
JNJ25758785	0,614	0,611	0,613	0,00177	0,29	74,6
JNJ26064571	0,766	0,849	0,807	0,05869	7,27	104,3
JNJ26130403	0,830	0,813	0,822	0,01195	1,45	106,5
JNJ26170794	0,727	0,730	0,728	0,00198	0,27	92,2
JNJ26241774	0,713	0,836	0,774	0,08733	11,28	99,3
JNJ26367991	0,726	0,719	0,722	0,00523	0,72	91,3
JNJ26483310	0,646	0,681	0,663	0,02510	3,78	82,4
JNJ24326185	0,651	0,649	0,650	0,00120	0,19	80,3
JNJ25758850	0,642	0,622	0,632	0,01407	2,23	77,5

JNJ26067626	0,843	0,672	0,758	0,12099	15,97	96,7
JNJ26134771	0,734	0,815	0,774	0,05728	7,40	99,3
JNJ26170820	0,823	0,743	0,783	0,05699	7,28	100,6
JNJ26241917	0,871	0,874	0,872	0,00219	0,25	114,2
JNJ26714220	0,652	0,642	0,647	0,00721	1,12	79,8
JNJ26483223	0,617	0,633	0,625	0,01174	1,88	76,5
JNJ24843572	0,657	0,655	0,656	0,00134	0,20	81,2
JNJ25758863	0,684	0,809	0,746	0,08803	11,80	95,0
JNJ26067652	0,901	0,735	0,818	0,11731	14,34	106,0
JNJ26150202	0,791	0,768	0,779	0,01591	2,04	100,1
JNJ26170833	0,948	0,764	0,856	0,12982	15,17	111,7
JNJ26243204	0,821	0,608	0,714	0,15033	21,05	90,1
JNJ26399906	0,745	0,685	0,715	0,04243	5,94	90,2
JNJ26483236	0,624	0,618	0,621	0,00417	0,67	76,0
JNJ24843585	0,652	0,624	0,638	0,01916	3,00	78,5
JNJ25873419	0,773	0,662	0,718	0,07792	10,86	90,6
JNJ26069901	0,856	0,834	0,845	0,01570	1,86	110,1
JNJ26153647	0,828	0,800	0,814	0,02008	2,47	105,4
JNJ26177086	0,821	0,841	0,831	0,01421	1,71	108,0
JNJ26247143	0,816	0,787	0,802	0,02072	2,58	103,5
JNJ26399906	0,744	0,737	0,741	0,00453	0,61	94,1
JNJ26483249	0,699	0,679	0,689	0,01464	2,12	86,3
JNJ25753520	0,186	0,208	0,197	0,01541	7,83	11,3
JNJ25887537	0,665	0,699	0,682	0,02432	3,57	85,2
JNJ26077883	0,810	0,683	0,746	0,09030	12,10	95,0
JNJ26158015	0,141	0,162	0,151	0,01506	9,95	4,3
DMSO	0,784	0,605	0,695	0,12671	18,25	87,1
JNJ26248729	0,726	0,590	0,658	0,09624	14,63	81,5

JNJ26399945	0,635	0,620	0,628	0,01068	1,70	76,9
JNJ26483249	0,697	0,695	0,696	0,00113	0,16	87,3
JNJ25753403	0,154	0,153	0,154	0,00042	0,28	4,5
JNJ25900641	0,616	0,645	0,630	0,02072	3,29	82,1
JNJ22791671	0,909	0,830	0,869	0,05614	6,46	121,0
JNJ26158054	0,150	0,150	0,150	0,00028	0,19	3,9
JNJ26177762	0,981	1,056	1,018	0,05303	5,21	145,3
JNJ26261105	0,166	0,189	0,177	0,01626	9,19	8,3
JNJ26399971	0,718	0,451	0,584	0,18887	32,34	74,6
JNJ26483262	0,652	0,647	0,649	0,00389	0,60	85,2
JNJ25757173	0,503	0,529	0,516	0,01860	3,61	63,5
JNJ25900654	0,603	0,609	0,606	0,00424	0,70	78,1
JNJ26116922	0,856	0,793	0,824	0,04419	5,36	113,7
JNJ26893438	0,883	0,848	0,866	0,02503	2,89	120,5
JNJ26184457	0,779	0,784	0,781	0,00368	0,47	106,7
JNJ26361712	0,892	0,914	0,903	0,01591	1,76	126,6
JNJ26399984	0,544	0,537	0,540	0,00460	0,85	67,5
JNJ26511901	0,532	0,682	0,607	0,10543	17,37	78,3
JNJ25757173	0,665	0,645	0,655	0,01400	2,14	86,1
JNJ25900706	0,676	0,677	0,677	0,00035	0,05	89,7
JNJ26120601	0,935	0,807	0,871	0,09115	10,47	121,3
JNJ26158093	0,916	0,859	0,887	0,03981	4,49	124,0
JNJ26219050	0,907	0,891	0,899	0,01124	1,25	125,9
JNJ26361725	0,909	0,896	0,902	0,00919	1,02	126,4
JNJ26399997	0,682	0,797	0,740	0,08118	10,98	99,9
JNJ26511927	0,679	0,644	0,661	0,02510	3,80	87,2
JNJ25757238	0,300	0,223	0,261	0,05452	20,88	22,0
JNJ26047723	0,183	0,175	0,179	0,00573	3,20	8,6

JNJ26120614	0,741	0,728	0,734	0,00884	1,20	99,1
JNJ26158106	0,935	0,906	0,921	0,02051	2,23	129,4
JNJ26219063	0,131	0,128	0,129	0,00212	1,64	0,5
JNJ26366730	0,138	0,137	0,138	0,00092	0,67	1,9
JNJ26400049	0,241	0,227	0,234	0,01032	4,41	17,6
JNJ26941226	0,604	0,639	0,622	0,02475	3,98	80,7
JNJ25758707	0,247	0,182	0,215	0,04617	21,52	14,4
JNJ26054912	0,659	0,634	0,647	0,01718	2,66	84,8
JNJ26128726	0,758	0,575	0,667	0,12961	19,44	88,1
JNJ26161343	0,166	0,170	0,168	0,00276	1,64	6,9
JNJ26220454	0,651	0,559	0,605	0,06541	10,81	78,0
JNJ26367991	0,803	0,694	0,748	0,07693	10,28	101,3
JNJ26483197	0,823	0,634	0,728	0,13378	18,37	98,1
JNJ26511953	0,624	0,618	0,621	0,00431	0,69	80,6
RWJ351001	0,639	0,603	0,621	0,02553	4,11	73,6
RWJ382867	0,143	0,149	0,146	0,00403	2,76	2,9
RWJ682205	0,817	0,818	0,818	0,00071	0,09	102,8
RWJ665862	0,742	0,752	0,747	0,00679	0,91	92,2
RWJ670804	0,856	0,905	0,881	0,03479	3,95	112,1
RWJ673829	0,650	0,576	0,613	0,05268	8,59	72,4
RWJ675260	0,768	0,724	0,746	0,03097	4,15	92,2
RWJ675946	0,556	0,549	0,553	0,00537	0,97	63,4
RWJ351958	0,227	0,242	0,235	0,01103	4,70	16,1
RWJ395477	0,634	0,663	0,649	0,02044	3,15	77,7
RWJ447228	0,141	0,128	0,135	0,00919	6,83	1,3
RWJ666167	0,847	0,832	0,840	0,01110	1,32	106,0
RWJ670908	0,803	0,845	0,824	0,02998	3,64	103,7
RWJ673830	0,860	0,860	0,860	0,00035	0,04	109,1

RWJ675261	0,528	0,497	0,513	0,02227	4,34	57,5
RWJ675948	0,683	0,688	0,686	0,00332	0,48	83,1
RWJ447228	0,611	0,628	0,620	0,01202	1,94	73,3
RWJ414342	0,719	0,749	0,734	0,02143	2,92	90,3
RWJ553709	0,916	0,838	0,877	0,05487	6,26	111,6
RWJ666168	0,771	0,740	0,755	0,02178	2,88	93,5
RWJ670984	0,820	0,852	0,836	0,02305	2,76	105,5
RWJ674239	0,971	0,913	0,942	0,04137	4,39	121,2
RWJ675430	0,839	0,743	0,791	0,06746	8,53	98,8
RWJ676061	0,562	0,527	0,544	0,02440	4,48	62,2
RWJ352190	0,678	0,661	0,670	0,01195	1,78	80,8
RWJ414984	0,722	0,713	0,717	0,00658	0,92	87,9
RWJ659780	0,802	0,801	0,802	0,00106	0,13	100,4
RWJ666205	0,854	0,857	0,855	0,00205	0,24	108,4
RWJ671232	0,767	0,798	0,782	0,02157	2,76	97,5
RWJ674240	0,789	0,776	0,782	0,00870	1,11	97,5
RWJ675266	0,720	0,709	0,714	0,00764	1,07	87,4
RWJ676085	0,641	0,618	0,630	0,01619	2,57	74,9
RWJ352244	0,603	0,584	0,593	0,01372	2,31	69,4
RWJ425264	0,135	0,158	0,146	0,01633	11,18	3,0
RWJ662440	0,792	0,572	0,682	0,15563	22,83	82,6
RWJ666213	0,752	0,593	0,673	0,11292	16,79	81,2
RWJ672667	0,805	0,598	0,702	0,14644	20,87	85,5
RWJ674241	0,599	0,504	0,552	0,06682	12,11	63,2
RWJ675366	0,714	0,593	0,654	0,08549	13,08	78,4
RWJ676137	0,699	0,698	0,698	0,00099	0,14	85,0
RWJ352628	0,690	0,674	0,682	0,01131	1,66	83,3
RWJ425268	0,616	0,634	0,625	0,01301	2,08	74,8

RWJ663860	0,809	0,817	0,813	0,00552	0,68	103,0
RWJ667045	0,128	0,133	0,131	0,00361	2,76	0,7
RWJ672932	0,821	0,811	0,816	0,00721	0,88	103,4
RWJ674320	0,456	0,474	0,465	0,01223	2,63	50,8
RWJ675369	0,762	0,766	0,764	0,00304	0,40	95,7
RWJ676139	0,680	0,663	0,671	0,01195	1,78	81,8
RWJ353258	0,615	0,635	0,625	0,01400	2,24	74,8
RWJ355923	0,681	0,698	0,689	0,01266	1,84	84,5
RWJ664545	0,830	0,807	0,818	0,01584	1,94	103,8
RWJ667046	0,869	0,849	0,859	0,01442	1,68	109,9
RWJ672934	0,821	0,841	0,831	0,01428	1,72	105,7
RWJ674817	0,819	0,840	0,830	0,01485	1,79	105,5
RWJ675430	0,795	0,793	0,794	0,00078	0,10	100,1
RWJ676431	0,640	0,636	0,638	0,00283	0,44	76,7
RWJ355131	0,610	0,628	0,619	0,01266	2,05	73,9
RWJ425271	0,143	0,144	0,144	0,00035	0,25	2,6
RWJ353709	0,804	0,903	0,853	0,07000	8,20	109,0
RWJ667069	0,918	0,854	0,886	0,04483	5,06	113,9
RWJ673313	0,105	1,080	0,593	0,68971	116,37	70,0
RWJ674855	0,877	0,860	0,868	0,01209	1,39	111,3
RWJ675578	0,808	0,695	0,751	0,07941	10,57	93,8
RWJ676432	0,720	0,697	0,709	0,01648	2,33	87,3
RWJ355923	0,636	0,621	0,629	0,01054	1,68	75,4
RWJ425348	0,640	0,634	0,637	0,00474	0,74	76,6
RWJ665436	0,833	0,833	0,833	0,00000	0,00	106,0
RWJ669182	0,887	0,846	0,866	0,02934	3,39	111,0
RWJ673515	0,845	0,877	0,861	0,02326	2,70	110,2
RWJ674855	0,794	0,784	0,789	0,00686	0,87	99,4

RWJ675605	0,770	0,786	0,778	0,01138	1,46	97,8
RWJ67657	0,629	0,659	0,644	0,02128	3,30	77,7
RWJ356205	0,584	0,558	0,571	0,01817	3,18	66,8
RWJ445224	0,707	0,679	0,693	0,01987	2,87	85,0
RWJ665588	0,727	0,578	0,652	0,10536	16,15	78,9
RWJ669327	0,742	0,629	0,685	0,07969	11,63	83,8
DMSO	0,653	0,507	0,580	0,10310	17,78	68,0
RWJ675104	0,722	0,568	0,645	0,10904	16,90	77,9
RWJ675881	0,643	0,581	0,612	0,04384	7,16	72,9
RWJ676639	0,608	0,590	0,599	0,01245	2,08	70,9
JNJ26511966	0,597	0,610	0,603	0,00926	1,54	71,2
JNJ26511979	0,687	0,668	0,677	0,01336	1,97	82,4
JNJ26512005	0,840	0,832	0,836	0,00594	0,71	106,1
JNJ26533065	0,831	0,822	0,826	0,00587	0,71	104,7
JNJ26533091	0,863	0,856	0,860	0,00509	0,59	109,7
JNJ26533104	0,886	0,802	0,844	0,05954	7,05	107,3
JNJ26533156	0,753	0,687	0,720	0,04660	6,47	88,8
JNJ26714181	0,455	0,463	0,459	0,00587	1,28	49,6
JNJ26714194	0,668	0,678	0,673	0,00764	1,13	81,7
JNJ26714207	0,181	0,171	0,176	0,00658	3,74	7,2
JNJ26714220	0,832	0,842	0,837	0,00658	0,79	106,3
JNJ26875563	0,795	0,802	0,798	0,00445	0,56	100,5
JNJ22791671	0,157	0,140	0,148	0,01202	8,11	3,0
JNJ26893438	0,153	0,153	0,153	0,00035	0,23	3,7
JNJ26941226	0,168	0,154	0,161	0,00969	6,02	4,9
JNJ28572128	0,670	0,641	0,655	0,02079	3,17	79,1
RWJ67694	0,706	0,679	0,693	0,01888	2,73	84,7
RWJ676940	0,788	0,666	0,727	0,08627	11,86	89,8

RWJ677545	0,879	0,785	0,832	0,06640	7,98	105,6
RWJ678986	0,168	0,176	0,172	0,00537	3,13	6,6
RWJ680665	0,946	0,848	0,897	0,06972	7,77	115,3
RWJ680667	0,187	0,202	0,194	0,01089	5,61	9,9
RWJ680668	0,906	0,688	0,797	0,15394	19,31	100,3
RWJ680669	0,715	0,674	0,694	0,02850	4,10	84,9
RWJ680858	0,695	0,700	0,697	0,00339	0,49	85,3
RWJ680858	0,665	0,631	0,648	0,02369	3,66	78,0
RWJ680879	0,590	0,613	0,601	0,01655	2,75	71,0
RWJ680885	0,681	0,687	0,684	0,00382	0,56	83,3
RWJ680991	0,829	0,821	0,825	0,00530	0,64	104,5
RWJ680992	0,822	0,790	0,806	0,02270	2,82	101,6
RWJ680993	0,671	0,684	0,677	0,00912	1,35	82,3
RWJ681140	0,686	0,668	0,677	0,01266	1,87	82,3
RWJ681142	0,212	0,197	0,204	0,01047	5,12	11,5
RWJ681146	0,666	0,666	0,666	0,00007	0,01	80,7
RWJ681945	0,736	0,656	0,696	0,05643	8,11	85,1
RWJ68198	0,726	0,610	0,668	0,08217	12,30	81,0
JNJ28850601	0,303	0,310	0,306	0,00488	1,59	26,7
DMSO	0,786	0,659	0,722	0,09001	12,46	89,1
DMSO	0,673	0,649	0,661	0,01676	2,53	79,9
DMSO	0,701	0,686	0,693	0,01011	1,46	84,8

Таблица III Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
	Концен-трация соеди-нения	Исходные данные		Среднее значение	Среднеквадратиче- ское отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
	(мкМ)	(дублир.)
Среда EXPRES 01		0,6379	0,6180	0,6280	0,0141	2,2	74,6
Без обработки		0,7412	0,7038	0,7225	0,0264	3,7	88,7
Только AA		0,7674	0,8047	0,7861	0,0264	3,4	98,3
AA+Wnt3a		0,7754	0,8200	0,7977	0,0315	4,0	100,0
JNJ26512005	10	0,1412	0,1515	0,1464	0,0073	5,0	2,4
JNJ26512005	5	0,1501	0,1444	0,1473	0,0040	2,7	2,5
JNJ26512005	2,5	0,1541	0,4254	0,2898	0,1918	66,2	23,9
JNJ26533065	10	0,1272	0,1282	0,1277	0,0007	0,6	-0,4
JNJ26533065	5	0,5862	0,5880	0,5871	0,0013	0,2	68,4
JNJ26533065	2,5	0,7613	0,7603	0,7608	0,0007	0,1	94,5
JNJ26533156	10	0,1481	0,1592	0,1537	0,0078	5,1	3,5
JNJ26533156	5	0,1479	0,1639	0,1559	0,0113	7,3	3,8
JNJ26533156	2,5	0,2861	0,2477	0,2669	0,0272	10,2	20,4
JNJ26714194	10	0,2092	0,2426	0,2259	0,0236	10,5	14,3
JNJ26714194	5	0,6815	0,7128	0,6972	0,0221	3,2	84,9
JNJ26714194	2,5	0,7389	0,7870	0,7630	0,0340	4,5	94,8
JNJ26150202	10	0,1381	0,1398	0,1390	0,0012	0,9	1,3
JNJ26150202	5	0,7826	0,7578	0,7702	0,0175	2,3	95,9
JNJ26150202	2,5	0,8231	0,7742	0,7987	0,0346	4,3	100,1
JNJ26158015	10	0,1352	0,1326	0,1339	0,0018	1,4	0,5

JNJ26158015	5	0,2632	0,2604	0,2618	0,0020	0,8	19,7
JNJ26158015	2,5	0,4160	0,5314	0,4737	0,0816	17,2	51,4
RWJ670804	10	0,4447	0,4791	0,4619	0,0243	5,3	49,7
RWJ670804	5	0,6902	0,6884	0,6893	0,0013	0,2	83,8
RWJ670804	2,5	0,7476	0,7483	0,7480	0,0005	0,1	92,5
JNJ26170833	10	0,6790	0,6704	0,6747	0,0061	0,9	81,6
JNJ26170833	5	0,7833	0,7924	0,7879	0,0064	0,8	98,5
JNJ26170833	2,5	0,8155	0,8389	0,8272	0,0165	2,0	104,4
JNJ26177086	10	0,6533	0,6884	0,6709	0,0248	3,7	81,0
JNJ26177086	5	0,7697	0,7738	0,7718	0,0029	0,4	96,1
JNJ26177086	2,5	0,8119	0,8219	0,8169	0,0071	0,9	102,9
JNJ26177762	10	0,1242	0,1323	0,1283	0,0057	4,5	-0,4
JNJ26177762	5	0,1263	0,1303	0,1283	0,0028	2,2	-0,3
JNJ26177762	2,5	0,8480	0,7725	0,8103	0,0534	6,6	101,9
RWJ673515	10	0,1695	0,1890	0,1793	0,0138	7,7	7,3
RWJ673515	5	0,7217	0,7435	0,7326	0,0154	2,1	90,2
RWJ673515	2,5	0,7812	0,7221	0,7517	0,0418	5,6	93,1
Среда EXPRES 01		0,6294	0,6363	0,6329	0,0049	0,8	70,3
Без обработки		0,7156	0,7356	0,7256	0,0141	1,9	83,3
Только AA		0,8732	0,9046	0,8889	0,0222	2,5	106,0
AA+Wnt3a		0,8415	0,8500	0,8458	0,0060	0,7	100,0
JNJ19370026	10	0,1403	0,1493	0,1448	0,0064	4,4	2,3
JNJ19370026	5	0,4434	0,3878	0,4156	0,0393	9,5	40,1
JNJ19370026	2,5	0,7734	0,8038	0,7886	0,0215	2,7	92,0
JNJ26483197	10	0,2993	0,3026	0,3010	0,0023	0,8	24,1
JNJ26483197	5	0,7023	0,6299	0,6661	0,0512	7,7	75,0
JNJ26483197	2,5	0,7835	0,8043	0,7939	0,0147	1,9	92,8

RWJ675605	10	0,7205	0,7369	0,7287	0,0116	1,6	83,7
RWJ675605	5	0,7769	0,8272	0,8021	0,0356	4,4	93,9
RWJ675605	2,5	0,8214	0,8640	0,8427	0,0301	3,6	99,6
RWJ675430	10	0,6275	0,5980	0,6128	0,0209	3,4	67,5
RWJ675430	5	0,7159	0,7222	0,7191	0,0045	0,6	82,3
RWJ675430	2,5	0,9245	0,9403	0,9324	0,0112	1,2	112,1
RWJ675948	10	0,7220	0,6670	0,6945	0,0389	5,6	78,9
RWJ675948	5	0,7526	0,7486	0,7506	0,0028	0,4	86,7
RWJ675948	2,5	0,7557	0,7390	0,7474	0,0118	1,6	86,3
JNJ26483249	10	0,8214	0,8636	0,8425	0,0298	3,5	99,5
JNJ26483249	5	0,7996	0,7873	0,7935	0,0087	1,1	92,7
JNJ26483249	2,5	0,8669	0,8195	0,8432	0,0335	4,0	99,6
RWJ67657	10	0,6195	0,5908	0,6052	0,0203	3,4	66,5
RWJ67657	5	0,8047	0,8319	0,8183	0,0192	2,4	96,2
RWJ67657	2,5	0,8041	0,7900	0,7971	0,0100	1,3	93,2
RWJ676639	10	0,1261	0,1520	0,1391	0,0183	13,2	1,5
RWJ676639	5	0,1303	0,1263	0,1283	0,0028	2,2	0,0
RWJ676639	2,5	0,4482	0,4051	0,4267	0,0305	7,1	41,6

Таблица IV Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
	Пролиферативный отклик		Уровень экспрессии SOX-17		Пролиферативный отклик		Уровень экспрессии HNF-3b
Название соединения	Общее количество клеток	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA	Общая интенсивность	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA	Общее количество клеток	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA	Общая интенсивность	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
JNJ26511966	1723	0,11244207	68870409	0,0708	1645	0,10460717	50143628	0,0453
JNJ26511979	1110	0,07245904	42978557	0,0442	94	0,00597755	0	0,0000
JNJ26512005	7990	0,52154188	339840000	0,3494	6833	0,43448539	231745000	0,2092
JNJ26533065	4914	0,32074548	238555000	0,2453	2907	0,18485899	82808745	0,0747
JNJ26533091	3056	0,19945819	153145000	0,1575	2643	0,16807097	122246784	0,1103
JNJ26533104	3960	0,25850251	47669463	0,0490	4641	0,29512575	210730000	0,1902
JNJ26533156	12243	0,79917096	699160000	0,7189	6536	0,41559887	248855000	0,2246
JNJ26714181	401	0,02614400	25580022	0,0263	27	0,00168516	0	0,0000
JNJ26714194	7958	0,51948561	351070000	0,3610	6992	0,44459636	288075000	0,2600
JNJ26714207	277	0,01808212	6558563	0,0067	12	0,00073130	535481	0,0005
JNJ26714220	1327	0,08662445	69037756	0,0710	1194	0,07589584	40478497	0,0365
JNJ26875563	791	0,05160259	24732475	0,0254	64	0,00406982	1092011	0,0010

JNJ22791671	0	0,00000000	0	0,0000	3	0,00019077	95784	0,0001
JNJ26893438	2	0,00013056	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
JNJ26941226	6	0,00035903	1092432	0,0011	2	0,00009539	150222	0,0001
JNJ28572128	2742	0,17899341	122926199	0,1264	3166	0,20132905	120729987	0,1090
JNJ28850601	33	0,00212155	3855900	0,0040	8	0,00050873	208129	0,0002
RWJ674817	2000	0,13055682	110080123	0,1132	116	0,00737655	4290889	0,0039
RWJ674855	3495	0,22814805	110559816	0,1137	438	0,02782105	24450647	0,0221
RWJ674855	3107	0,20278739	120998421	0,1244	6177	0,39276971	273965000	0,2473
RWJ675104	658	0,04295320	37841044	0,0389	646	0,04107977	31352380	0,0283
RWJ675260	5991	0,39108297	252690000	0,2598	8479	0,53915615	306520000	0,2767
RWJ675261	1953	0,12745610	88653625	0,0912	641	0,04076182	18162585	0,0164
RWJ675266	2024	0,13209087	128395000	0,1320	4923	0,31302661	232020000	0,2094
RWJ675366	2979	0,19446439	93454696	0,0961	3582	0,22775110	137054653	0,1237
RWJ675369	3703	0,24169332	138180000	0,1421	3980	0,25306032	139550000	0,1260
RWJ675430	21070	1,37538351	1089750000	1,1205	21203	1,34831961	1281000000	1,1562
RWJ675578	1297	0,08466610	47445962	0,0488	30	0,00190773	0	0,0000
RWJ675605	14529	0,94839741	1013360000	1,0419	9871	0,62767480	540725000	0,4881
RWJ675881	4063	0,26522619	207891758	0,2137	3973	0,25264697	177190000	0,1599
RWJ675946	1	0,00006528	0	0,0000	7	0,00041334	0	0,0000
RWJ675948	9716	0,63421242	572520000	0,5887	7650	0,48643922	329425000	0,2973
RWJ676061	916	0,05979503	0	0,0000	1076	0,06839210	40211776	0,0363

RWJ676085	738	0,04817547	30943000	0,0318	503	0,03198626	0	0,0000
RWJ676137	8367	0,54618448	373185000	0,3837	7976	0,50720168	260000000	0,2347
RWJ676139	20079	1,31069260	1104750000	1,1359	16884	1,07363836	1052345000	0,9499
RWJ676431	13789	0,90012403	789085000	0,8113	11369	0,72296588	547055000	0,4938
RWJ676432	16652	1,08698348	1045395000	1,0749	14950	0,95065340	854325000	0,7711
RWJ676657	6376	0,41618252	324450000	0,3336	6058	0,38523417	269025000	0,2428
RWJ676639	6470	0,42231869	327055000	0,3363	4357	0,27706591	109160000	0,0985
RWJ674817	2000	0,13055682	110080123	0,1132	116	0,00737655	4290889	0,0039
RWJ674855	3495	0,22814805	110559816	0,1137	438	0,02782105	24450647	0,0221
RWJ674855	3107	0,20278739	120998421	0,1244	6177	0,39276971	273965000	0,2473
RWJ675104	658	0,04295320	37841044	0,0389	646	0,04107977	31352380	0,0283
RWJ675260	5991	0,39108297	252690000	0,2598	8479	0,53915615	306520000	0,2767
RWJ675261	1953	0,12745610	88653625	0,0912	641	0,04076182	18162585	0,0164
RWJ675266	2024	0,13209087	128395000	0,1320	4923	0,31302661	232020000	0,2094
RWJ675366	2979	0,19446439	93454696	0,0961	3582	0,22775110	137054653	0,1237
RWJ675369	3703	0,24169332	138180000	0,1421	3980	0,25306032	139550000	0,1260
RWJ675430	21070	1,37538351	1089750000	1,1205	21203	1,34831961	1281000000	1,1562
RWJ675578	1297	0,08466610	47445962	0,0488	30	0,00190773	0	0,0000
RWJ675605	14529	0,94839741	1013360000	1,0419	9871	0,62767480	540725000	0,4881
RWJ675881	4063	0,26522619	207891758	0,2137	3973	0,25264697	177190000	0,1599
RWJ675946	1	0,00006528	0	0,0000	7	0,00041334	0	0,0000

RWJ675948	9716	0,63421242	572520000	0,5887	7650	0,48643922	329425000	0,2973
RWJ676061	916	0,05979503	0	0,0000	1076	0,06839210	40211776	0,0363
RWJ676085	738	0,04817547	30943000	0,0318	503	0,03198626	0	0,0000
RWJ676137	8367	0,54618448	373185000	0,3837	7976	0,50720168	260000000	0,2347
RWJ676139	20079	1,31069260	1104750000	1,1359	16884	1,07363836	1052345000	0,9499
RWJ676431	13789	0,90012403	789085000	0,8113	11369	0,72296588	547055000	0,4938
RWJ676432	16652	1,08698348	1045395000	1,0749	14950	0,95065340	854325000	0,7711
RWJ67657	6376	0,41618252	324450000	0,3336	6058	0,38523417	269025000	0,2428
RWJ676639	6470	0,42231869	327055000	0,3363	4357	0,27706591	109160000	0,0985
Без обработки	3891	0,25396566	97657703	0,1004	6091	0,38733268	109336609	0,0987
AA	4348	0,28379790	104735084	0,1077	122	0,00775810	5341271	0,0048
AA/3a	15319	1,00000000	972595000	1,0000	15726	1,00000000	1107900000	1,0000
RWJ351001	738	0,44211577	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ351958	0	0,00000000	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
DMSO	56	0,03353293	454796	0,0148	211	0,16644754	4455058	0,1626
RWJ352190	1313	0,78642715	28506437	0,9266	5485	4,32684722	85245671	3,1115
RWJ352244	12	0,00738523	85949	0,0028	67	0,05259006	1300640	0,0475
RWJ352628	2899	1,73612774	32703235	1,0630	7460	5,88456482	149772525	5,4668
RWJ353258	562	0,33632735	11388240	0,3702	787	0,62108861	10743082	0,3921
RWJ355131	118	0,07045908	2574279	0,0837	57	0,04522745	2584708	0,0943
RWJ355923	136	0,08163673	410648	0,0133	0	0,00000000	0	0,0000

RWJ356205	19	0,01137725	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ382867	3	0,00159681	431883	0,0140	31	0,02419143	847186	0,0309
RWJ395477	33	0,01976048	0	0,0000	225	0,17749145	5223879	0,1907
RWJ414342	16	0,00978044	0	0,0000	496	0,39127005	8966327	0,3273
RWJ414984	26	0,01556886	459801	0,0149	189	0,14935577	1819533	0,0664
RWJ425264	1	0,00039920	0	0,0000	42	0,03339469	1605538	0,0586
RWJ425268	22	0,01297405	82062	0,0027	311	0,24506968	5749996	0,2099
RWJ425271	0	0,00000000	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ425348	26	0,01556886	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ445224	202	0,12095808	627280	0,0204	1079	0,85143308	14326715	0,5229
RWJ447228	3	0,00179641	0	0,0000	4	0,00315540	101114	0,0037
RWJ553709	1310	0,78423154	24382455	0,7926	3249	2,56323955	75834631	2,7680
RWJ659780	20	0,01177645	0	0,0000	425	0,33526164	8880858	0,3242
RWJ663860	9	0,00538922	37140	0,0012	134	0,10570602	2144545	0,0783
RWJ662440	7	0,00419162	48154	0,0016	5	0,00420720	170177	0,0062
RWJ664545	70	0,04191617	589594	0,0192	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ665436	1215	0,72774451	7568849	0,2460	0	0,00000000	0	0,0000
Без обработки	1145	0,68542914	6979814	0,2269	не проводилось
AA	100	0,05988024	1264807	0,0411	51	0,04049435	923625	0,0337
AA/3a	1670	1,00000000	30764293	1,0000	1268	1,00000000	27396787	1,0000

RWJ665588	43	0,00510815	706614	0,0055	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ665862	7	0,00079815	102445	0,0008	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ666167	46	0,00546732	0	0,0000	46	0,00548446	818478	0,0044
RWJ666168	5	0,00059861	284777	0,0022	32	0,00385502	2309043	0,0124
RWJ666205	258	0,03092825	4009395	0,0312	391	0,04665766	14340307	0,0769
RWJ666213	62	0,00742278	782261	0,0061	112	0,01335347	2792473	0,0150
RWJ667045	36	0,00431000	312039	0,0024	2	0,00027820	1731575	0,0093
RWJ667046	59	0,00702371	397711	0,0031	103	0,01232017	3561761	0,0191
RWJ667069	22	0,00267380	770128	0,0060	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ669182	77	0,00925852	1631067	0,0127	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ669327	129	0,01540426	997629	0,0078	98	0,01164454	4138261	0,0222
RWJ670804	2386	0,28565728	20866647	0,1625	2594	0,30931563	61161468	0,3280
RWJ670908	172	0,02063213	625299	0,0049	133	0,01589699	3578458	0,0192
RWJ670984	8	0,00099769	394948	0,0031	530	0,06319053	16678849	0,0894
RWJ671232	17	0,00207519	0	0,0000	53	0,00627931	2270954	0,0122
RWJ672667	11	0,00127704	0	0,0000	36	0,00433193	2287281	0,0123
RWJ672932	2	0,00023944	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ672934	174	0,02087158	1451727	0,0113	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ673313	80	0,00961769	940367	0,0073	333	0,03970273	5586343	0,0300
RWJ673515	11886	1,42305850	223646667	1,7415	10331	1,23173834	309900000	1,6618
RWJ673829	545	0,06524862	5849381	0,0455	404	0,04820761	6738305	0,0361

RWJ673830	10	0,00115732	315367	0,0025	35	0,00421270	3072013	0,0165
RWJ674239	2473	0,29603320	80676667	0,6282	4209	0,50182815	143916667	0,7718
RWJ674240	8	0,00091787	233687	0,0018	6	0,00071536	0	0,0000
RWJ674241	1	0,00007981	1309298	0,0102	0	0,00000000	0	0,0000
RWJ674320	0	0,00003991	0	0,0000	0	0,00000000	0	0,0000
Без обработки	7653	0,91619443	26272707	0,2046	12050	1,43665050	74453588	0,3993
AA	15	0,00175593	0	0,0000	210	0,02503776	3777945	0,0203
AA/3a	8353	1,00000000	128424304	1,0000	8387	1,00000000	186480000	1,0000
RWJ355923	7319	0,91843393	387695000	1,0342	5436	1,07644321	437495000	0,9520
RWJ664545	6620	0,83065629	333205000	0,8889	4767	0,94395485	397435000	0,8649
RWJ353709	6217	0,78014807	337920000	0,9014	5013	0,99277156	437235000	0,9515
эталонное соед-ие	5934	0,74463546	363935000	0,9708	4122	0,81621943	348135000	0,7576
JNJ18157698	10447	1,31089221	382680000	1,0208	6908	1,36805624	560475000	1,2196
JNJ5226780	10963	1,37570586	296920000	0,7921	5679	1,12456679	463525000	1,0087
JNJ7830433	1766	0,22160873	162790000	0,4343	2184	0,43241905	189875000	0,4132
JNJ8706646	2914	0,36566696	230965000	0,6161	2776	0,54975740	125125000	0,2723
JNJ8710481	3600	0,45175053	276080000	0,7365	4121	0,81612041	294665000	0,6412
JNJ8710481	1977	0,24808633	164760000	0,4395	2266	0,44865828	152060000	0,3309
JNJ10148307	9964,5	1,25040783	363855000	0,9706	9728	1,92642836	635655000	1,3832
JNJ10164830	2536,5	0,31829590	179185000	0,4780	2397	0,47460145	150600000	0,3277
JNJ10164895	5706,5	0,71608734	319930000	0,8534	5096	1,00920883	341360000	0,7428

JNJ10172058	4645,5	0,58294642	257295000	0,6864	4507	0,89256362	312605000	0,6803
JNJ10178727	2892,5	0,36296900	213165000	0,5686	3043	0,60253490	269570000	0,5866
JNJ10179026	2460,5	0,30875894	203350000	0,5425	2410	0,47727498	209795000	0,4565
JNJ10179130	4783	0,60020078	306085000	0,8165	4556	0,90226755	326475000	0,7104
JNJ10182562	6916,5	0,86792571	377885000	1,0080	4504	0,89196950	365090000	0,7945
JNJ10182562	7370,5	0,92489647	365075000	0,9739	5300	1,04950985	399265000	0,8688
JNJ10184655	10533	1,32174677	475250000	1,2678	5186	1,02693336	404710000	0,8807
JNJ10222784	3513	0,44083323	242750000	0,6476	2522	0,49945539	214575000	0,4669
Без обработки	не проводилось				не проводилось
AA	не проводилось				не проводилось
AA/3a	7969	1,00000000	374870000	1,0000	5050	1,00000000	459540000	1,0000
JNJ10222784	563	0,31250000	57351132	0,3295	1744	0,03386884	165365000	1,1010
JNJ10222927	158	0,08777778	14786632	0,0850	83	0,00161234	14201404	0,0946
JNJ10231273	3	0,00166667	0	0,0000	4	0,00007770	28439	0,0002
JNJ10259847	5	0,00277778	0	0,0000	10	0,00019426	0	0,0000
JNJ10259847	15	0,00805556	548982	0,0032	0	0,00000000	0	0,0000
JNJ17154215	24	0,01305556	689535	0,0040	11	0,00021368	0	0,0000
JNJ17154215	94	0,05194444	11142426	0,0640	12	0,00022340	1767033	0,0118
JNJ17157659	15	0,00805556	0	0,0000	21	0,00039823	4567590	0,0304

JNJ17163042	33	0,01805556	2188847	0,0126	69	0,00134038	13689421	0,0911
JNJ10166565	4	0,00194444	0	0,0000	3	0,00005828	291660	0,0019
JNJ17174664	88	0,04888889	7121122	0,0409	399	0,00774117	65100086	0,4335
JNJ17187027	11	0,00583333	1073763	0,0062	5	0,00008742	0	0,0000
JNJ17187053	8	0,00444444	0	0,0000	9	0,00016512	0	0,0000
JNJ17193774	109	0,06027778	15714170	0,0903	136	0,00263219	15725984	0,1047
JNJ17200976	5	0,00250000	125443	0,0007	5	0,00009713	0	0,0000
JNJ17205955	20	0,01083333	3135653	0,0180	8	0,00015541	0	0,0000
JNJ17205955	9	0,00472222	72387	0,0004	17	0,00033024	736311	0,0049
JNJ17205994	6	0,00305556	644015	0,0037	4	0,00007770	0	0,0000
JNJ17226703	77	0,04277778	12632849	0,0726	28	0,00054392	9312311	0,0620
JNJ17982133	14	0,00750000	887585	0,0051	1	0,00001943	52047	0,0003
JNJ17989049	23	0,01277778	2117429	0,0122	13	0,00024282	0	0,0000
Без обработки	не проводилось				432	0,00838222	42987388	0,2862
AA	147	0,08138889	20330009	0,1168	8	0,00014569	87206	0,0006
AA/3a	1800	1,00000000	174052346	1,0000	1478	0,02870158	150190000	1,0000

Таблица V Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Пролиферативный отклик - Сильно положительные результаты		Уровень экспрессии SOX-17 - Сильно положительные результаты		Уровень экспрессии HNF-3в - Сильно положительные результаты
Название соединения	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA	Название соединения	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA	Название соединения	Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
RWJ352628	5,8846	RWJ673515	1,7415	RWJ352628	5,4668
RWJ352190	4,3268	JNJ10184655	1,2678	RWJ352190	3,1115
RWJ553709	2,5632	Уровень экспрессии SOX-17 - Умеренно положительные результаты		RWJ553709	2,7680
JNJ10148307	1,9264	RWJ676139	1,1359	RWJ673515	1,6618
RWJ673515	1,4231	RWJ675430	1,1205	JNJ10148307	1,3832
JNJ5226780	1,3757	RWJ676432	1,0749	JNJ18157698	1,2196
RWJ675430	1,3754	RWJ352628	1,0630	Уровень экспрессии HNF-3b - Умеренно положительные результаты
JNJ18157698	1,3681	RWJ675605	1,0419	RWJ675430	1,1562
JNJ10184655	1,3217	RWJ355923	1,0342	JNJ10222784	1,1010
RWJ676139	1,3107	JNJ18157698	1,0208	JNJ5226780	1,0087

Пролиферативный отклик - Умеренно положительные результаты		JNJ10182562	1,0080	RWJ355923	0,9520
JNJ5226780	1,1246	эталонное соед-ие	0,9708	RWJ353709	0,9515
RWJ676432	1,0870	JNJ10148307	0,9706	RWJ676139	0,9499
RWJ355923	1,0764	RWJ352190	0,9266	JNJ10184655	0,8807
RWJ676139	1,0736	RWJ353709	0,9014	JNJ10182562	0,8688
JNJ10182562	1,0495	RWJ664545	0,8889	RWJ664545	0,8649
JNJ10184655	1,0269	JNJ10164895	0,8534	RWJ674239	0,7718
JNJ10164895	1,0092	JNJ10179130	0,8165	RWJ676432	0,7711
RWJ353709	0,9928	RWJ676431	0,8113	эталонное соед-ие	0,7576
RWJ675605	0,9484	RWJ553709	0,7926	JNJ10164895	0,7428
RWJ664545	0,9440	JNJ5226780	0,7921	JNJ10179130	0,7104
JNJ10182562	0,9249	JNJ8710481	0,7365	JNJ10172058	0,6803
JNJ10179130	0,9023	JNJ26533156	0,7189	JNJ8710481	0,6412
RWJ676431	0,9001	JNJ10172058	0,6864	JNJ10178727	0,5866
JNJ10172058	0,8926	JNJ10222784	0,6476
RWJ445224	0,8514	RWJ674239	0,6282
эталонное соед-ие	0,8162	JNJ8706646	0,6161
JNJ8710481	0,8161	RWJ675948	0,5887
JNJ26533156	0,7992	JNJ10178727	0,5686

RWJ352190	0,7864
RWJ553709	0,7842
RWJ665436	0,7277
RWJ675948	0,6342
RWJ353258	0,6211
JNJ10178727	0,6025

Таблица VI Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	1,1348	1,0099	1,1092	1,0846	0,0660	6,1	116,5
Без обработки	0,9344	0,5977	0,8454	0,7925	0,1745	22,0	85,2
AA/DMSO	0,3878	0,2434	0,2252	0,2855	0,0891	31,2	30,7
AA/Wnt3a/DMSO	0,6098	1,0804	0,7635	0,8179	0,2403	25,8	100,0
RWJ351001	0,3418	0,4276	0,5751	0,4482	0,1180	26,3	48,2
RWJ351958	0,1362	0,1531	0,1532	0,1475	0,0098	6,6	15,8
RWJ352190	1,3764	1,2753	1,3208	1,3242	0,0506	3,8	142,3
RWJ352244	0,6923	0,5994	0,6134	0,6350	0,0501	7,9	68,2
RWJ352628	1,7896	1,4721	2,1908	1,8175	0,3602	19,8	195,3
RWJ353258	1,7591	1,6274	1,6518	1,6794	0,0701	4,2	180,4
RWJ355131	0,3702	0,3193	0,3368	0,3421	0,0259	7,6	36,8
RWJ355923	0,5876	0,6384	0,9154	0,7138	0,1764	24,7	76,7
RWJ356205	0,3074	0,2328	0,2920	0,2774	0,0394	14,2	29,8
RWJ382867	0,1311	0,1245	0,1288	0,1281	0,0034	2,6	13,8
RWJ395477	0,1270	0,2778	0,1916	0,1988	0,0757	38,1	21,4
RWJ414342	0,2166	0,3062	0,2915	0,2714	0,0481	17,7	29,2
RWJ414984	0,4362	0,3728	0,2481	0,3524	0,0957	27,2	37,9
RWJ425264	0,1560	0,1481	0,1359	0,1467	0,0101	6,9	15,8
RWJ425268	0,2932	0,3883	0,6258	0,4358	0,1713	39,3	46,8
RWJ425271	0,1362	0,1479	0,1298	0,1380	0,0092	6,7	14,8
RWJ425348	0,2198	0,2159	0,2300	0,2219	0,0073	3,3	23,8

RWJ445224	0,7624	0,2705	0,2478	0,4269	0,2908	68,1	45,9
RWJ447228	0,1239	0,1233	0,1269	0,1247	0,0019	1,5	13,4
RWJ553709	0,1277	0,1254	0,6980	0,3170	0,3299	104,1	34,1
RWJ659780	0,2665	0,3215	0,2605	0,2828	0,0336	11,9	30,4
RWJ662440	0,2395	0,3235	0,1333	0,2321	0,0953	41,1	24,9
RWJ663860	0,2646	0,1873	0,1293	0,1937	0,0679	35,0	20,8
RWJ664545	0,3590	0,2790	0,1515	0,2632	0,1047	39,8	28,3
RWJ665436	0,4690	0,5805	0,3349	0,4615	0,1230	26,6	49,6
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	1,1525	1,1269	1,1140	1,1311	0,0196	1,7	71,0
Без обработки	1,2057	1,2358	1,3132	1,2516	0,0555	4,4	78,6
AA/DMSO	0,2622	0,2073	0,2830	0,2508	0,0391	15,6	15,8
AA/Wnt3a/DMSO	1,3943	1,7976	1,8000	1,5922	0,2136	13,4	100,0
RWJ665588	0,1930	0,2223	0,2167	0,2107	0,0156	7,4	13,2
RWJ665862	0,1757	0,1813	0,1835	0,1802	0,0040	2,2	11,3
RWJ666167	0,1473	0,1880	0,1732	0,1695	0,0206	12,2	10,6
RWJ666168	0,1330	0,1362	0,1867	0,1520	0,0301	19,8	9,5
RWJ666205	0,8191	0,5493	0,6526	0,6737	0,1361	20,2	42,3
RWJ666213	0,4008	0,2779	0,3869	0,3552	0,0673	18,9	22,3
RWJ667045	0,1220	0,1248	0,1251	0,1240	0,0017	1,4	7,8
RWJ667046	0,2883	0,3308	0,5503	0,3898	0,1406	36,1	24,5
RWJ667069	0,2835	0,4024	0,5698	0,4186	0,1438	34,4	26,3
RWJ669182	0,3704	0,6073	0,5280	0,5019	0,1206	24,0	31,5
RWJ669327	0,2266	0,1815	0,2289	0,2123	0,0267	12,6	13,3
RWJ670804	1,0820	1,1862	1,1076	1,1253	0,0543	4,8	70,7

RWJ670908	0,3590	0,5457	0,6123	0,5057	0,1313	26,0	31,8
RWJ670984	0,2198	0,3564	0,3202	0,2988	0,0708	23,7	18,8
RWJ671232	0,2928	0,2920	0,3659	0,3169	0,0424	13,4	19,9
RWJ672667	0,3349	0,3013	0,3507	0,3290	0,0252	7,7	20,7
RWJ672932	0,1852	0,1924	0,2349	0,2042	0,0269	13,2	12,8
RWJ672934	0,2170	0,3003	0,1877	0,2350	0,0584	24,9	14,8
RWJ673313	0,3094	0,2515	0,1881	0,2497	0,0607	24,3	15,7
RWJ673515	1,8452	1,7710	1,5591	1,7251	0,1485	8,6	108,3
RWJ673829	0,7305	0,7067	0,6250	0,6874	0,0553	8,0	43,2
RWJ673830	0,2113	0,1800	0,1547	0,1820	0,0284	15,6	11,4
RWJ674239	1,5225	1,5912	0,1081	1,0739	0,8371	78,0	67,4
RWJ674240	0,4006	1,2807	0,1162	0,5992	0,6071	101,3	37,6
RWJ674241	0,1972	0,1839	0,1162	0,1658	0,0434	26,2	10,4
RWJ674320	0,1351	0,1318	0,1169	0,1279	0,0097	7,6	8,0
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	1,0568	1,0604		1,0586	0,0025	0,2	71,9
Без обработки	1,1544	0,9576		1,0560	0,1392	13,2	71,7
Только AA+DMSO	0,6329	0,8434		0,7382	0,1488	20,2	47,1
AA+Wnt3a+ DMSO	1,2704	1,8669		1,4229	0,2960	20,8	100,0
RWJ674817	0,5617	0,2098		0,3858	0,2488	64,5	19,9
RWJ674855	0,6850	0,5853		0,6352	0,0705	11,1	39,2
RWJ674855	0,7496	0,9187		0,8342	0,1196	14,3	54,5
RWJ675104	0,2320	0,2124		0,2222	0,0139	6,2	7,3

RWJ675260	0,8079	1,4391		1,1235	0,4463	39,7	76,9
RWJ675261	0,8310	0,7318		0,7814	0,0701	9,0	50,5
RWJ675266	1,0646	1,1384		1,1015	0,0522	4,7	75,2
RWJ675366	0,6344	1,0400		0,8372	0,2868	34,3	54,8
без клеток	0,1335	0,2070		0,1703	0,0520	30,5	3,3
RWJ675369	0,8643	0,4060		0,6352	0,3241	51,0	39,2
RWJ675430	1,7922	1,8533		1,8228	0,0432	2,4	130,9
RWJ675578	0,1914	0,2371		0,2143	0,0323	15,1	6,7
RWJ675605	1,8401	1,7563		1,7982	0,0593	3,3	129,0
RWJ675881	1,0301	1,0356		1,0329	0,0039	0,4	69,9
RWJ675946	0,1306	0,1338		0,1322	0,0023	1,7	0,3
RWJ675948	1,7143	1,6506		1,6825	0,0450	2,7	120,0
RWJ676061	0,4170	0,4956		0,4563	0,0556	12,2	25,4
RWJ676085	0,1772	0,2348		0,2060	0,0407	19,8	6,0
RWJ676137	1,0231	1,2392		1,1312	0,1528	13,5	77,5
RWJ676139	1,9718	2,0997		2,0358	0,0904	4,4	147,3
RWJ676431	1,5168	1,6872		1,6020	0,1205	7,5	113,8
RWJ676432	1,6935	1,9710		1,8323	0,1962	10,7	131,6
RWJ67657	1,2655	1,1829		1,2242	0,0584	4,8	84,7
RWJ676639	1,3481	1,3168		1,3325	0,0221	1,7	93,0
JNJ26511966	0,6444	0,7239		0,6842	0,0562	8,2	43,0
JNJ26511979	0,2046	0,3076		0,2561	0,0728	28,4	9,9
JNJ26512005	1,3627	1,0693		1,2160	0,2075	17,1	84,0
JNJ26533065	0,8722	0,9660		0,9191	0,0663	7,2	61,1
JNJ26533091	1,0332	0,4554		0,7443	0,4086	54,9	47,6
JNJ26533104	0,8775	0,7347		0,8061	0,1010	12,5	52,4
JNJ26533156	1,7865	1,2008		1,4937	0,4142	27,7	105,5
JNJ26714181	0,2396	0,1584		0,1990	0,0574	28,9	5,5

JNJ26714194	0,8122	1,0827		0,9475	0,1913	20,2	63,3
JNJ26714207	0,1342	0,1363		0,1353	0,0015	1,1	0,6
JNJ26714220	1,0462	0,5838		0,8150	0,3270	40,1	53,1
JNJ26875563	0,4586	0,2903		0,3745	0,1190	31,8	19,0
JNJ22791671	0,1277	0,1402		0,1340	0,0088	6,6	0,5
JNJ26893438	0,1258	0,1324		0,1291	0,0047	3,6	0,1
JNJ26941226	0,1219	0,1216		0,1218	0,0002	0,2	-0,5
JNJ28572128	0,4223	0,4721		0,4472	0,0352	7,9	24,7
JNJ28850601	0,1514	0,1396		0,1455	0,0083	5,7	1,4
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	0,7423	0,7081		0,7252	0,0242	3,3	87,7
Без обработки	0,4936	0,5689		0,5313	0,0532	10,0	59,8
Только AA+DMSO	0,1433	0,1939		0,1686	0,0358	21,2	7,6
AA+Wnt3a+ DMSO	0,6808	0,9406		0,8107	0,1837	22,7	100,0
JNJ17994873	0,2447	0,1331		0,1889	0,0789	41,8	10,6
JNJ17994899	0,1537	0,1302		0,1420	0,0166	11,7	3,8
без клеток	0,1163	0,1147		0,1155	0,0011	1,0	0,0
JNJ17994912	0,2994	0,2592		0,2793	0,0284	10,2	23,6
JNJ17994925	0,1353	0,2121		0,1737	0,0543	31,3	8,4
JNJ180125	0,1267	0,1419		0,1343	0,0107	8,0	2,7
JNJ18014061	0,1376	0,1676		0,1526	0,0212	13,9	5,3
JNJ18014074	0,1134	0,1103		0,1119	0,0022	2,0	-0,5
JNJ18018338	0,1318	0,1478		0,1398	0,0113	8,1	3,5

JNJ18018351	0,2569	0,2124		0,2347	0,0315	13,4	17,1
JNJ18047991	0,2674	0,2636		0,2655	0,0027	1,0	21,6
JNJ18055726	0,4357	0,3467		0,3912	0,0629	16,1	39,7
JNJ18077800	0,1265	0,1588		0,1427	0,0228	16,0	3,9
JNJ18157074	0,1662	0,2521		0,2092	0,0607	29,0	13,5
JNJ18157087	0,1596	0,1566		0,1581	0,0021	1,3	6,1
JNJ18157646	0,2725	0,1636		0,2181	0,0770	35,3	14,8
JNJ18157711	1,2256	1,0636		1,1446	0,1146	10,0	148,0
JNJ18157711	0,1134	0,1070		0,1102	0,0045	4,1	-0,8
JNJ19363357	0,1469	0,1495		0,1482	0,0018	1,2	4,7
JNJ19369233	0,1169	0,1122		0,1146	0,0033	2,9	-0,1
JNJ19369246	0,1595	0,1422		0,1509	0,0122	8,1	5,1
JNJ19370026	1,0484	1,0749		1,0617	0,0187	1,8	136,1
JNJ19376240	0,3012	0,2347		0,2680	0,0470	17,5	21,9
JNJ19386042	0,1267	0,1510		0,1389	0,0172	12,4	3,4
JNJ19410833	1,1902	1,1487		1,1695	0,0293	2,5	151,6
JNJ19410859	0,6400	0,7076		0,6738	0,0478	7,1	80,3
JNJ19410872	0,1701	0,1752		0,1727	0,0036	2,1	8,2
JNJ19558929	0,3435	0,3488		0,3462	0,0037	1,1	33,2
JNJ19567314	0,4032	0,3548		0,3790	0,0342	9,0	37,9
JNJ19567327	0,1602	0,1502		0,1552	0,0071	4,6	5,7
JNJ19567340	0,1604	0,2079		0,1842	0,0336	18,2	9,9
JNJ19567405	0,1646	0,1592		0,1619	0,0038	2,4	6,7
JNJ19573541	0,1779	0,2273		0,2026	0,0349	17,2	12,5
JNJ19574867	0,1225	0,1443		0,1334	0,0154	11,6	2,6
JNJ19574880	0,1300	0,1291		0,1296	0,0006	0,5	2,0
JNJ20948798	0,1263	0,1336		0,1300	0,0052	4,0	2,1
JNJ21192730	0,2778	0,1326		0,2052	0,1027	50,0	12,9

JNJ21194667	0,2569	0,1219		0,1894	0,0955	50,4	10,6
JNJ21196227	0,1640	0,1158		0,1399	0,0341	24,4	3,5
JNJ24843611	1,1486	0,8970		1,0228	0,1779	17,4	130,5
JNJ24843611	0,1358	0,1201		0,1280	0,0111	8,7	1,8
JNJ24326185	0,1257	0,1257		0,1257	0,0000	0,0	1,5
JNJ24843572	0,4676	0,4803		0,4740	0,0090	1,9	51,6
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	0,6935	0,7803		0,7369	0,0614	8,3	104,8
Без обработки	0,4735	0,6069		0,5402	0,0943	17,5	71,5
Только AA+DMSO	0,1428	0,1656		0,1542	0,0161	10,5	6,3
AA+Wnt3a+ DMSO	0,5702	0,8468		0,7085	0,1956	27,6	100,0
JNJ24843585	0,1599	0,2380		0,1990	0,0552	27,8	13,8
JNJ25753520	0,1287	0,1244		0,1266	0,0030	2,4	1,6
без клеток	0,1241	0,1100		0,1171	0,0100	8,5	0,0
JNJ25753403	0,1235	0,1152		0,1194	0,0059	4,9	0,4
JNJ25757173	0,1199	0,1278		0,1239	0,0056	4,5	1,1
JNJ25757173	0,1174	0,1162		0,1168	0,0008	0,7	-0,1
JNJ25757238	1,1100	0,9464		1,0282	0,1157	11,3	154,1
JNJ25758707	0,1247	0,1115		0,1181	0,0093	7,9	0,2
JNJ25758785	0,2640	0,1688		0,2164	0,0673	31,1	16,8
JNJ25758850	0,2313	0,1307		0,1810	0,0711	39,3	10,8
JNJ25758863	0,8639	0,9218		0,8929	0,0409	4,6	131,2
JNJ25873419	0,2540	0,2320		0,2430	0,0156	6,4	21,3

JNJ25887537	0,1809	0,3077		0,2443	0,0897	36,7	21,5
JNJ25900641	0,1892	0,1872		0,1882	0,0014	0,8	12,0
JNJ25900654	0,1967	0,2492		0,2230	0,0371	16,7	17,9
JNJ25900706	0,3346	0,1619		0,2483	0,1221	49,2	22,2
JNJ26047723	0,1106	0,1138		0,1122	0,0023	2,0	-0,8
JNJ26054912	0,1224	0,1445		0,1335	0,0156	11,7	2,8
JNJ26064571	0,1312	0,1270		0,1291	0,0030	2,3	2,0
JNJ26067626	0,1653	0,2114		0,1884	0,0326	17,3	12,0
JNJ26067652	0,1732	0,1467		0,1600	0,0187	11,7	7,2
JNJ26069901	0,1618	0,2754		0,2186	0,0803	36,7	17,2
JNJ26077883	1,0006	0,9631		0,9819	0,0265	2,7	146,2
JNJ26116922	0,6472	0,4319		0,5396	0,1522	28,2	71,4
JNJ26120601	0,1539	0,1469		0,1504	0,0049	3,3	5,6
JNJ26120614	0,1127	0,1309		0,1218	0,0129	10,6	0,8
JNJ26128726	0,6887	0,5860		0,6374	0,0726	11,4	88,0
JNJ26130403	0,1141	0,1094		0,1118	0,0033	3,0	-0,9
JNJ26134771	0,2774	0,1690		0,2232	0,0767	34,3	17,9
JNJ26150202	0,9482	1,1150		1,0316	0,1179	11,4	154,6
JNJ26153647	0,7687	0,6804		0,7246	0,0624	8,6	102,7
JNJ26158015	0,7125	0,3347		0,5236	0,2671	51,0	68,7
JNJ26158054	0,1446	0,1221		0,1334	0,0159	11,9	2,7
JNJ26158093	1,0968	1,3108		1,2038	0,1513	12,6	183,8
JNJ26158106	0,3167	0,3415		0,3291	0,0175	5,3	35,8
JNJ26161343	0,1261	0,1144		0,1203	0,0083	6,9	0,5
JNJ26170794	0,2223	0,2930		0,2577	0,0500	19,4	23,8
JNJ26170820	0,1265	0,1236		0,1251	0,0021	1,6	1,3
JNJ26170833	1,1940	0,9431		1,0686	0,1774	16,6	160,9
JNJ26177086	1,0689	0,6879		0,8784	0,2694	30,7	128,7

JNJ26177762	1,0444	0,7603		0,9024	0,2009	22,3	132,8
JNJ26184457	0,1443	0,1209		0,1326	0,0165	12,5	2,6
JNJ26219050	0,1152	0,1309		0,1231	0,0111	9,0	1,0
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеква-дратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициони-рованная среда	0,7590	0,7451		0,7521	0,0098	1,3	98,0
Без обработки	0,5687	0,4490		0,5089	0,0846	16,6	60,4
Только AA+DMSO	0,1988	0,1522		0,1755	0,0330	18,8	8,9
AA+Wnt3a+ DMSO	0,6837	0,8460		0,7649	0,1148	15,0	100,0
JNJ26219063	0,1911	0,1101		0,1506	0,0573	38,0	5,0
JNJ26220454	0,2772	0,1151		0,1962	0,1146	58,4	12,1
без клеток	0,1278	0,1084		0,1181	0,0137	11,6	0,0
JNJ26241774	0,1443	0,2120		0,1782	0,0479	26,9	9,3
JNJ26241917	0,4413	0,2238		0,3326	0,1538	46,2	33,2
JNJ26243204	0,1098	0,1085		0,1092	0,0009	0,8	-1,4
JNJ26247143	0,1389	0,2147		0,1768	0,0536	30,3	9,1
JNJ26248729	0,1852	0,1342		0,1597	0,0361	22,6	6,4
JNJ26261105	0,1114	0,1295		0,1205	0,0128	10,6	0,4
JNJ26361712	0,5375	0,6158		0,5767	0,0554	9,6	70,9
JNJ26361725	0,1259	0,1441		0,1350	0,0129	9,5	2,6
JNJ26366730	0,1206	0,1312		0,1259	0,0075	6,0	1,2
JNJ26367991	0,2269	0,2857		0,2563	0,0416	16,2	21,4
JNJ26367991	0,1140	0,1079		0,1110	0,0043	3,9	-1,1
JNJ26399906	0,9589	0,8868		0,9229	0,0510	5,5	124,4

JNJ26399906	1,0442	0,9622		1,0032	0,0580	5,8	136,8
JNJ26399945	0,1961	0,1735		0,1848	0,0160	8,6	10,3
JNJ26399971	0,5732	0,5216		0,5474	0,0365	6,7	66,4
JNJ26399984	0,1273	0,1217		0,1245	0,0040	3,2	1,0
JNJ26399997	0,5932	0,6671		0,6302	0,0523	8,3	79,2
JNJ26400049	0,1444	0,1368		0,1406	0,0054	3,8	3,5
JNJ26483197	1,0786	1,0891		1,0839	0,0074	0,7	149,3
JNJ26483310	0,5418	0,2338		0,3878	0,2178	56,2	41,7
JNJ26483223	0,1268	0,2052		0,1660	0,0554	33,4	7,4
JNJ26483236	0,1169	0,1184		0,1177	0,0011	0,9	-0,1
JNJ26483249	0,8618	1,0400		0,9509	0,1260	13,3	128,8
JNJ26483249	0,8430	1,0187		0,9309	0,1242	13,3	125,7
JNJ26483262	0,3659	0,3168		0,3414	0,0347	10,2	34,5
JNJ26511901	0,9184	0,8116		0,8650	0,0755	8,7	115,5
JNJ26511927	0,2384	0,3156		0,2770	0,0546	19,7	24,6
JNJ26511953	0,2297	0,1469		0,1883	0,0585	31,1	10,9
RWJ67694	0,1955	0,1256		0,1606	0,0494	30,8	6,6
RWJ676940	0,1658	0,1704		0,1681	0,0033	1,9	7,7
RWJ677545	0,1399	0,1303		0,1351	0,0068	5,0	2,6
RWJ678986	0,1234	0,1236		0,1235	0,0001	0,1	0,8
RWJ680665	0,1397	0,2147		0,1772	0,0530	29,9	9,1
RWJ680667	0,1218	0,1310		0,1264	0,0065	5,1	1,3
RWJ680668	0,1456	0,1981		0,1719	0,0371	21,6	8,3
RWJ680669	0,5412	0,1898		0,3655	0,2485	68,0	38,2
RWJ680858	0,1996	0,1245		0,1621	0,0531	32,8	6,8
RWJ680858	0,1418	0,2014		0,1716	0,0421	24,6	8,3
RWJ680879	0,1106	0,1197		0,1152	0,0064	5,6	-0,5
RWJ680885	0,1159	0,1272		0,1216	0,0080	6,6	0,5

JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквад-ратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициониро-ванная среда	0,8077	0,7210		0,7644	0,0613	8,0	74,7
без обработки+DMSO	0,4638	0,4073		0,4356	0,0400	9,2	36,7
AA/Wnt3a	0,8466	0,9935		0,9830	0,2592	26,4	100,0
JNJ10222784	0,8095	0,9055		0,8575	0,0679	7,9	85,5
JNJ10222927	0,3519	0,4708		0,4114	0,0841	20,4	33,9
JNJ10231273	0,1609	0,1275		0,1442	0,0236	16,4	3,1
JNJ10259847	0,5020	0,2733		0,3877	0,1617	41,7	31,2
JNJ10259847	0,3413	0,4146		0,3780	0,0518	13,7	30,1
JNJ17154215	0,1176	0,1174		0,1175	0,0001	0,1	0,0
JNJ17154215	0,1148	0,1410		0,1279	0,0185	14,5	1,2
JNJ17157659	0,2394	0,2450		0,2422	0,0040	1,6	14,4
JNJ17163042	0,3672	0,3098		0,3385	0,0406	12,0	25,5
JNJ10166565	0,2722	0,1593		0,2158	0,0798	37,0	11,3
JNJ17174664	0,5079	0,4349		0,4714	0,0516	11,0	40,9
JNJ17187027	0,1076	0,1168		0,1122	0,0065	5,8	-0,6
JNJ17187053	0,2569	0,2151		0,2360	0,0296	12,5	13,7
JNJ17193774	0,2846	0,4376		0,3611	0,1082	30,0	28,1
JNJ17200976	0,1168	0,1136		0,1152	0,0023	2,0	-0,3
JNJ17205955	0,1168	0,1152		0,1160	0,0011	1,0	-0,2
JNJ17205955	0,1137	0,1195		0,1166	0,0041	3,5	-0,1
JNJ17205994	0,1154	0,1152		0,1153	0,0001	0,1	-0,3
JNJ17226703	0,2188	0,2353		0,2271	0,0117	5,1	12,6
JNJ17982133	0,4588	0,2521		0,3555	0,1462	41,1	27,5

JNJ17989049	0,3081	0,1961		0,2521	0,0792	31,4	15,5
JNJ №	Исходные данные			Среднее значение	Среднеквадратическое отклонение	Коэффициент вариации, %	% контрольного образца
Кондициониро-ванная среда	0,7914	1,1189		0,9552	0,2316	24,2	93,3
Без обработки	0,4215	0,5259		0,4737	0,0738	15,6	39,8
без клеток	0,1152	0,1160		0,1156	0,0006	0,5	0,0
AA/Wnt3a	0,7168	0,8836		1,0151	0,2016	19,9	100,0
RWJ680991	0,2882	0,2308		0,2844	0,0499	17,6	18,8
RWJ680992	0,3049	0,2845		0,3127	0,0282	9,0	21,9
RWJ680993	0,5403	0,2570		0,3855	0,1332	34,6	30,0
RWJ681140	0,7323	0,3034		0,4388	0,2041	46,5	35,9
RWJ681142	0,1185	0,1216		0,1199	0,0018	1,5	0,5
RWJ681146	0,2496	0,2683		0,2302	0,0376	16,3	12,7
RWJ681945	0,1548	0,1356		0,1513	0,0134	8,8	4,0
RWJ68198	0,1555	0,1450		0,1581	0,0161	10,2	4,7
RWJ682205	0,2347	0,1920		0,3785	0,2589	68,4	29,2
RWJ447228	0,1842	0,2093		0,3793	0,2585	68,2	29,3
RWJ675430	0,7223	0,8707		0,4291	0,2452	57,2	34,8
RWJ355923	0,6268	0,3192		0,3354	0,1667	49,7	24,4

Таблица VII Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Сильно положительные результаты			Умеренно положительные результаты
>=120% контрольного образца			60-120% контрольного образца
JNJ №	% контрольного значения		JNJ №	% контрольного значения
RWJ352628	195,3		JNJ26511901	115,5
JNJ26158093	183,8		RWJ676431	113,8
RWJ353258	180,4		RWJ673515	108,3
JNJ26170833	160,9		JNJ26533156	105,5
JNJ26150202	154,6		JNJ26153647	102,7
JNJ25757238	154,1		RWJ676639	93,0
JNJ19410833	151,6		JNJ26128726	88,0
JNJ26483197	149,3		JNJ10222784	85,5
JNJ18157711	148,0		RWJ67657	84,7
RWJ676139	147,3		JNJ26512005	84,0
JNJ26077883	146,2		JNJ19410859	80,3
RWJ352190	142,3		JNJ26399997	79,2
JNJ26399906	136,8		RWJ676137	77,5
JNJ19370026	136,1		RWJ675260	76,9
JNJ26177762	132,8		RWJ355923	76,7
RWJ676432	131,6		RWJ675266	75,2
JNJ25758863	131,2		JNJ26116922	71,4
RWJ675430	130,9		JNJ26361712	70,9
JNJ24843611	130,5		RWJ670804	70,7
RWJ675605	129,0		RWJ675881	69,9

JNJ26483249	128,8		JNJ26158015	68,7
JNJ26177086	128,7		RWJ352244	68,2
JNJ26483249	125,7		RWJ674239	67,4
JNJ26399906	124,4		JNJ26399971	66,4
RWJ675948	120,0		JNJ26714194	63,3
			JNJ26533065	61,1

Таблица VIII Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентра-ция	JNJ10220067		JNJ17163796		JNJ17189731		JNJ17223375		JNJ18157698
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD
10	1,006	0,051	0,039	0,049	0,193	0,147	1,280	0,014	1,049	0,062
5	1,058	0,047	1,164	0,018	0,889	0,035	1,348	0,007	1,104	0,014
2,5	1,031	0,054	1,022	0,023	0,896	0,035	1,318	0,028	0,932	0,087
1,25	0,899	0,040	1,121	0,023	1,120	0,072	1,159	0,041	1,006	0,023
0,625	0,742	0,095	1,092	0,044	1,107	0,093	1,029	0,018	0,832	0,026
0,313	0,754	0,010	0,931	0,056	1,132	0,018	1,018	0,044	0,742	0,127
0,156	0,822	0,074	0,804	0,002	1,082	0,041	0,776	0,054	0,712	0,020

Концентра-ция	JNJ26158015		JNJ26483197		JNJ26483249			JNJ17225871		JNJ17228458
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток		SD	Число клеток	SD
10	0,001	0,001	0,096	0,103	0,058	0,074	0,290		0,307	0,000	0,000
5	0,034	0,035	0,262	0,268	0,173	0,207	0,458		0,263	0,089	0,067
2,5	0,566	0,461	0,592	0,019	0,428	0,326	0,640		0,104	0,438	0,050
1,25	0,897	0,103	1,124	0,101	0,850	0,238	0,739		0,129	0,636	0,016
0,625	0,921	0,122	1,106	0,056	0,910	0,061	0,805		0,036	0,736	0,025
0,313	1,028	0,069	0,888	0,213	0,868	0,131	0,785		0,094	0,791	0,038
0,156	1,027	0,067	0,890	0,079	0,742	0,051	0,774		0,027	0,832	0,005
Концентра-ция	JNJ19370026		JNJ26150202		JNJ26170833			JNJ26177086		JNJ26177762
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток		SD	Число клеток	SD
10	0,000	0,000	0,496	0,690	0,129	0,170	0,412		0,081	0,996	0,246
5	0,024	0,034	0,768	0,490	0,530	0,080	1,128		0,026	0,908	0,179
2,5	1,097	0,294	1,001	0,129	1,174	0,016	1,031		0,217	1,005	0,086
1,25	1,446	0,076	1,158	0,043	1,113	0,057	0,914		0,100	1,200	0,085
0,625	1,296	0,183	0,699	0,248	1,188	0,041	0,801		0,136	1,111	0,300
0,313	1,034	0,197	0,617	0,232	1,158	0,102	0,785		0,121	0,959	0,094
0,156	0,826	0,030	0,812	0,120	0,974	0,065	0,659		0,068	0,912	0,059

Концентра-ция	JNJ26512005		JNJ26533065		JNJ26533156			JNJ26714194		JNJ3026582
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток		SD	Число клеток	SD
10	0,000	0,000	0,021	0,027	0,002	0,002	0,052		0,067	0,053	0,024
5	0,000	0,000	0,339	0,254	1,011	0,499	1,161		0,134	0,905	0,036
2,5	0,192	0,233	1,350	0,170	1,724	0,042	1,293		0,020	1,019	0,015
1,25	0,552	0,458	1,277	0,101	1,652	0,032	1,213		0,087	1,163	0,062
0,625	0,895	0,054	0,713	0,151	1,357	0,023	1,025		0,045	1,231	0,152
0,313	0,734	0,075	0,665	0,207	1,213	0,177	1,241		0,031	1,216	0,007
0,156	0,594	0,078	0,469	0,465	1,206	0,142	1,041		0,007	1,103	0,065

Таблица IX Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентрация	JNJ10220067		JNJ17163796		JNJ171B9731		JNJ17223375			JNJ18157698
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD		Интенсивность Sox17		SD
10	0,889	0,144	0,029	0,034	0,140	0,095	1,183	0,044		0,969		0,040
5	1,004	0,021	0,824	0,035	0,785	0,077	1,171	0,010		1,013		0,002
2,5	1,023	0,092	0,849	0,003	0,842	0,032	1,169	0,031		0,838		0,068
1,25	0,954	0,100	0,985	0,082	1,028	0,043	1,106	0,006		0,940		0,071
0,625	0,793	0,135	0,986	0,059	1,016	0,000	0,931	0,033		0,767		0,014
0,313	0,803	0,048	0,916	0,028	1,058	0,017	0,943	0,056		0,692		0,167
0,156	0,941	0,106	0,822	0,036	1,039	0,015	0,789	0,074		0,651		0,032
Концентрация	JNJ26158015		JNJ26483197		JNJ26483249		JNJ17225871			JNJ17228458
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD			Интенсивность Sox17		SD
10	0,001	0,001	0,034	0,027	0,054	0,063	0,267		0,280		0,000		0,001
5	0,017	0,020	0,071	0,054	0,141	0,169	0,402		0,229		0,056		0,035

2,5	0,200	0,157		0,497	0,076		0,373		0,326	0,605	0,041		0,286		0,034
1,25	0,792	0,066		0,993	0,144		0,783		0,282	0,686	0,185		0,587		0,023
0,625	0,624	0,118		1,061	0,066		0,887		0,062	0,786	0,061		0,695		0,001
0,313	0,934	0,127		0,937	0,136		0,859		0,176	0,780	0,132		0,753		0,098
0,156	0,986	0,055		0,888	0,062		0,666		0,015	0,782	0,061		0,816		0,043
Концентрация	JNJ19370026			JNJ26150202			JNJ26170833			JNJ2G177086		JNJ26177762
[мкМ]	Интенсивность Sox17		SD	Интенсивность Sox17		SD	Интенсивность Sox17	SD		Интенсивность Sox17	SD			Интенсивность Sox17	SD
10	0,000		0,000	0,491		0,681	0,281	0,358		0,330	0,059			0,701	0,307
5	0,035		0,049	0,158		0,224	0,460	0,189		0,846	0,036			0,728	0,146
2,5	1,336		0,192	0,800		0,201	1,018	0,139		0,887	0,191			0,928	0,019
1,25	1,238		0,030	0,910		0,045	0,960	0,106		0,819	0,179			1,159	0,093
0,625	0,997		0,095	0,567		0,190	1,050	0,038		0,755	0,126			1,136	0,186
0,313	0,791		0,172	0,515		0,276	1,032	0,063		0,667	0,125			1,006	0,009
0,156	0,669		0,037	0,708		0,148	0,950	0,087		0,628	0,053			0,922	0,096

Концентрация	JNJ26512005		JNJ26533065		JNJ26533156		JNJ267U194		JNJ302G582
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD		Интенсивность Sox17	SD
10	0,000	0,000	0,018	0,021	0,002	0,001	0,054	0,062		0,074	0,048
5	0,000	0,000	0,235	0,174	1,052	0,281	1,250	0,177		1,006	0,070
2,5	0,270	0,382	1,153	0,223	1,459	0,074	1,186	0,069		1,120	0,038
1,25	0,678	0,434	1,055	0,046	1,322	0,078	1,112	0,038		1,122	0,009
0,625	0,978	0,021	0,569	0,124	1,173	0,015	0,913	0,005		1,241	0,230
0,313	0,742	0,048	0,555	0,118	1,102	0,165	1,140	0,036		1,231	0,012
0,156	0,508	0,049	0,451	0,443	1,060	0,126	0,998	0,006		1,034	0,008

Таблица X Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация	JNJ10220067		JNJ17163796		JNJ171B9731		JNJ17223375		JNJ18157698
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD
10	0,164	0,209	0,001	0,000	0,049	0,028	0,123	0,106	0,770	0,077
5	0,147	0,141	0,616	0,497	0,583	0,155	0,954	0,146	0,496	0,011
2,5	0,140	0,112	1,295	0,402	1,108	0,170	0,795	0,101	0,384	0,247
1,25	0,307	0,198	1,233	0,058	1,195	0,147	0,541	0,851	0,395	0,002
0,625	0,138	0,071	0,606	0,121	1,108	0,014	0,332	0,849	0,221	0,009
0,313	0,063	0,008	0,397	0,020	0,887	0,078	0,206	0,085	0,172	0,071
0,156	0,069	0,001	0,214	0,025	0,699	0,109	0,142	0,039	0,138	0,048
Концентрация	JNJ26158015		JNJ26483197		JNJ26483249		JNJ17225871		JNJ17228458
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD
10	0,001	0,000	0,785	0,192	0,208	0,134	0,377	0,040	0,000	0,000
5	0,023	0,024	1,067	0,236	0,320	0,087	0,336	0,081	0,052	0,009
2,5	0,681	0,223	1,368	0,025	0,388	0,019	0,296	0,016	0,089	0,003
1,25	1,011	0,461	1,477	0,147	0,334	0,113	0,222	0,035	0,106	0,003
0,625	0,927	0,108	0,899	0,108	0,267	0,148	0,282	0,096	0,169	0,041
0,313	0,686	0,022	0,540	0,094	0,192	0,056	0,208	0,003	0,119	0,026
0,156	0,458	0,001	0,206	0,089	0,147	0,067	0,174	0,051	0,067	0,015
Концентрация	JNJ19370026		JNJ26150202		JNJ26170B33		JNJ26177086		JNJ26177762
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD

10	0,000	0,000	0,452	0,094	0,002	0,001	1,117	0,043	1,022	0,422
5	0,002	0,000	0,433	0,050	1,325	0,015	0,793	0,030	1,281	0,109
2,5	0,668	0,059	0,521	0,229	1,355	0,026	0,600	0,122	1,197	0,068
1,25	0,988	0,032	0,293	0,038	1,182	0,076	0,442	0,018	1,039	0,213
0,625	0,390	0,032	0,200	0,122	0,928	0,127	0,371	0,072	0,686	0,014
0,313	0,250	0,090	0,072	0,025	0,772	0,050	0,100	0,015	0,437	0,066
0,156	0,095	0,020	0,057	0,044	0,336	0,056	0,072	0,015	0,276	0,043
Концентрация	JNJ26512005		JNJ26533065		JNJ26533156		JNJ267U194		JNJ3026582
[мкМ]	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD	Число клеток	SD
10	0,007	0,002	0,000	0,000	0,000	0,000	0,044	0,038	0,004	0,001
5	0,002	0,001	0,127	0,069	0,415	0,023	0,382	0,110	0,017	0,003
2,5	0,001	0,001	0,151	0,059	0,425	0,082	0,345	0,001	0,033	0,037
1,25	0,090	0,097	0,108	0,051	0,325	0,042	0,284	0,076	0,044	0,028
0,625	0,248	0,058	0,230	0,168	0,314	0,062	0,266	0,021	0,100	0,099
0,313	0,264	0,048	0,086	0,033	0,267	0,098	0,347	0,084	0,057	0,032
0,156	0,133	0,069	0,063	0,004	0,218	0,012	0,192	0,014	0,070	0,048

Таблица XI Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация	JNJ10220067		JNJ17163796		JNJ171B9731		JNJ17223375		JNJ18157698
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD
0,157	0,051	0,003	0,132	0,003	0,678	0,093	0,116	0,047	0,095	0,025
0,313	0,052	0,008	0,311	0,005	0,951	0,010	0,155	0,071	0,110	0,030
0,625	0,103	0,058	0,453	0,076	1,160	0,013	0,277	0,061	0,154	0,013
1,25	0,312	0,255	1,012	0,051	1,042	0,134	0,459	0,066	0,317	0,062
2,5	0,100	0,062	0,986	0,269	0,869	0,158	0,726	0,079	0,297	0,235
5	0,105	0,089	0,480	0,423	0,432	0,111	1,114	0,066	0,353	0,080
10	0,121	0,141	0,002	0,002	0,022	0,005	0,140	0,110	0,694	0,123
Концентрация	JNJ26158015		JNJ26483197		JNJ26483249		JNJ17225871		JNJ17228458
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD
0,157	0,364	0,044	0,149	0,058	0,125	0,051	0,132	0,063	0,039	0,010

0,313	0,577	0,062	0,398	0,166	0,129	0,018	0,146	0,005	0,070	0,027
0,625	0,985	0,072	0,678	0,197	0,212	0,134	0,196	0,084	0,137	0,049
1,25	0,943	0,419	1,110	0,042	0,202	0,103	0,129	0,029	0,075	0,017
2,5	0,559	0,238	0,857	0,012	0,209	0,045	0,177	0,030	0,053	0,005
5	0,019	0,019	0,194	0,007	0,154	0,023	0,174	0,070	0,038	0,001
10	0,001	0,001	0,129	0,037	0,129	0,067	0,200	0,022	0,000	0,000
Концентрация	JNJ19370026		JNJ26150202		JNJ26170B33		JNJ26177086		JNJ26177762
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD
0,157	0,074	0,024	0,040	0,030	0,291	0,086	0,054	0,014	0,186	0,040
0,313	0,170	0,046	0,051	0,016	0,746	0,088	0,080	0,006	0,342	0,068
0,625	0,246	0,036	0,150	0,095	0,941	0,111	0,268	0,050	0,563	0,019
1,25	0,981	0,075	0,155	0,010	1,119	0,045	0,332	0,006	0,936	0,186
2,5	0,914	0,038	0,408	0,279	1,305	0,066	0,432	0,154	1,146	0,137
5	0,001	0,001	0,251	0,092	1,185	0,012	0,543	0,004	1,127	0,121
10	0,000	0,000	0,262	0,068	0,000	0,000	0,822	0,024	0,759	0,328

Концентрация	JNJ26512005		JNJ26533065		JNJ26533156		JNJ267U194		JNJ3026582
[мкМ]	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD	Интенсивность Sox17	SD
0,157	0,085	0,041	0,049	0,011	0,173	0,009	0,146	0,041	0,059	0,051
0,313	0,240	0,030	0,068	0,010	0,203	0,061	0,282	0,135	0,054	0,040
0,625	0,165	0,043	0,222	0,201	0,220	0,070	0,202	0,013	0,073	0,066
1,25	0,114	0,134	0,076	0,034	0,202	0,002	0,165	0,030	0,053	0,035
2,5	0,001	0,001	0,120	0,066	0,299	0,019	0,205	0,002	0,042	0,049
5	0,001	0,001	0,087	0,036	0,300	0,095	0,234	0,078	0,016	0,001
10	0,009	0,003	0,000	0,000	0,000	0,000	0,042	0,028	0,004	0,003