ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток

Классы МПК:C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):СЕНТОКОР ОРТО БАЙОТЕК ИНК. (US)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-04-22
публикация патента:

Настоящее изобретение касается способа размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток. Описанный способ включает стадии: культивирование плюрипотентных клеток и обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион. Представленное изобретение позволяет получить достаточное количество клеточного материала с сохранением способности к дифференцированию для последующего использования в клинических целях. 9 з.п. ф-лы, 15 ил., 11 табл., 11 пр.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обработки плюрипотентных клеток, позволяющему эффективно размножать плюрипотентные клетки в культуре и дифференцировать их путем обработки ингибитором активности фермента GSK-3B.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета I типа и нехватка островков Лангеранса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулинопродуцирующих клеток или способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеток, которые могли бы использоваться для трансплантации. Одним из возможных подходов является генерация функциональных способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеток из плюрипотентных клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3 beta, GATA-4, Mixl1, CXCR4 и SOX-17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX-1. В отсутствие PDX-1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорсального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX-1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

Для получения достаточного количества клеточного материала для трансплантации необходим источник требуемого клеточного материала, который можно было бы эффективно размножать в культуре, а затем эффективно дифференцировать в требуемые ткани, например в функциональные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клетки.

Известные на сегодняшний день способы культивации эмбриональных стволовых клеток человека достаточно сложны и требуют применения экзогенных факторов или культуральной среды химически определенного состава для поддержания пролиферации клеток без потери их плюрипотентности. Кроме того, дифференцирование эмбриональных стволовых клеток часто приводит к сокращению количества клеток, доступных для дальнейшего размножения в культуре.

В одном примере, в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005), описывается не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной заменяющей сыворотку среде (SR) с добавлением различных факторов роста, способных запускать самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере, US 20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может быть использована при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе данная среда является существенно изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. При культивировании клеток указанная среда содержит основную среду и количества bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточные для поддержания роста зародышевых стволовых клеток без их существенного дифференцирования.

В другом примере, WO 2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним из членов семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGFспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ), одним из членов семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Известно, что ингибиторы гликогенсинтазы киназы-3 (GSK-3) стимулируют пролиферацию и размножение стволовых клеток взрослой особи. В одном примере, Tateishi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635), показано, что ингибирование GSK-3 повышает эффективность роста и выживаемость сердечных стволовых клеток человека (hCSCs), выделенных из сердца новорожденного или взрослого человека и обладающих мезенхимальными признаками.

Например, в работе Rulifson et al. (PNAS 144, 6247-6252, (2007)) утверждается, что активация каскада передачи сигнала Wnt стимулирует пролиферацию островковых способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеток.

В другом примере, WO 2007016485, утверждается, что добавление ингибиторов GSK-3 к культуре неэмбриональных стволовых клеток, включая мультипотентные клетки-предшественники взрослых особей, приводит к поддержанию плюрипотентного фенотипа в процессе размножения и позволяет получить более четко выраженный дифференцировочный отклик.

В другом примере, US 2006030042, используется способ ингибирования GSK-3 путем добавления либо Wnt, либо низкомолекулярного ингибитора активности фермента GSK-3 для поддержания эмбриональных стволовых клеток без использования слоя питающих клеток.

В другом примере, WO 2006026473, сообщается о добавлении ингибитора GSK-3B для стабилизации плюрипотентных клеток через транскрибционную активацию c-myc и стабилизации белка c-myc.

В другом примере, WO 2006100490, сообщается об использовании культуральной среды для стволовых клеток, содержащей ингибитор GSK-3 и агонист gp130, для поддержания самовозобновляющейся популяции плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки мыши или человека.

В другом примере, Sato et al. (Nature Medicine (2004) 10:55-63), показано, что ингибирование GSK-3 специфическим фармакологическим препаратом может сохранять недифференцированный фенотип эмбриональных стволовых клеток и поддерживать уровень экспрессии специфичных для плюрипотентного состояния факторов транскрипции, таких как Oct-3/4, Rex-1 и Nanog.

В другом примере, Maurer et al. (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208), показано, что обработанные ингибитором GSK-3 нервные стволовые клетки взрослой особи демонстрируют более высокую эффективность нейронального дифференцирования, в особенности путем стимулирования транскрипции целевых генов способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -катенина и торможения апоптоза.

В другом примере, Gregory et al. (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106), сообщается, что ингибиторы GSK-3B повышают эффективность остеогенеза in vitro.

В другом примере, Feng et al. (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339), показано, что гемопоэтическое дифференцирование эмбриональных стволовых клеток связано с понижением эффективности каскада Wnt/способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -катенин, где Wnt представляет собой естественный ингибитор GSK3.

Поэтому сохраняется значительная потребность в разработке способов обработки плюрипотентных стволовых клеток для их размножения с последующим использованием в клинических целях и при этом с сохранением их способности к дифференцированию в панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки или панкреатические секретирующие гормоны клетки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток путем обработки упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

а. культивирование плюрипотентных клеток, и

b. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки человека или могут быть экспрессирующими маркеры плюрипотентности производными от эмбриональных стволовых клеток человека клетками в соответствии со способами, раскрытыми в публикации 60/913475.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 показан эффект добавления соединения JNJ 17189731 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 2 показан эффект добавления соединения JNJ 17163796 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 3 показан эффект добавления соединения JNJ 17223375 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 4 показан эффект добавления соединения JNJ 18157698 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 5 показан эффект добавления соединения JNJ 26158015 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 6 показан эффект добавления соединения JNJ 26483197 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 7 показан эффект добавления соединения JNJ 26483249 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 8 показан эффект добавления соединения JNJ 10220067 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 9 приведены уровни экспрессии CXCR4 на поверхности клеток, определенные способами иммунофлюоресцентного окрашивания и проточной цитометрии, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 10 приведены уровни экспрессии CXCR4 (часть A), HNF-3 beta (часть B) и Sox-17 (часть C), определенные методом ПЦР в реальном времени, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 11 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Pdx-1, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводились на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 12 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и HNF-6 (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 13 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 14 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и инсулина (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 15 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 11.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, приведенное ниже подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования клетки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточная линия дифференцирования» относится к клеткам, положительным по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и как минимум одного из следующих транскрипционных факторов: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования, включают способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клетки.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включают клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэндодермы и клетки сформированной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX-1, HNF-1 beta, PTF-1 alpha, HNF-6 и HB9. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, включают клетки панкреатической эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки, включают панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки и панкреатические секретирующие гормоны клетки, а также клетки способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, церберус, OTX2, гузекоид, C-Kit, CD99 и Mixl1.

Используемый в настоящей заявке термин «внеэмбриональная эндодерма» относится к популяции клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX-7, AFP и SPARC.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка мезэндодермы» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» или «панкреатическая экспрессирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая секретирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal и FGF8

Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like или FGF4.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, заключающийся в обработке упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

c. культивирование плюрипотентных клеток, и

d. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбраны из группы, включающей следующие маркеры: SOX17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. В рамках настоящего изобретения возможно использование клеток - производных плюрипотентных клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно одного до приблизительно 72 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно 12 до приблизительно 48 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение приблизительно 48 часов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 100 нМ до приблизительно 100 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации приблизительно 10 мкМ.

Соединения, пригодные для применения в способах, составляющих предмет настоящего изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ,

где:

R1 представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C1-5 алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила;

R2 представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила, который необязательно несет в качестве заместителя C1-4алкил, и по меньшей мере один из заместителей R1 и R2 представляет собой пиримидинил;

R3 представляет собой водород, 2-(триметилсилил)этоксиметил, C1-5алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, арил-C 1-5алкилоксикарбонил, арил-C1-5алкил, замещенный арил-C1-5алкил, где упомянутые один или несколько заместителей для арильного фрагмента каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C1-5алкил, C 1-5алкокси, галоген, амино, C1-5алкиламино и ди-C1-5алкиламино, фталимидо-C1-5алкил, амино-C1-5алкил, диаминоC1-5алкил, сукцинимидо-C 1-5алкил, C1-5алкилкарбонил, арилкарбонил, C 1-5алкилкарбонил-C1-5алкил и арилоксикарбонил-C 1-5алкил;

R4 представляет собой фрагмент -(A)-(CH2)q-X;

A представляет собой винилен, этинилен или способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ;

R5 выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-5алкила, фенила и фенил-C 1-5алкила;

q равен 0-9;

X выбран из следующей группы заместителей: водорода, гидрокси, винила, замещенного винила, где один или несколько заместителей для винильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, этинила, замещенного этинила, где заместители для этинильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, C1-5алкила, замещенного C1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкокси, тригалоалкила, фталимидо и амино, C3-7циклоалкила, C1-5алкокси, замещенного C1-5алкокси, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фталимидо и амино, фталимидоокси, фенокси, замещенный фенокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, фенила, замещенного фенила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, арил-C1-5алкила, замещенного арил-C1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для арильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5 алкокси, арилокси-C1-5алкиламино, C1-5алкиламино, ди-C1-5алкиламино, нитрила, оксима, бензилоксиимино, C1-5алкилоксиимино, фталимидо, сукцинимидо, C 1-5алкилкарбонилокси, фенилкарбонилокси, замещенного фенилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5 алкила, галогена и C1-5алкокси, фенил-C1-5 алкилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, аминокарбонилокси, C1-5алкиламинокарбонилокси, ди-C1-5алкиламинокарбонилокси, C1-5алкоксикарбонилокси, замещенного C1-5 алкоксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: метила, этила, изопропила и гексила, феноксикарбонилокси, замещенного феноксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, C1-5алкокси и галогена, C 1-5алкилтио, замещенного C1-5алкилтио, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: гидрокси и фталимидо, C1-5алкилсульфонила, фенилсульфонила, замещенного фенилсульфонила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: брома, фтора, хлора, C1-5алкокси и трифторметила; с тем условием, что если A представляет собой способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 , q равен 0, и X представляет собой H, то R3 не может представлять собой 2-(триметилсилил)этоксиметил; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R1 представляет собой замещенный фенил и R2 представляет собой пиримидин-3-ил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R1 представляет собой 4-фторфенил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R3 представляет собой водород, арил-C1-5алкил или замещенный арил-C1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R 3 представляет собой водород или фенил-C1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где A представляет собой этинилен и q равен 0-5.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где X представляет собой сукцинимидо, гидрокси, метил, фенил, C1-5алкилсульфонил, C3-6циклоалкил, C1-5алкилкарбонилокси, C1-5алкокси, фенилкарбонилокси, C1-5алкиламино, ди-C1-5алкиламино или нитрил.

Соединения формулы (I) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6214830, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

СоединениеНазвание
15(4)-(4-фторфенил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
24-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
35-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-4-(4-пиридил)имидазол,
44-(4-фторфенил)-2-йод-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
54-(4-фторфенил)-2-(4-гидроксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
64-(4-фторфенил)-5-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
75-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
85-(4-фторфенил)-2-йод-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
95-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-(триметилсилил)этинил-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
102-(2-хлорвинил)-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)имидазол,
115-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
122-[2,2-дибромэтилен-1-ил]-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
135(4)-(4-фторфенил)-2-(3-гидрокси-3-фенилпропин-1-ил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
145-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-2-оксиминоимидазол,
155-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-имидазола оксим,
16 2-(5-хлорпентин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
174-(4-фторфенил)-2-(4-N-фенилкарбамоилоксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
182-(4-хлорбутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол и
19 2-(4-диметиламинобутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение представляет собой соединение 5 формулы:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ,

где:

R выбран из следующей группы заместителей: Ra, -C1-8 алкил-Ra, -C2-8алкенил-Ra, -C 2-8алкинил-Ra и циано;

R a выбран из следующей группы заместителей: циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8 алкил-R5, -C2-8алкенил-R5, -C 2-8алкинил-R5, -C(O)-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-арил-R8, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-O-арил-R8, -C(O)-NH(C1-8 алкил-R9), -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-N(C 1-8алкил-R9)2, -SO2-(C 1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8 , -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R 6 и -гетероарил-R6; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента;

R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-8)алкила, -O-(C 1-8)алкил-OH, -O-(C1-8)алкил-O-(C1-8 )алкил, -O-(C1-8)алкил-NH2, -O-(C1-8 )алкил-NH(C1-8алкил), -O-(C1-8)алкил-N(C 1-8алкил)2, -O-(C1-8)алкил-S-(C 1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-SO2-(C 1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-SO2-NH 2, -O-(C1-8)алкил-SO2-NH(C1-8 алкил), -O-(C1-8)алкил-SO2-N(C1-8 алкил)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-8)алкил, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-8алкил), -O-C(O)-N(C 1-8алкил)2, -O-(C1-8)алкил-C(O)H, -O-(C1-8)алкил-C(O)-(C1-8)алкил, -O-(C 1-8)алкил-CO2H, -O-(C1-8)алкил-C(O)-O-(C 1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-C(O)-NH2 , -O-(C1-8)алкил-C(O)-NH(C1-8алкил), -O-(C 1-8)алкил-C(O)-N(C1-8алкил)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил, -CO2H, -C(O)-O-(C 1-8)алкил, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил), -C(O)-N(C1-8алкил) 2, -SH, -S-(C1-8)алкил, -S-(C1-8)алкил-S-(C 1-8)алкил, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8 )алкил, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-OH, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-NH2 , -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-NH(C 1-8алкил), -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8 )алкил-N(C1-8алкил)2, -S-(C1-8 )алкил-NH(C1-8алкил), -SO2-(C1-8 )алкил, -SO2-NH2, -SO2-NH(C 1-8алкил), -SO2-N(C1-8алкил) 2, -N-R7, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6 , -арил-R6 и -гетероарил-R6;

R6 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -C 2-8алкенила, -C2-8алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C 1-8)алкила, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкила, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8 алкила), -C(O)-N(C1-8)алкил)2, -SO 2-(C1-8)алкила, -SO2-NH2 , -SO2-NH(C1-8алкила), -SO2-N(C 1-8алкил)2, -(C1-8)алкил-N-R 7, -(C1-8)алкил-(гало)1-3, -(C 1-8)алкил-OH, -арил-R8, -(C1-8)алкил-арил-R 8 и -(C1-8)алкил-гетероарил-R8; с тем условием, что когда заместитель R6 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R6 может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C1-8 алкокси, -(C1-8)алкокси-(гало)1-3, -SH, -S-(C1-8)алкила, -N-R7, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R8;

R 7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -C2-8алкенила, -C2-8алкинила, -(C1-8 )алкил-OH, -(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкила, -(C1-8)алкил-NH2, -(C1-8)алкил-NH(C 1-8алкил), -(C1-8)алкил-N(C1-8алкил) 2, -(C1-8)алкил-S-(C1-8)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкила, -C(O)-O-(C1-8)алкила, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил), -C(O)-N(C 1-8алкил)2, -SO2-(C1-8 )алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C 1-8алкил), -SO2-N(C1-8алкил) 2, -C(N)-NH2, -циклоалкил-R8, -(C 1-8)алкил-гетероциклил-R8, -арил-R8 , -(C1-8)алкил-арил-R8 и -(C1-8 )алкил-гетероарил-R8;

R8 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -(C 1-8)алкил-(гало)1-3 и -(C1-8)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R8 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R8 может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C1-8 алкокси, -NH2, -NH(C1-8алкил), -N(C 1-8алкил)2, циано, гало, -(C1-8)алкокси-(гало) 1-3, гидрокси и нитро;

R9 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкокси, -NH 2, -NH(C1-8алкил), -N(C1-8алкил) 2, циано, (гало)1-3, гидрокси и нитро;

R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкил-R5, -C2-8алкенил-R5, -C2-8алкинил-R 5, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R9 ), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2, -C(O)-NH(арил-R 8), -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R 8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8 , -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R9 , -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8 )алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R 6, -арил-R6 и -(C1-8)алкил-N-R 7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C 1-8алкокси-R5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R 6;

R3 представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C 1-8алкил-R10, -C2-8алкенил-R 10, -C2-8алкинил-R10, -C1-8 алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R 9), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2 , -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8 , -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH 2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8 )алкил-R9, -SO2-арил-R8, -N-R 7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R 8, -гетероциклил-R8, -арил-R8 и -гетероарил-R 8;

R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C 1-8алкил-R10, -C2-8алкенил-R 10, -C2-8алкинил-R10, -C1-8 алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R 9), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2 , -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8 , -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH 2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R 9, -C(O)-O-арил-R8, -SH, -S-(C1-8 )алкил-R10, -SO2-(C1-8)алкил-R 9, -SO2-арил-R8, -SO2-NH 2, -SO2-NH(C1-8алкил-R9 ), -SO2-N(C1-8алкил-R9) 2, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R 8 и -гетероарил-R8;

R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH2, -NH(C1-8алкил), -N(C1-8алкил)2 , циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро и оксо; и

Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); а также их фармацевтически приемлемые соли.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R выбран из следующей группы заместителей: Ra, -C1-4 алкил-Ra, -C2-4алкенил-Ra, -C 2-4алкинил-Ra и циано.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где Ra выбран из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила и гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ra выбран из следующей группы заместителей: дигидропиранила, фенила, нафтила, тиенила, пирролила, имидазолила, пиразолила, пиридинила, азаиндолила, индазолила, бензофурила, бензотиенила, дибензофурила и дибензотиенила.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4 алкил-R5, -C2-4алкенил-R5, -C 2-4алкинил-R5, -C(O)-(C1-4)алкил-R 9, -C(O)-арил-R8, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R 9, -C(O)-O-арил-R8, -C(O)-NH(C1-4 алкил-R9), -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-N(C 1-4алкил-R9)2, -SO2-(C 1-4)алкил-R9, -SO2-арил-R8 , -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R 6 и -гетероарил-R6; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -арил-R6 и -гетероарил-R6; где гетероарил присоединен к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R 1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C 1-4алкил-R5 и -нафтил-R6.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-4)алкила, -O-(C1-4)алкил-OH, -O-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкила, -O-(C 1-4)алкил-NH2, -O-(C1-4)алкил-NH(C 1-4алкил), -O-(C1-4)алкил-N(C1-4алкил) 2, -O-(C1-4)алкил-S-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-SO2-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-SO2-NH2, -O-(C 1-4)алкил-SO2-NH(C1-4алкил), -O-(C 1-4)алкил-SO2-N(C1-4алкил)2 , -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-4)алкила, -O-C(O)-NH2 , -O-C(O)-NH(C1-4алкил), -O-C(O)-N(C1-4 алкил)2, -O-(C1-4)алкил-C(O)H, -O-(C 1-4)алкил-C(O)-(C1-4)алкил, -O-(C1-4 )алкил-CO2H, -O-(C1-4)алкил-C(O)-O-(C 1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-C(O)-NH2 , -O-(C1-4)алкил-C(O)-NH(C1-4алкил), -O-(C 1-4)алкил-C(O)-N(C1-4алкил)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -CO2H, -C(O)-O-(C 1-4)алкила, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2 , -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C1-4алкил) 2, -SH, -S-(C1-4)алкила, -S-(C1-4 )алкил-S-(C1-4)алкил, -S-(C1-4)алкил-O-(C 1-4)алкила, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4 )алкил-OH, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-NH 2, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-NH(C 1-4алкил), -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4 )алкил-N(C1-4алкил)2, -S-(C1-4 )алкил-NH(C1-4алкил), -SO2-(C1-4 )алкил, -SO2-NH2, -SO2-NH(C 1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил) 2, -N-R7, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6 , -арил-R6 и -гетероарил-R6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R 5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C 1-4)алкила, -N-R7, гидрокси и -гетероарил-R 6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-4)алкила, -N-R7, гидрокси, -имидазолил-R 6, -триазолил-R6 и -тетразолил-R6 .

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R6 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C2-4алкенила, -C 2-4алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -CO 2H, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -C(O)-NH2 , -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C 1-4)алкил)2, -SO2-(C1-4 )алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C 1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил) 2, -(C1-4)алкил-N-R7, -(C1-4 )алкил-(гало)1-3, -(C1-4)алкил-OH, -арил-R 8, -(C1-4)алкил-арил-R8 и -(C 1-4)алкил-гетероарил-R8; с тем условием, что когда заместитель R6 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R6 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси, -(C 1-4)алкокси-(гало)1-3, -SH, -S-(C1-4 )алкила, -N-R7, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R6 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C 2-4алкенила, -C2-4алкинила, -(C1-4 )алкил-OH, -(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкила, -(C1-4)алкил-NH2, -(C1-4)алкил-NH(C 1-4алкил), -(C1-4)алкил-N(C1-4алкил) 2, -(C1-4)алкил-S-(C1-4)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C 1-4алкил)2, -SO2-(C1-4 )алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C 1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил) 2, -C(N)-NH2, -циклоалкил-R8, -(C 1-4)алкил-гетероциклил-R8, -арил-R8 , -(C1-4)алкил-арил-R8 и -(C1-4 )алкил-гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C(O)H, -C(O)-(C 1-4)алкила, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -SO2 -NH2, -SO2-NH(C1-4алкил) и -SO 2-N(C1-4алкил)2.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R8 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -(C1-4)алкил-(гало)1-3 и -(C1-4)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R8 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R8 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси, -NH2, -NH(C1-4 алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, гало, -(C 1-4)алкокси-(гало)1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R8 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R9 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкокси, -NH2, -NH(C1-4 алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, (гало) 1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R9 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -C2-4 алкенил-R5, -C2-4алкинил-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-NH 2, -C(O)-NH(C1-4алкил-R9), -C(O)-N(C 1-4алкил-R9)2, -C(O)-NH(арил-R 8), -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R 8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8 , -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9 , -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-4 )алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R 6, -арил-R6 и -(C1-4)алкил-N-R 7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C 1-4алкокси-R5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R 6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R 5, -C2-4алкенил-R5, -C2-4 алкинил-R5, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4 )алкил-R9, -циклоалкил-R6, -арил-R 6 и -(C1-4)алкил-N-R7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси-R 5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R6 .

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R 5 и -арил-R6; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R 2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -N-R7, галогена, гидрокси и -гетероарил-R6 .

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R3 представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4алкенил-R 10, -C2-4алкинил-R10, -C1-4 алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкил-R 9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил-R 9), -C(O)-N(C1-4алкил-R9)2 , -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8 , -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH 2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R 9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8 )алкил-R9, -SO2-арил-R8, -N-R 7, -(C1-4)алкил-N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R 8, -арил-R8 и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R3 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4 алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10 , -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -CO2 H, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4 алкил)2, циано, галогена, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R 3 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -NH2 , -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2 , галогена и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4 алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10 , -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C 1-4)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C 1-4алкил-R9), -C(O)-N(C1-4алкил-R 9)2, -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R 8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8 , -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4 )алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SH, -S-(C 1-4)алкил-R10, -SO2-(C1-4 )алкил-R9, -SO2-арил-R8, -SO 2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил-R 9), -SO2-N(C1-4алкил-R9 )2, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R 8 и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4 алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10 , -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -CO2 H, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4 алкил)2, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкила, -гетероциклила, -арила и -гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C1-4алкил-R10, C1-4 алкокси-R10, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, галогена и гидрокси.

В одном из вариантов осуществлении настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C1-4алкил-R10, C1-4 алкокси-R10, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, хлора, фтора и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, (гало)1-3 , гидрокси, нитро и оксо.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (гало)1-3.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R 10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (фтор) 3.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z каждый независимо выбран из группы O и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z представляют собой атомы O.

Соединения формулы (II) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 7125878, полное раскрытие которого включено в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

СоединениеНазвание
13-(2-хлорфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
23-(2-хлорфенил)-4-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
33-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
4 3-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
53-(5-хлорбензо[ b]тиен-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
63-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(1H-индазол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
73-(1-этил-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
83-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
9 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(3-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
103-(2-хлор-4-фторфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
113-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-[2-(трифторметил)фенил]-1 H-пиррол-2,5-дион,
12 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(2-пиридинил)-1H-пиррол-2,5-дион,
133-[3-хлор-5-(трифторметил)-2-пиридинил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
143-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-тиенил)-1H -пиррол-2,5-дион,
15 3-(2,5-дихлор-3-тиенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
163-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пиразол-3-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
173-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1H-имидазол-2-ил)-1 H-пиррол-2,5-дион,
18 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
193-[1-(2-гидроксиэтил)-1 H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
203-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1 H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
213-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
223-[( E)-2-(4-фторфенил)этенил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H -пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
233-(3,4-дигидро-2 H-пиран-6-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
244-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-[3,3'-би-1H-пиррол]-2,5-дион,
253-(2-бензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
263-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H -пиразол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
272,5-дигидро-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-2,5-диоксо-1H -пиррол-3-карбонитрил,
28 3-дибензо[b,d]тиен-4-ил-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
293-(4-дибензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
303-(2-гидроксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
313-(3,4-диметоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
323-(3,4-дигидроксифенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
333-(2-метоксифенил)-4-[1-(2-нафталенил)-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
34[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1 H-пиррол-3-ил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]-карбаминовой кислоты 2-метилпропиловый эфир,
353-[1-(3-аминопропил)-1H-пирроло[2,3- b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
36N -[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]ацетамид,
37N -[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]сульфамид,
383-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(1 H-тетразол-1-ил)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1 H-пиррол-2,5-дион,
39 3-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(2H-тетразол-2-ил)пропил]-1 H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
403-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-пиразин-2-ил-пиррол-2,5-дион,
413-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
424-{3-[4-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил,
434-{3-[4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил и
44 3-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-(1-фенэтил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)пиррол-2,5-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ,

где

фрагменты A и E каждый независимо выбран из фрагмента CH и атома азота; где способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 выбран из следующей группы: 1H-индола, 1H- пирроло[2,3-b]пиридина, 1H-пиразоло[3,4-b ]пиридина и 1H-индазола;

Z представляет собой атом O; в качестве альтернативы Z представляет собой два атома водорода, где каждый атом водорода присоединен через одинарную связь;

R4 и R5 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C2-8алкенила и C2-8алкинила, необязательно несущие в качестве заместителей оксогруппы;

R 2 выбран из следующей группы заместителей: -C1-8 алкил-, -C2-8алкенил-, -C2-8алкинил-, -O-(C 1-8)алкил-O-, -O-(C2-8)алкенил-O-, -O-(C 2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп представляет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси(C1-8 )алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, -C(O)O-(C 1-8)алкила, -C1-8алкил-C(O)O-(C1-8 )алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкил), галогена, (гало)1-3(C 1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C1-8)алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C 1-8)алкила, гетероарил-(C1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C 1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3 (C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8 )алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила (где циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C 1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C 1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C 1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C 1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8 )алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы), -(O-(CH2 )1-6)0-5-O-, -O-(CH2)1-6 -O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2) 1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2) 1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)0-5 -NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6 -(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6 -O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH 2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2) 1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2 )1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR 6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH 2)1-6-NR7-, -NR6-(CH 2)1-6-NR7-(CH2)1-6 -NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6 -, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH 2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2 )0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH 2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR 7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2 )1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR 6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2 )1-6-NR6-(CH2)1-6 -S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH 2)1-6-NR7- и -SO2- (где R6, R7 и R8 независимо выбираются из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксил-(C 1-8)алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C 1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C 1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); с тем условием, что если в качестве A и E выбраны фрагменты CH, то заместитель R2 выбран из следующей группы заместителей: -C2-8алкинил-, -O-(C1-8)алкил-O-, -O-(C 2-8)алкенил-O-, -O-(C2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C 1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп предсталяет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C 1-8)алкила, -C(O)O-(C1-8)алкила, -C1-8 алкил-C(O)O-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3 (C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C1-8 )алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C 1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила, гетероарил-(C 1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C 1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C 1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкил (где циклоалкил необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C 1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3 (C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8 )алкила), -(O-(CH2)1-6)1-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6 -O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2) 1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2 )1-6)1-5-NR6-, -O-(CH2 )1-6-NR6-(CH2)1-6 -O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2) 1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6 )0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH 2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH 2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR 6-(CH2)1-6-NR7-, -NR 6-(CH2)1-6-NR7-(CH 2)1-6-NR8-, -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR 6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6 -(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6 -C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR 6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7 )-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6 -(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6 -NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH 2)1-6-NR6-(CH2)1-6 -S- и -NR6-(CH2)1-6-S-(CH 2)1-6-NR7- (где R6, R 7 и R8 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C1-8 алкокси-(C1-8)алкила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C 1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C 1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C 1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C 1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно дополнительно несет в качестве заместителей оксогруппы); и где R9 выбран из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси-(C1-8 )алкила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино-(C1-8 )алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C1-8 )алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C1-8 )алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C 1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C 1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C1-4алкила, амино-(C1-8 )алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало) 1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C 1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); и,

R1 и R3 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C2-8алкенила, C 2-8алкинила (где алкил, алкенил и алкинил необязательно несут заместитель, выбранный из следующей группы заместителей: C1-8алкокси, алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), (гало) 1-3, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало) 1-3(C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C 1-8)алкила и оксо), C1-8алкокси, C1-8 алкоксикарбонила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, C1-8алкилтио, арила, гетероарила (где арил и гетероарил необязательно несут заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C 1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкил (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C 1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила), амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), циано, галогена, гидрокси и нитро; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбираемое из следующей группы соединений:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбранное из следующей группы соединений:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 ,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Соединения формулы (III) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6828327, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

СоединениеНазвание
16,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23 H-5,26:17,22-диметено-5H-дипиридо[2,3-k:3',2'- q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
2 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1 H-дипиридо[2,3-n:3',2'-t]пирроло[3,4- q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2H )-дион,
3 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1 H-дипиридо[2,3-q:3',2'-w]пирроло[3,4- t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2 H)-дион,
4 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-дибензо[h,n]пирроло[3,4-k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21 H)-дион,
5 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
6 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1 H-дибензо[n,t]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2 H)-дион,
7 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1 H-дибензо[q,w]пирроло[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2 H)-дион,
8 12-гидро-6H,19H-5,22:13,18:7,11-триметенопиридо[2,3- j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20 H)-дион,
9 12-гидро-6H,19H-5,22:13,18-диметено-7,11-нитрилопиридо[2,3- j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20 H)-дион,
10 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-пиридо[2,3-k]пирроло[3,4-n][4,7,1,10]бензодиоксадиазациклооктадецин-20,22(21 H)-дион,
11 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-пиридо[2,3-n]пирроло[3,4-q][4,7,10,1,13]бензотриоксадиазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
12 11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
136,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23 H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k ,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
14 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(1-метилэтил)-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
157,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-8,11,14-триметил-6 H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[n,t ]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13]пентаазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
16 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23H-5,26-метено-17,22-нитрило-5 H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n ][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
1711-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23 H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[ k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
18 11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H,9H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4- n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H )-дион,
19 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5 H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4- n][1,7,4,10,19]диоксатиадиазациклогенейкозан-23,25(24H )-дион,
20 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-(6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3- n:3',2'-t]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
21 11-этил-7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-6H,23H -5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3-n:3',2'-t ]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
22 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22H-5,25:16,21-диметено-5 H-дипиридо[2,3-m:3',2'-s]пирроло[3,4- p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23H)-дион,
2310-этил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22 H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3-m:3',2'- s]пирроло[3,4-p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23 H)-дион,
24 7,8,9,15,16,17,18-гептагидро-6H,25H-5,28:19,24-диметено-10,14-нитрилодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклотрикозан-25,27(26 H)-дион,
25 7,8,9,10,11,13,14,15,16-нонагидро-6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклогенейкозан-12,23,25(24 H)-трион,
26 7,8,9,11,12,13,14-гептагидро-6H,21H-5,24:15,20-диметенодипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклононадецин-10,21,23(22 H)-трион,
27 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-7,14-дигидрокси-(7R ,14R)-22H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3- b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклоэйкозан-22,24(23 H)-дион,
28 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5 H-дипиридо[2,3-h:3',2'-n]пирроло[3,4- k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
296,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-метоксиэтил)-23 H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[ k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион,
30 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-гидроксиэтил)-23H -5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k, q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24 H)-дион и
31 6,7,9,10,12,13,14,15,16,17-декагидро-14-метил-24H-5,27:18,23-диметено-5 H-дибензо[l,r]пирроло[3,4-o][1,4,7,11,20]диоксатриазациклодокозан-24,26(25 H)-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

СоединениеНазвание
1aБудет представлено позднее
2a 3-[1-[3-[(2-гидроксиэтил)метиламино]пропил]-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(3-пиридинил)-1H-индол-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
3a3,5-дихлор-N-[3-хлор-4-[(3,4,12,12a-тетрагидро-1H-[1,4]тиазино[3,4-c][1,4]бензодиазепин-11(6H)-ил)карбонил]фенил]-бензамид,
4a3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
5a3-(2-метоксифенил)-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
6a6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]-3-пиридинкарбонитрил,
7a3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-имидазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
8a3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
9a3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
10aБудет представлено позднее
11a 3-[1-(3-гидрокси-3-метилбутил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
12a3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
13a3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
14a(11Z)-8,9,10,13,14,15-гексагидро-2,6:17,21-ди(метено)пирроло[3,4-h][1,15,7]диоксазациклотрикозан-22,24(1H,23H)-дион,
15a3-(5-хлор-1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
16a3-(2-метоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1H-пирроло[3,2-c]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
17a3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(тетрагидропиран-4-ил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
18a2-{3-[4-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]-индазол-1-ил}-N-(2-гидроксиэтил)-ацетамид,
19a4-(3-хлорфенил)-6-(3-диметиламинопропил)-5,6-дигидро-4H-2,4,6-триазациклопента[c]фтор-1,3-дион,
20a14-этил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
21a14-бензил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
22a3-(1-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)-этокси]-этил}-1H-индол-3-ил)-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
23a6,7,8,9,10,11,12,13-октагидро-8,11-диметил-5,23:14,19-диметено-20H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10]тетраазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
24a7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-декагидро-8,17-диметил-15H,26H-5,29:20,25-диметено-6H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19,22]диоксатетраазациклотетракозан-26,28(27H)-дион,
25a14-(2-фурилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
26a14-(2-тиенилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
27a14-(1-нафтилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
28a14-(пиридин-4-илметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
29a3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этокси]-этокси}-этил)-1H-индол-3-ил]-4-{1-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этил]-1H-индол-3-ил}-пиррол-2,5-дион,
30a3-[1-(3-диметиламинофенил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
31a3-[5-хлор-1-(6-диметиламинопиридин-3-ил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион и
32a 5-(5-хлор-3-{4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил}-индол-1-ил)-никотиновой кислоты метиловый эфир.

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

Клетки, пригодные для обработки, согласно способам, составляющим предмет настоящего изобретения

Плюрипотентные клетки, пригодные для использования в целях настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки. В альтернативном варианте осуществления упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, являющиеся производными от эмбриональных стволовых клеток человека. В одном из вариантов осуществления упомянутые эмбриональные стволовые клетки представляют собой клетки человека.

Выделение, размножение и культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Характеристика эмбриональных стволовых клеток человека: Эмбриональные стволовые клетки человека могут экспрессировать один или несколько стадий-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также обнаруживаемые антителами маркеры, обозначаемые как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (при ее наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. Недифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека, как правило, обладают щелочно-фосфатазной активностью, которую можно обнаружить путем фиксирования клеток 4% раствором параформальдегида с последующим проявлением с использованием красителя Vector Red в качестве субстрата, следуя рекомендациям производителя (Vector Laboratories, Бурлингем, Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые методом ОТ-ПЦР.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных эмбриональных стволовых клеток человека является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток человека может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для поиска клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциируемых с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии эмбриональных стволовых клеток человека могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получать клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники эмбриональных стволовых клеток человека: К типам эмбриональных стволовых клеток человека, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими настоящее изобретение примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые непосредственно из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивируемых в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовятся, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (U.S. Pat. № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека: В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эмбриональные стволовые клетки человека культивируют в культуральной системе, существенно свободной от питающих клеток, но, тем не менее, способной поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования. Рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

В альтернативном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека исходно культивируются на слое питающих клеток, который поддерживает эмбриональные стволовые клетки человека в различных отношениях. Затем эмбриональные стволовые клетки человека переносятся в культуральную систему, существенно свободную от питающих клеток, но тем не менее способную поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования.

Примеры соответствующей целям настоящего изобретения кондиционированной среды раскрыты в следующих публикациях: US 20020072117, US 6642048, WO 2005014799 и Xu et al. (Stem Cells 22:972-980, 2004).

Пример соответствующей целям настоящего изобретения среды с химически определенным составом можно найти в US 20070010011.

Соответствующая целям настоящего изобретения культуральная среда может быть приготовлена из следующих компонентов, таких как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092; модифицированная по способу Дульбекко нокаут-среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018; основная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека высевают на соответствующий культуральный субстрат, предварительно обработанный перед проведением обработки в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления упомянутая предварительная обработка состоит в нанесении компонента внеклеточного матрикса, такого как, например, полученного из базальной мембраны компонента или компонента, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления упомянутый соответствующий культуральный субстрат представляет собой субстрат, обработанный препаратом MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Engelbreth-Holm-Swarm, который при комнатной температуре превращается в гель, образуя восстановленную базальную мембрану.

В качестве альтернативы в этих целях могут использоваться и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. Последние могут включать ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.д. как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

Эмбриональные стволовые клетки человека высевают на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Выделение, размножение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека,

b. дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы, и

c. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека, и

b. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Культивирование клеток в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 1 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 5 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение приблизительно 15 дней.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 1% O2 до приблизительно 20% O2. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 2% O2 до приблизительно 10% O2. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода приблизительно 3% O2.

Клетки могут быть культивированы в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку, Activin A и лиганд Wnt. В качестве альтернативы упомянутая среда может также содержать IGF-1.

Концентрация сыворотки в упомянутой культуральной среде может находиться в диапазоне от приблизительно 2% до приблизительно 5%. В альтернативном варианте осуществления концентрация сыворотки может составлять приблизительно 2%.

Activin A может использоваться в концентрации от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. В альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 1 мкг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять приблизительно 100 нг/мл.

Упомянутый лиганд Wnt может выбираться из следующей группы лигандов: Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-7a. В одном из вариантов осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-1. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-3a.

Упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация лиганда Wnt составляет приблизительно 20 нг/мл.

IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация IGF-1 составляет приблизительно 50 нг/мл.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, способны к размножению при культивировании в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы маркеров: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример описанного способа раскрыт в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 24:1392-1401, (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбираются из группы, включающей Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 и PROX1. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбираются из группы, включающей NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. В одном из вариантов осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать как минимум один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую экспрессирующую гормоны клетку. В качестве альтернативы панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую секретирующую гормоны клетку.

В одном из аспектов настоящего изобретения упомянутая панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования, представляет собой способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клетку.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, может быть обнаружено путем проверки на наличие соответствующих маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Например, характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих факторов: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.

После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной области, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, характерным для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. К маркерам, характерным для линии панкреатических эндокринных клеток, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN-3, NeuroD, Islet-1.

Маркеры, характерные для клеток способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования. К специфичным характеристикам способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Pdx1 (ген панкреатического и дуоденального гомеобокса-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3beta и MafA, а также иных факторов. Такие факторы транскрипции широко используются в данной области для идентификации эндокринных клеток. См., например, обзор Edlund (Nature Reviews Genetics 3:524-632 (2002)).

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В качестве альтернативы эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 -клеточной линии дифференцирования.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение далее иллюстрируют, помимо прочих, следующие примеры.

Пример 1

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 были получены из института WiCell Research Institute, Inc., (Мэдисон, Висконсин, США) и культивировались в соответствии с инструкциями, предоставленными указанным выше институтом. Коротко говоря, клетки культивировали на питающем слое из мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в среде для эмбриональных стволовых клеток, содержащей DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) с добавлением 20% нокаут заменителя сыворотки, 100 нМ раствора заменимых аминокислот MEM, 0,5 мМ бетамеркаптоэтанола, 2мМ L-глутамина и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (bFGF) (все производства компании Invitrogen/GIBCO). Мышиные эмбриональные фибробласты, выделенные из мышиных эмбрионов E13-13,5, были приобретены в Charles River. Мышиные эмбриональные фибробласты размножали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Hyclone), 2 мМ глутамина и 100 мМ заменимых аминокислот MEM. Субконфлюэнтные культуры мышиных эмбриональных фибробластов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина C (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 3 часов для остановки деления клеток, затем обработали трипсином и высеяли с плотностью 2×104/см 2 на чашки, покрытые слоем 0,1% бычьего желатина. В качестве питающего слоя использовали мышиные эмбриональные фибробласты со второго по четвертый пассажи. Эмбриональные стволовые клетки человека, высеянные на питающий слой мышиных эмбриональных фибробластов, культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO 2/ в инкубаторе с увлажнением для тканевых культур. При начале слияния культур (приблизительно через 5-7 дней после нанесения) эмбриональные стволовые клетки человека обработали раствором коллагеназы типа IV с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen/GIBCO) в течение 5-10 мин и затем осторожно соскоблили с поверхности при помощи 5-мл пипетки. Клетки осадили центрифугированием при 900 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировали и снова высеяли с соотношением клеток от 1:3 до 1:4 в свежую культуральную среду.

Параллельно эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 также высеяли на носителе, покрытом слоем препарата MATRIGELспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 с пониженным содержанием факторов роста (BD Biosciences), в разведении 1:30 и культивировали в кондиционируемой среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Культивированные на препарате MATRIGELспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 клетки стандартно пассировали с использованием коллагеназы IV (Invitrogen/GIBCO), диспазы (BD Biosciences) или ферментативной смеси LIBERASE (Source). Некоторые культуры эмбриональных стволовых клеток человека инкубировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2).

Пример 2

Получение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Клетки линий H1 и H9 эмбриональных стволовых клеток человека различных пассажей (пассажи 30-54) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1.

Затем клетки обрабатывали средой DMEM/F12 с добавлением 0,5% FBS, 20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота, США) и 100 нг/мл Activin A (R&D Systems, Миннесота, США) в течение двух дней с последующей обработкой средой DMEM/F12 с добавлением 2% FBS и 100 нг/мл Activin A (AA) в течение еще 3-4 дней. Описанный протокол привел с существенному повышению уровней экспрессии маркеров сформированной эндодермы.

Затем клетки обработали раствором TrypLEспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Express (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Для некоторых культур в среду также добавили 10-50 нг/мл IGF-I (инсулиновый фактор роста-I, R&D Systems, Миннесота, США) или 1X ITS (инсулин, трансферрин и селен, Invitrogen, Калифорния, США). Для некоторых культур в основную среду (DM-F12+2% FBS) также добавили 0,1 мМ меркаптоэтанола (Invitrogen, Калифорния, США) и раствор заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США).

Через 5-15 дней культивирования на носителях образовались хорошо определенные колонии клеток, окруженные большим количеством клеток увеличенного размера, которые находились в фазе старения. При степени слияния 50-60% полученные культуры пассировали путем обработки раствором TrypLEспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Express в течение 5 минут при комнатной температуре. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM-F12+2% FBS, восстановили центрифугированием, высеяли с плотностью 10000 клеток/см 2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+/-50 нг/мл IGF-I. Указанная среда будет далее именоваться «ростовая среда».

Пример 3

Получение экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных из одноклеточной суспензии эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Эмбриональные стволовые клетки человека линий H1 (P33) и H9 (P45) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1. При степени слияния приблизительно 60% полученные культуры обрабатывали раствором TrypLEспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Express (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I+0,1 мМ меркаптоэтанол (Invitrogen, Калифорния, США) и растворе заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США) в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Клетки первого пассажа обозначаются P1.

Пример 4

Различные ростовые среды, пригодные для размножения экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности производные от эмбриональных стволовых клеток человека клетки успешно культивировали в средах перечисленного ниже состава в течение по меньшей мере 2-30 пассажей:

1. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A

2. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

3. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

4. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

5. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

6. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

7. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

8. Среда определенного состава HEScGRO (Chemicon, Калифорния, США)

Основной компонент перечисленных выше сред может быть заменен на другие подобные среды, такие как RPMI, DMEM, CRML, Knockout способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 DMEM и F12.

Пример 4

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток

Получение и поддержание экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток проводили, как описано в примере 2. Клетки выращивали в среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (Invitrogen), 100 нг/мл Activin A, 20 нг/мл Wnt-3a и 50 нг/мл IGF(R&D Biosystems). Клетки высеяли с плотностью 10000 клеток/см2 в полистирольные флаконы типа Falcon и выращивали в монослойной культуре при температуре 37°C, в атмосфере 5% CO2 и пониженной концентрации кислорода. При достижении степени слияния 60-70% полученные клетки пассировали путем промывания монослоя раствором PBS и инкубирования с раствором TrypLE (Invitrogen) в течение 3-5 минут для открепления клеток и получения одноклеточной суспензии.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрации 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Для проведения анализа экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки промыли, подсчитали и высеяли в нормальной культуральной среде с плотностью 20000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, состоящие из непрозрачных лунок с прозрачным дном (Costar). Предварительные эксперименты показали, что указанная плотность посева дает оптимальное образование монослоя при культивировании в течение одной ночи. На следующий день культуральную среду удалили, монослои клеток трижды промыли раствором PBS и в лунки добавили 80 мкл аликвоты испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа до конечной концентрации 10 мкМ. На 2 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на свежую аликвоту испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа. Среда для проведения анализа на 1 и 2 день культивирования состояла из среды DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A. На 3 и 4 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемых соединений). На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15 мкл MTS (Promega), планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов, и затем измерили оптические плотности лунок на длине волны 490 нм с помощью анализатора SpectraMax (Molecular Devices). Для каждого дублирующего набора рассчитали статистические характеристики: среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Для каждой лунки с испытываемым образцом также рассчитали токсичность относительно положительного контрольного образца (лунки, обработанные Activin A и Wnt3a на 1 и 2 день культивирования).

Сводка всех результатов скрининга приведена в таблице II. В данном анализе экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки изначально высеяли в виде слитного монослоя, поэтому полученные результаты адекватно отражают степень токсичности за четырехдневный период культивирования. Полученные результаты представлены в виде процентной доли выживаемости клеток по отношению к контрольному образцу и демонстрируют различную токсичность некоторых соединений при использованных для скрининга концентрациях 10 мкМ. Большинство испытанных соединений показали минимальную токсичность или оказались нетоксичны в проведенном клеточном анализе.

Небольшой набор выбранных соединений повторно проверили в узком диапазоне дозировок с использованием экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток в анализе, аналогичном описанному выше. В таблице III приведены полученные в этом анализе результаты, свидетельствующие о наличии эффекта варьирования дозировки для испытанного набора токсичных и нетоксичных соединений.

Пример 5

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на дифференцирование и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью одновременного многопараметрического анализа

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линия H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в увлажняемом боксе.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрацией 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Испытание соединений проводили в двух или трех повторностях. Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems), плюс 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS и только Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a (без обработки). На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемого соединения или Wnt3a); лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 2% FCS, без Activin A (без обработки).

По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы клетки зафиксировали ледяным 70% спиртом в течение ночи при температуре -20°C, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали раствором 0,5% Triton X-100 в течение 5 минут при температуре 4°C. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17 и козий античеловеческий HNF-3beta; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 5 мМ Draq5 (Alexis Biochemicals) на пять минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Draq5 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок с вторичными антителами только для необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по двенадцать проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность клеток для Sox-17 и HNF-3beta измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для повторностей рассчитали средние значения и их стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и их стандартных отклонений.

В таблице IV приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице V приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик. Параллельно в данном анализе значительное число соединений индуцировали дифференцирование, измеряемое по уровню экспрессии белков факторов транскрипции Sox17 и Hnf-3b.

Пример 6

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью спектрофотометра вертикального сканирования

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линии H9 или H1) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 площади монослоя для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в этих примерах линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в увлажняемом боксе.

Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems) и 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a. Скрининг соединений проводили в трех повторностях. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, за исключением лунок с отрицательными контрольными образцами, которые поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15-20 мкл MTS (Promega) и инкубировали планшеты при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов. Оптические плотности лунок на длине волны 490 нм измерили с помощью спектрофотометра вертикального сканирования Molecular Devices. Для каждого дублирующего набора рассчитали среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Результаты для каждой лунки с испытываемым образцом сравнили с результатом для положительного контрольного образца Activin A/Wnt3a и рассчитали степень пролиферации как процентную величину по отношению к контрольному образцу.

В таблице VI приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице VII приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик.

Пример 7

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека: титрование дозы эффективных соединений

Было важно подтвердить активность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, и далее титрованием дозы проанализировать диапазон активности. Свежие образцы выбранного подмножества соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, получили в виде сухих порошков, растворили для получения свежих маточных растворов и разбавили для проведения вторичных подтверждающих анализов по оценке их воздействия на эмбриональные стволовые клетки человека.

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека двух линий (H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии на покрытых препаратом Matrigel TM (Invitrogen) полистирольных носителях, используя для покрытия поверхности разведение 1:30 препарата MatrigelTM в среде DMEM:F12. Клетки разделили ферментативным пассированием со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании монослой клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-60 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линий H1 или H9 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом Matrigel TM 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO 2 в увлажняемом боксе.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных подтверждающих анализов использовали подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Двадцать соединений, доступных в виде сухих порошков, растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили 1:1000 до получения 10 мкМ раствора испытываемого соединения в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems). Полученные растворы далее последовательно разбавили вдвое, получив для каждого соединения кривые разбавления из семи точек, также используя для разбавления основную среду DMEM:F12 с 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A.

Вторичный скрининговый анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 100 мкл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами, в качестве необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Sox-17 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значение и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Sox17 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Приведены результаты для восьми ингибиторов фермента GSK-3B, где титрованием в описанном вторичном анализе была подтверждена активность ингибитора и определена его эффективность. Приведенные данные демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток и интенсивность Sox17, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии Sox17 является индикатором дифференцирования в линию сформированной эндодермы. Результаты по количеству клеток и интенсивности Sox17, полученные для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, приведены в таблицах VIII и IX, соответственно. Результаты для линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека приведены в таблицах X и XI. Величины для положительных контрольных образцов нормированы на 1,000 для численности клеток и интенсивности Sox17. Величины для отрицательных контрольных образцов составили менее чем 0,388 для численности клеток и менее чем 0,065 для интенсивности Sox17 для обеих клеточных линий. Графическое изображение полученных данных, со сравнением двух линий эмбриональных стволовых клеток человека и включением титрования дозы для каждого соединения, приведено на фиг. 1-8. Численность клеток представлена в части A; интенсивность Sox17 представлена в части B каждого рисунка. Приведенные данные подтверждают, что каждое соединение может стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека и их дифференцирование в клетки линии сформированной эндодермы, и указывают оптимальные диапазоны активности.

Пример 8

Эффект ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на уровни экспрессии дополнительных маркеров, ассоциируемых с линией дифференцирования сформированной эндодермы

Было важно показать способность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, в дополнение к фактору транскрипции Sox17 индуцировать также другие маркеры, характерные для дифференцирования по линии сформированной эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию CXCR4, белка поверхностного рецептора и HNF-3 beta, фактора транскрипции, который также ассоциирован с дифференцированием по линии сформированной эндодермы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGELTM (в разбавлении 1:30) 6-луночные планшеты (Corning) в объемах 2 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из семи соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5мкМ в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems).

Анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 2 мл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов с 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду, и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования монослои клеток промыли раствором PBS и собрали с культуральных планшетов путем инкубации с раствором TrypLEспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Express (Invitrogen) в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в кондиционированной среде MEF и разделили на пары равных образцов. Один набор образцов далее окрасили с помощью меченных различными флюоресцентными метками антител и анализировали способом проточной цитометрии (FACS). Второй параллельный набор образцов анализировали способом количественного ПЦР.

Клетки для цитометрического анализа промыли в растворе PBS и в течение 15 минут блокировали при температуре 4°C в 0, 125% растворе гамма-глобулина человека (Sigma, Кат. № G-4386), разведенного в растворе PBS и буфере для окрашивания BD FACS. Аликвоты клеток (приблизительно 105 клеток каждая) окрашивали в течение 30 минут при температуре 4°C антителами, непосредственно сопряженными с флюоресцентной меткой и специфичными по отношению к CD9 PE (BD № 555372), CD99 PE (Caltag № MHCD9904) или CXCR-4 APC (R&D Systems, Кат. № FAB173A). После ряда промывок в окрашивающем буфере BD FACS клетки окрасили 7-AAD (BD № 559925) для оценки их жизнеспособности и анализировали на анализаторе BD FACS Array (BD Biosciences), накапливая не менее 10000 событий. Для получения процентной доли положительных клеток использовали мышиные IgG1k изотипические контрольные антитела к PE и APC.

Клетки для количественного ПЦР обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (зондовая часть № 450025, прямая и обратная часть № 4304971).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

На фиг. 9 приведены результаты цитометрического анализа (FACS) процента положительных клеток с экспрессией поверхностного рецептора CXCR4 после обработки различными ингибиторами GSK3. Приведены данные для двух концентраций каждого соединения в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в сравнении с необработанной популяцией клеток (отрицательный контрольный образец) и клетками, обработанными Activin A и Wnt3 (положительный контрольный образец). На фиг. 10A, B и C приведены данные ПЦР в реальном времени для CXCR4, Sox17 и HNF3beta, которые также рассматриваются в качестве маркеров сформированной эндодермы. И цитометрический анализ, и анализ ПЦР в реальном времени свидетельствуют о значительном росте каждого из указанных маркеров в дифференцированных клетках относительно необработанных контрольных клеток. В ряде случаев уровни экспрессии указанных маркеров сформированной эндодермы оказались эквивалентны соответствующим уровням в положительных контрольных образцах, тем самым демонстрируя, что ингибитор GSK3 может заменить Wnt3a на этой стадии клеточной дифференцирования.

Пример 9

Эффект ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на формирование панкреатической эндодермы

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, клетки панкреатической эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию PDX1 и HNF6, ключевых факторов транскрипции, ассоциированных с дифференцированием по линии панкреатической эндодермы.

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линий H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL TM (в разбавлении 1:30) 24-луночные планшеты (черные лунки; Arctic White) в объеме 1 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Во втором эксперименте кластеры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека высеяли на 96-луночные планшеты с нанесенным питающим слоем из мышиных эмбриональных фибропластов, инактивированных обработкой митомицином C (Sigma Chemical Co). Культуральная среда для эмбриональных стволовых клеток человека на монослоях мышиных эмбриональных фибробластов состояла из среды DMEM:F12 с 20% нокаут-заменителем сыворотки (Invitrogen) с добавлением минимально необходимых незаменимых аминокислот (Invitrogen), L-глутамина и 2-меркаптоэтанола. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из восьми соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в основной среде с добавками.

Анализ: В этом анализе ингибиторы GSK3 вводили только на 1 и 2 день стадии дифференцирования по линии сформированной эндодермы, заменяя ими Wnt3a. Анализ культур эмбриональных стволовых клеток на покрытых препаратом MATRIGELTM носителях начали, как описано в примерах 7 и 8 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ циклопамина 3-кето-N-(аминоэтил-аминокапроил-дигидроциннамоила (KAAD) (EMD Biosciences) и 20 нг/мл фактора роста фибробластов FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Параллельно на питающих слоях мышиных эмбриональных фибробластов выращивали культуры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека и дифференцировали их в клетки панкреатической эндодермы. Дифференцирование сформированной эндодермы провели путем культивирования клеток в среде, состоящей из основной среды RPMI-1640 (Invitrogen), не содержащей сыворотки на 1 день и содержащей 0,2% FCS на 2 и 3 дни, с добавлением различных концентраций испытываемых ингибиторов и 100 нг/мл Activin A. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки) с 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки), без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой RPMI-1640 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 день поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS. Клетки дифференцировали в клетки линии панкреатической эндодермы путем четырехдневной обработки, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 50 нг/мл фактора роста фибробластов FGF10 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 50 нг/мл FGF10. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании дифференцирования клетки проанализировали методом ПЦР в реальном времени на уровни экспрессии генов, как описано в примере 8 выше. Для флюоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, снова трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Pdx1; Santa Cruz) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на два часа при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку после трехкратной промывки клеток раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Pdx1 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Pdx1 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E) и HNF6 (Hs00413554_m1).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 . Представленные на фиг. 11 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность Pdx1 (часть B) для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 12 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект описываемых низкомолекулярных ингибиторов на индуцированную экспрессию двух факторов транскрипции, Pdx1 и HNF6. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и HNF6 являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы. В проведенных анализах соединения-ингибиторы GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования; формируемые при этом клетки сохраняют способность к образованию панкреатической эндодермы в ходе последующих стадий дифференцирования.

Пример 10

Эффект ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3 на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, панкреатических эндокринных клеток или клеток, вырабатывающих инсулин. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию панкреатических гормонов.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примере 9 способами (культивированные на 96-луночных и 24-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGEL TM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на стадиях 2 и 3 все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems). Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примерах 7 и 8 выше, для анализа методами одновременного многопараметрического анализа или ПЦР в реальном времени.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM®7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN®использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), Insulin (Hs00355773) и GAPDH (4310884E).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла Ct как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3B. Представленные на фиг. 13 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 14 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект соединений для Pdx1 и инсулина. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и инсулина являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы и выработки гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и могут индуцировать и поддерживать формирование панкреатических бета-клеток в ходе последующих стадий дифференцирования, как показывают результаты и инсулинового иммуноокрашивания, и ПЦР в реальном времени.

Пример 11

Аддитивные эффекты ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 может улучшить дифференцирование панкреатических бета клеток, если ингибиторы добавляются на нескольких стадиях коммитирования клеток. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили методом последовательного добавления на способность повышать уровень экспрессии инсулина, ассоциируемый с панкреатическими гормон-положительными клетками.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примерах 9 и 10 способами (культивированные на 96-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGELTM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich) и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного шестидневного периода ингибиторы GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems), и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного трехдневного периода ингибиторы GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Лунки с параллельными положительными контрольными образцами обрабатывали в присутствии или в отсутствии 20 нг/мл Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примере 10 выше, для анализа методом одновременного многопараметрического анализа.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки опять трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 . Представленные на фиг. 15 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии инсулина является индикатором дифференцирования в линию панкреатических гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и, при добавлении на более поздних стадиях, стимулируют повышение уровня экспрессии инсулина по отношению к положительному контрольному образцу.

Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты настоящего изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения определяется не упомянутым выше описанием, а следующими ниже пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Таблица IA

Список первичных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
АнтителоПоставщик ИзотипКлон
SSEA-1Chemicon (Калифорния, США)Мышиный IgM MC-480
SSEA-3 Chemicon (Калифорния, США)Мышиный IgG3 MC-631
SSEA-4 Chemicon (Калифорния, США) Крысиный IgMMC-813-70
TRA 1-60Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgMTRA 1-60
TRA 1-81 Chemicon (Калифорния, США)Мышиный IgM TRA 1-81
TRA 1-85Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgG1TRA 1-85
AP R&D systemsМышиный IgG1 B4-78
HNF3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 R&D systems Козий IgGспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
PDX1 Santa Cruz Biotechnology, INCКозий IgG A-17
GATA4 R&D systemsКозий IgGспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
Sox 17 R&D systemsКозий IgG способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
CD 9 BDМышиный IgG1 M-L13

Таблица IB

Список вторичных сопряженных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
Вторичное сопряженное антителоПоставщик Разведе-ние
Козий антимышиный IgG, сопряженный с APCJackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)1:200
Козий антимышиный IgG, сопряженный с PE Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Ослиный антикроличий IgG, сопряженный с PE или APC Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Ослиный антикозий IgG, сопряженный с PE или APCJackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США)1:200
Козий анти-мышиный IgM, сопряженный с PE SouthernBiotech (Алабама, США)1:200
Козий антикрысиный IgM, сопряженный с PESouthernBiotech (Алабама, США) 1:200
Козий антимышиный IgG3, сопряженный с PESouthernBiotech (Алабама, США)1:200

Таблица II

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Исходные данные Среднее значениеСреднеквадра-тическое

отклонение
Коэффициент вариации, %% контрольного образца
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 (дублир.) способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
JNJ5226780 0,7850,7900,788 0,003820,48 94,0
JNJ10179026 0,1480,1520,150 0,002471,65 4,8
JNJ17154215 0,4270,4620,444 0,024965,62 46,0
JNJ17205955 0,6430,6380,641 0,003680,57 73,5
JNJ180125 0,7620,7620,762 0,000070,01 90,4
JNJ18157646 0,8500,8240,837 0,018242,18 101,0

JNJ193700260,911 0,8840,898 0,018812,10109,5
JNJ19567340 0,7230,7430,733 0,014211,94 86,4
JNJ7830433 0,1610,1690,165 0,005593,39 6,9
JNJ10179130 0,7670,7890,778 0,015562,00 92,6
JNJ17154215 0,5120,5550,533 0,030485,72 58,4
JNJ17205955 0,2820,2930,288 0,007922,75 24,1
JNJ18014061 0,7640,7230,743 0,028923,89 87,9
JNJ18157698 0,8530,8580,855 0,003820,45 103,5
JNJ19376240 0,8320,8370,834 0,003610,43 100,6
JNJ19567405 0,7260,7250,725 0,000420,06 85,3
JNJ8706646 0,1320,1370,134 0,003682,74 2,6
JNJ10182562 0,7970,7930,795 0,003460,44 95,1
JNJ17157659 0,7760,7870,782 0,007921,01 93,2
JNJ17205994 0,1640,1480,156 0,011317,24 5,6
JNJ18014074 0,4750,3830,429 0,0654815,26 43,8
JNJ18157698 0,8230,7740,798 0,034444,31 95,6
JNJ19386042 0,7810,7290,755 0,036494,83 89,5
JNJ19573541 0,1430,1490,146 0,003962,72 4,2
JNJ8710481 0,7160,7160,716 0,000140,02 84,1
JNJ10182562 0,8040,8020,803 0,001480,18 96,2
JNJ17163042 0,9000,8770,888 0,016261,83 108,2
JNJ17226703 0,8240,7990,812 0,017252,13 97,4
JNJ18018338 0,7440,8190,781 0,052616,73 93,2
JNJ18157711 0,9520,9660,959 0,009330,97 118,1
JNJ19410833 0,9520,9190,935 0,022772,43 114,8
JNJ19574867 0,7760,7770,777 0,000420,05 92,5
JNJ8710481 0,6910,6170,654 0,052548,03 75,4
JNJ10184655 0,1620,1340,148 0,0202213,66 4,5

JNJ101665650,791 0,6080,700 0,1294718,5081,8
JNJ17982133 0,1530,1290,141 0,0167611,87 3,5
JNJ18018351 0,7310,5850,658 0,1031715,68 75,9
DMSO 0,7890,7000,744 0,062798,44 88,0
JNJ19410859 0,9090,6750,792 0,1654620,88 94,7
JNJ19574880 0,1640,1510,157 0,009265,89 5,8
JNJ10148307 0,7060,6720,689 0,024043,49 83,9
JNJ10222784 0,6410,6010,621 0,028784,63 73,7
JNJ17174664 0,8820,7480,815 0,0950411,66 102,5
JNJ17989049 0,8220,8020,812 0,014001,72 102,1
JNJ18047991 0,7770,7640,771 0,009191,19 95,9
DMSO 0,7980,7710,785 0,019162,44 98,0
JNJ19410872 0,7910,7890,790 0,001340,17 98,7
JNJ20948798 0,6280,6400,634 0,008061,27 75,6
JNJ10164830 0,1490,1350,142 0,009696,81 2,7
JNJ10222927 0,8030,7820,792 0,014921,88 99,1
JNJ17187027 0,1250,1290,127 0,003182,51 0,4
JNJ17994873 0,3150,5420,428 0,1599537,34 45,2
JNJ18055726 0,8200,7480,784 0,050916,49 97,9
JNJ18157711 0,1540,1650,160 0,008065,05 5,3
JNJ19558929 0,7370,7300,734 0,004810,66 90,4
JNJ21192730 0,6590,6470,653 0,008131,25 78,5
JNJ10164895 0,1650,1540,159 0,007854,93 5,2
JNJ10231273 0,6370,5540,595 0,058769,87 69,9
JNJ17187053 0,6840,5880,636 0,0680910,71 76,0
JNJ17994899 0,7500,6240,687 0,0894513,02 83,5
JNJ18077800 0,6780,6180,648 0,042856,61 77,8
JNJ19363357 0,7770,6670,722 0,0775710,74 88,7

DMSO0,799 0,6490,724 0,1056414,5989,0
JNJ21194667 0,6480,6250,636 0,016622,61 76,0
JNJ10172058 0,6010,6200,611 0,013082,14 72,2
JNJ10259847 0,6950,7020,698 0,005520,79 85,2
JNJ17193774 0,5680,7090,639 0,0995615,59 76,4
JNJ17994912 0,6230,7650,694 0,1004114,46 84,6
JNJ18157074 0,7580,7620,760 0,002970,39 94,3
JNJ19369233 0,4870,4340,461 0,037698,18 49,9
JNJ19567314 0,6900,6860,688 0,002620,38 83,7
JNJ21196227 0,5350,5500,543 0,010892,01 62,1
JNJ10178727 0,7430,6380,691 0,0744610,78 84,1
JNJ10259847 0,6940,6030,649 0,064499,94 77,8
JNJ17200976 0,1600,1860,173 0,0182410,56 7,2
JNJ17994925 0,6620,5660,614 0,0678811,05 72,7
JNJ18157087 0,6000,5140,557 0,0610210,96 64,2
JNJ19369246 0,6850,5240,605 0,1142718,90 71,3
JNJ19567327 0,7310,5250,628 0,1455223,18 74,7
JNJ24843611 0,7150,5960,655 0,0843612,87 78,8
JNJ24843611 0,5920,5720,582 0,013932,39 70,0
JNJ25758785 0,6140,6110,613 0,001770,29 74,6
JNJ26064571 0,7660,8490,807 0,058697,27 104,3
JNJ26130403 0,8300,8130,822 0,011951,45 106,5
JNJ26170794 0,7270,7300,728 0,001980,27 92,2
JNJ26241774 0,7130,8360,774 0,0873311,28 99,3
JNJ26367991 0,7260,7190,722 0,005230,72 91,3
JNJ26483310 0,6460,6810,663 0,025103,78 82,4
JNJ24326185 0,6510,6490,650 0,001200,19 80,3
JNJ25758850 0,6420,6220,632 0,014072,23 77,5

JNJ260676260,843 0,6720,758 0,1209915,9796,7
JNJ26134771 0,7340,8150,774 0,057287,40 99,3
JNJ26170820 0,8230,7430,783 0,056997,28 100,6
JNJ26241917 0,8710,8740,872 0,002190,25 114,2
JNJ26714220 0,6520,6420,647 0,007211,12 79,8
JNJ26483223 0,6170,6330,625 0,011741,88 76,5
JNJ24843572 0,6570,6550,656 0,001340,20 81,2
JNJ25758863 0,6840,8090,746 0,0880311,80 95,0
JNJ26067652 0,9010,7350,818 0,1173114,34 106,0
JNJ26150202 0,7910,7680,779 0,015912,04 100,1
JNJ26170833 0,9480,7640,856 0,1298215,17 111,7
JNJ26243204 0,8210,6080,714 0,1503321,05 90,1
JNJ26399906 0,7450,6850,715 0,042435,94 90,2
JNJ26483236 0,6240,6180,621 0,004170,67 76,0
JNJ24843585 0,6520,6240,638 0,019163,00 78,5
JNJ25873419 0,7730,6620,718 0,0779210,86 90,6
JNJ26069901 0,8560,8340,845 0,015701,86 110,1
JNJ26153647 0,8280,8000,814 0,020082,47 105,4
JNJ26177086 0,8210,8410,831 0,014211,71 108,0
JNJ26247143 0,8160,7870,802 0,020722,58 103,5
JNJ26399906 0,7440,7370,741 0,004530,61 94,1
JNJ26483249 0,6990,6790,689 0,014642,12 86,3
JNJ25753520 0,1860,2080,197 0,015417,83 11,3
JNJ25887537 0,6650,6990,682 0,024323,57 85,2
JNJ26077883 0,8100,6830,746 0,0903012,10 95,0
JNJ26158015 0,1410,1620,151 0,015069,95 4,3
DMSO 0,7840,6050,695 0,1267118,25 87,1
JNJ26248729 0,7260,5900,658 0,0962414,63 81,5

JNJ263999450,635 0,6200,628 0,010681,7076,9
JNJ26483249 0,6970,6950,696 0,001130,16 87,3
JNJ25753403 0,1540,1530,154 0,000420,28 4,5
JNJ25900641 0,6160,6450,630 0,020723,29 82,1
JNJ22791671 0,9090,8300,869 0,056146,46 121,0
JNJ26158054 0,1500,1500,150 0,000280,19 3,9
JNJ26177762 0,9811,0561,018 0,053035,21 145,3
JNJ26261105 0,1660,1890,177 0,016269,19 8,3
JNJ26399971 0,7180,4510,584 0,1888732,34 74,6
JNJ26483262 0,6520,6470,649 0,003890,60 85,2
JNJ25757173 0,5030,5290,516 0,018603,61 63,5
JNJ25900654 0,6030,6090,606 0,004240,70 78,1
JNJ26116922 0,8560,7930,824 0,044195,36 113,7
JNJ26893438 0,8830,8480,866 0,025032,89 120,5
JNJ26184457 0,7790,7840,781 0,003680,47 106,7
JNJ26361712 0,8920,9140,903 0,015911,76 126,6
JNJ26399984 0,5440,5370,540 0,004600,85 67,5
JNJ26511901 0,5320,6820,607 0,1054317,37 78,3
JNJ25757173 0,6650,6450,655 0,014002,14 86,1
JNJ25900706 0,6760,6770,677 0,000350,05 89,7
JNJ26120601 0,9350,8070,871 0,0911510,47 121,3
JNJ26158093 0,9160,8590,887 0,039814,49 124,0
JNJ26219050 0,9070,8910,899 0,011241,25 125,9
JNJ26361725 0,9090,8960,902 0,009191,02 126,4
JNJ26399997 0,6820,7970,740 0,0811810,98 99,9
JNJ26511927 0,6790,6440,661 0,025103,80 87,2
JNJ25757238 0,3000,2230,261 0,0545220,88 22,0
JNJ26047723 0,1830,1750,179 0,005733,20 8,6

JNJ261206140,741 0,7280,734 0,008841,2099,1
JNJ26158106 0,9350,9060,921 0,020512,23 129,4
JNJ26219063 0,1310,1280,129 0,002121,64 0,5
JNJ26366730 0,1380,1370,138 0,000920,67 1,9
JNJ26400049 0,2410,2270,234 0,010324,41 17,6
JNJ26941226 0,6040,6390,622 0,024753,98 80,7
JNJ25758707 0,2470,1820,215 0,0461721,52 14,4
JNJ26054912 0,6590,6340,647 0,017182,66 84,8
JNJ26128726 0,7580,5750,667 0,1296119,44 88,1
JNJ26161343 0,1660,1700,168 0,002761,64 6,9
JNJ26220454 0,6510,5590,605 0,0654110,81 78,0
JNJ26367991 0,8030,6940,748 0,0769310,28 101,3
JNJ26483197 0,8230,6340,728 0,1337818,37 98,1
JNJ26511953 0,6240,6180,621 0,004310,69 80,6
RWJ351001 0,6390,6030,621 0,025534,11 73,6
RWJ382867 0,1430,1490,146 0,004032,76 2,9
RWJ682205 0,8170,8180,818 0,000710,09 102,8
RWJ665862 0,7420,7520,747 0,006790,91 92,2
RWJ670804 0,8560,9050,881 0,034793,95 112,1
RWJ673829 0,6500,5760,613 0,052688,59 72,4
RWJ675260 0,7680,7240,746 0,030974,15 92,2
RWJ675946 0,5560,5490,553 0,005370,97 63,4
RWJ351958 0,2270,2420,235 0,011034,70 16,1
RWJ395477 0,6340,6630,649 0,020443,15 77,7
RWJ447228 0,1410,1280,135 0,009196,83 1,3
RWJ666167 0,8470,8320,840 0,011101,32 106,0
RWJ670908 0,8030,8450,824 0,029983,64 103,7
RWJ673830 0,8600,8600,860 0,000350,04 109,1

RWJ6752610,528 0,4970,513 0,022274,3457,5
RWJ675948 0,6830,6880,686 0,003320,48 83,1
RWJ447228 0,6110,6280,620 0,012021,94 73,3
RWJ414342 0,7190,7490,734 0,021432,92 90,3
RWJ553709 0,9160,8380,877 0,054876,26 111,6
RWJ666168 0,7710,7400,755 0,021782,88 93,5
RWJ670984 0,8200,8520,836 0,023052,76 105,5
RWJ674239 0,9710,9130,942 0,041374,39 121,2
RWJ675430 0,8390,7430,791 0,067468,53 98,8
RWJ676061 0,5620,5270,544 0,024404,48 62,2
RWJ352190 0,6780,6610,670 0,011951,78 80,8
RWJ414984 0,7220,7130,717 0,006580,92 87,9
RWJ659780 0,8020,8010,802 0,001060,13 100,4
RWJ666205 0,8540,8570,855 0,002050,24 108,4
RWJ671232 0,7670,7980,782 0,021572,76 97,5
RWJ674240 0,7890,7760,782 0,008701,11 97,5
RWJ675266 0,7200,7090,714 0,007641,07 87,4
RWJ676085 0,6410,6180,630 0,016192,57 74,9
RWJ352244 0,6030,5840,593 0,013722,31 69,4
RWJ425264 0,1350,1580,146 0,0163311,18 3,0
RWJ662440 0,7920,5720,682 0,1556322,83 82,6
RWJ666213 0,7520,5930,673 0,1129216,79 81,2
RWJ672667 0,8050,5980,702 0,1464420,87 85,5
RWJ674241 0,5990,5040,552 0,0668212,11 63,2
RWJ675366 0,7140,5930,654 0,0854913,08 78,4
RWJ676137 0,6990,6980,698 0,000990,14 85,0
RWJ352628 0,6900,6740,682 0,011311,66 83,3
RWJ425268 0,6160,6340,625 0,013012,08 74,8

RWJ6638600,809 0,8170,813 0,005520,68103,0
RWJ667045 0,1280,1330,131 0,003612,76 0,7
RWJ672932 0,8210,8110,816 0,007210,88 103,4
RWJ674320 0,4560,4740,465 0,012232,63 50,8
RWJ675369 0,7620,7660,764 0,003040,40 95,7
RWJ676139 0,6800,6630,671 0,011951,78 81,8
RWJ353258 0,6150,6350,625 0,014002,24 74,8
RWJ355923 0,6810,6980,689 0,012661,84 84,5
RWJ664545 0,8300,8070,818 0,015841,94 103,8
RWJ667046 0,8690,8490,859 0,014421,68 109,9
RWJ672934 0,8210,8410,831 0,014281,72 105,7
RWJ674817 0,8190,8400,830 0,014851,79 105,5
RWJ675430 0,7950,7930,794 0,000780,10 100,1
RWJ676431 0,6400,6360,638 0,002830,44 76,7
RWJ355131 0,6100,6280,619 0,012662,05 73,9
RWJ425271 0,1430,1440,144 0,000350,25 2,6
RWJ353709 0,8040,9030,853 0,070008,20 109,0
RWJ667069 0,9180,8540,886 0,044835,06 113,9
RWJ673313 0,1051,0800,593 0,68971116,37 70,0
RWJ674855 0,8770,860 0,8680,012091,39 111,3
RWJ675578 0,8080,695 0,7510,0794110,57 93,8
RWJ676432 0,7200,697 0,7090,016482,33 87,3
RWJ355923 0,6360,621 0,6290,010541,68 75,4
RWJ425348 0,6400,634 0,6370,004740,74 76,6
RWJ665436 0,8330,833 0,8330,000000,00 106,0
RWJ669182 0,8870,846 0,8660,029343,39 111,0
RWJ673515 0,8450,877 0,8610,023262,70 110,2
RWJ674855 0,7940,784 0,7890,006860,87 99,4

RWJ6756050,770 0,7860,778 0,011381,4697,8
RWJ67657 0,6290,6590,644 0,021283,30 77,7
RWJ356205 0,5840,5580,571 0,018173,18 66,8
RWJ445224 0,7070,6790,693 0,019872,87 85,0
RWJ665588 0,7270,5780,652 0,1053616,15 78,9
RWJ669327 0,7420,6290,685 0,0796911,63 83,8
DMSO 0,6530,5070,580 0,1031017,78 68,0
RWJ675104 0,7220,5680,645 0,1090416,90 77,9
RWJ675881 0,6430,5810,612 0,043847,16 72,9
RWJ676639 0,6080,5900,599 0,012452,08 70,9
JNJ26511966 0,5970,6100,603 0,009261,54 71,2
JNJ26511979 0,6870,6680,677 0,013361,97 82,4
JNJ26512005 0,8400,8320,836 0,005940,71 106,1
JNJ26533065 0,8310,8220,826 0,005870,71 104,7
JNJ26533091 0,8630,8560,860 0,005090,59 109,7
JNJ26533104 0,8860,8020,844 0,059547,05 107,3
JNJ26533156 0,7530,6870,720 0,046606,47 88,8
JNJ26714181 0,4550,4630,459 0,005871,28 49,6
JNJ26714194 0,6680,6780,673 0,007641,13 81,7
JNJ26714207 0,1810,1710,176 0,006583,74 7,2
JNJ26714220 0,8320,8420,837 0,006580,79 106,3
JNJ26875563 0,7950,8020,798 0,004450,56 100,5
JNJ22791671 0,1570,1400,148 0,012028,11 3,0
JNJ26893438 0,1530,1530,153 0,000350,23 3,7
JNJ26941226 0,1680,1540,161 0,009696,02 4,9
JNJ28572128 0,6700,6410,655 0,020793,17 79,1
RWJ67694 0,7060,6790,693 0,018882,73 84,7
RWJ676940 0,7880,6660,727 0,0862711,86 89,8

RWJ6775450,879 0,7850,832 0,066407,98105,6
RWJ678986 0,1680,1760,172 0,005373,13 6,6
RWJ680665 0,9460,8480,897 0,069727,77 115,3
RWJ680667 0,1870,2020,194 0,010895,61 9,9
RWJ680668 0,9060,6880,797 0,1539419,31 100,3
RWJ680669 0,7150,6740,694 0,028504,10 84,9
RWJ680858 0,6950,7000,697 0,003390,49 85,3
RWJ680858 0,6650,6310,648 0,023693,66 78,0
RWJ680879 0,5900,6130,601 0,016552,75 71,0
RWJ680885 0,6810,6870,684 0,003820,56 83,3
RWJ680991 0,8290,8210,825 0,005300,64 104,5
RWJ680992 0,8220,7900,806 0,022702,82 101,6
RWJ680993 0,6710,6840,677 0,009121,35 82,3
RWJ681140 0,6860,6680,677 0,012661,87 82,3
RWJ681142 0,2120,1970,204 0,010475,12 11,5
RWJ681146 0,6660,6660,666 0,000070,01 80,7
RWJ681945 0,7360,6560,696 0,056438,11 85,1
RWJ68198 0,7260,6100,668 0,0821712,30 81,0
JNJ28850601 0,3030,3100,306 0,004881,59 26,7
DMSO 0,7860,6590,722 0,0900112,46 89,1
DMSO 0,6730,6490,661 0,016762,53 79,9
DMSO 0,7010,6860,693 0,010111,46 84,8

Таблица III

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Концен-трация соеди-нения Исходные

данные
Среднее значение Среднеквадратиче- ское отклонение Коэффициент вариации, %% контрольного образца
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 (мкМ) (дублир.)способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
Среда EXPRES 01 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,63790,6180 0,62800,0141 2,274,6
Без обработкиспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,74120,7038 0,72250,0264 3,788,7
Только AAспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,76740,8047 0,78610,0264 3,498,3
AA+Wnt3aспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,77540,8200 0,79770,0315 4,0100,0
JNJ2651200510 0,14120,15150,1464 0,00735,0 2,4
JNJ26512005 50,15010,1444 0,14730,0040 2,72,5
JNJ265120052,5 0,15410,42540,2898 0,191866,2 23,9
JNJ26533065 100,12720,1282 0,12770,0007 0,6-0,4
JNJ2653306550,5862 0,58800,5871 0,00130,268,4
JNJ26533065 2,50,76130,7603 0,76080,0007 0,194,5
JNJ2653315610 0,14810,15920,1537 0,00785,1 3,5
JNJ26533156 50,14790,1639 0,15590,0113 7,33,8
JNJ265331562,5 0,28610,24770,2669 0,027210,2 20,4
JNJ26714194 100,20920,2426 0,22590,0236 10,514,3
JNJ2671419450,6815 0,71280,6972 0,02213,284,9
JNJ26714194 2,50,73890,7870 0,76300,0340 4,594,8
JNJ2615020210 0,13810,13980,1390 0,00120,9 1,3
JNJ26150202 50,78260,7578 0,77020,0175 2,395,9
JNJ261502022,5 0,82310,77420,7987 0,03464,3 100,1
JNJ26158015 100,13520,1326 0,13390,0018 1,40,5

JNJ261580155 0,26320,2604 0,26180,00200,8 19,7
JNJ26158015 2,50,4160 0,53140,47370,0816 17,251,4
RWJ67080410 0,44470,4791 0,46190,02435,3 49,7
RWJ670804 50,6902 0,68840,68930,0013 0,283,8
RWJ6708042,5 0,74760,7483 0,74800,00050,1 92,5
JNJ26170833 100,6790 0,67040,67470,0061 0,981,6
JNJ261708335 0,78330,7924 0,78790,00640,8 98,5
JNJ26170833 2,50,8155 0,83890,82720,0165 2,0104,4
JNJ2617708610 0,65330,6884 0,67090,02483,7 81,0
JNJ26177086 50,7697 0,77380,77180,0029 0,496,1
JNJ261770862,5 0,81190,8219 0,81690,00710,9 102,9
JNJ26177762 100,1242 0,13230,12830,0057 4,5-0,4
JNJ261777625 0,12630,1303 0,12830,00282,2 -0,3
JNJ26177762 2,50,8480 0,77250,81030,0534 6,6101,9
RWJ67351510 0,16950,1890 0,17930,01387,7 7,3
RWJ673515 50,7217 0,74350,73260,0154 2,190,2
RWJ6735152,5 0,78120,7221 0,75170,04185,6 93,1
Среда EXPRES 01способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,62940,6363 0,63290,0049 0,870,3
Без обработкиспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,71560,7356 0,72560,0141 1,983,3
Только AAспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,87320,9046 0,88890,0222 2,5106,0
AA+Wnt3aспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,84150,8500 0,84580,0060 0,7100,0
JNJ1937002610 0,14030,14930,1448 0,00644,4 2,3
JNJ19370026 50,44340,3878 0,41560,0393 9,540,1
JNJ193700262,5 0,77340,80380,7886 0,02152,7 92,0
JNJ26483197 100,29930,3026 0,30100,0023 0,824,1
JNJ2648319750,7023 0,62990,6661 0,05127,775,0
JNJ26483197 2,50,78350,8043 0,79390,0147 1,992,8

RWJ67560510 0,72050,73690,7287 0,01161,6 83,7
RWJ675605 50,77690,8272 0,80210,0356 4,493,9
RWJ6756052,50,8214 0,86400,8427 0,03013,699,6
RWJ675430 100,62750,5980 0,61280,0209 3,467,5
RWJ67543050,7159 0,72220,7191 0,00450,682,3
RWJ675430 2,50,92450,9403 0,93240,0112 1,2112,1
RWJ675948100,7220 0,66700,6945 0,03895,678,9
RWJ675948 50,75260,7486 0,75060,0028 0,486,7
RWJ6759482,50,7557 0,73900,7474 0,01181,686,3
JNJ26483249 100,82140,8636 0,84250,0298 3,599,5
JNJ2648324950,7996 0,78730,7935 0,00871,192,7
JNJ26483249 2,50,86690,8195 0,84320,0335 4,099,6
RWJ67657100,6195 0,59080,6052 0,02033,466,5
RWJ67657 50,80470,8319 0,81830,0192 2,496,2
RWJ676572,50,8041 0,79000,7971 0,01001,393,2
RWJ676639 100,12610,1520 0,13910,0183 13,21,5
RWJ67663950,1303 0,12630,1283 0,00282,20,0
RWJ676639 2,50,44820,4051 0,42670,0305 7,141,6

Таблица IV

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Пролиферативный отклик Уровень экспрессии SOX-17 Пролиферативный отклик Уровень экспрессии HNF-3b
Название соединенияОбщее количество клеток Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Общая интенсивность Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Общее количество клетокОтносит. контрольного образца Wnt 3a/AAОбщая интенсивность Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
JNJ26511966 17230,11244207 688704090,0708 16450,10460717 501436280,0453
JNJ265119791110 0,0724590442978557 0,0442940,00597755 00,0000
JNJ265120057990 0,52154188339840000 0,34946833 0,43448539231745000 0,2092
JNJ26533065 49140,32074548 2385550000,2453 29070,18485899 828087450,0747
JNJ265330913056 0,19945819153145000 0,157526430,16807097 1222467840,1103
JNJ26533104 39600,25850251 476694630,0490 46410,29512575 2107300000,1902
JNJ2653315612243 0,79917096699160000 0,718965360,41559887 2488550000,2246
JNJ26714181 4010,02614400 255800220,0263 270,001685160 0,0000
JNJ26714194 79580,51948561 3510700000,3610 69920,44459636 2880750000,2600
JNJ26714207 2770,01808212 65585630,0067 120,00073130535481 0,0005
JNJ26714220 13270,08662445 690377560,0710 11940,07589584 404784970,0365
JNJ26875563 7910,05160259 247324750,0254 640,004069821092011 0,0010

JNJ227916710 0,000000000 0,000030,00019077 957840,0001
JNJ268934382 0,000130560 0,000000,00000000 00,0000
JNJ269412266 0,000359031092432 0,001120,00009539 1502220,0001
JNJ285721282742 0,17899341122926199 0,12643166 0,20132905120729987 0,1090
JNJ28850601 330,002121553855900 0,00408 0,00050873208129 0,0002
RWJ674817 20000,13055682 1100801230,1132 1160,00737655 42908890,0039
RWJ6748553495 0,22814805110559816 0,11374380,02782105 244506470,0221
RWJ674855 31070,20278739 1209984210,1244 61770,39276971 2739650000,2473
RWJ6751046580,04295320 378410440,0389 6460,04107977 313523800,0283
RWJ675260 59910,39108297 2526900000,2598 84790,53915615 3065200000,2767
RWJ6752611953 0,1274561088653625 0,09126410,04076182 181625850,0164
RWJ675266 20240,13209087 1283950000,1320 49230,31302661 2320200000,2094
RWJ6753662979 0,1944643993454696 0,096135820,22775110 1370546530,1237
RWJ675369 37030,24169332 1381800000,1421 39800,25306032 1395500000,1260
RWJ67543021070 1,375383511089750000 1,1205212031,34831961 12810000001,1562
RWJ675578 12970,08466610 474459620,0488 300,001907730 0,0000
RWJ675605 145290,94839741 10133600001,0419 98710,62767480 5407250000,4881
RWJ675881 40630,26522619 2078917580,2137 39730,25264697 1771900000,1599
RWJ67594610,00006528 00,0000 70,000413340 0,0000
RWJ675948 97160,63421242 5725200000,5887 76500,48643922 3294250000,2973
RWJ676061 9160,05979503 00,00001076 0,0683921040211776 0,0363

RWJ676085738 0,0481754730943000 0,0318503 0,0319862600,0000
RWJ676137 83670,54618448 3731850000,3837 79760,50720168 2600000000,2347
RWJ67613920079 1,310692601104750000 1,1359168841,07363836 10523450000,9499
RWJ676431 137890,90012403 7890850000,8113 113690,72296588 5470550000,4938
RWJ67643216652 1,086983481045395000 1,0749149500,95065340 8543250000,7711
RWJ676657 63760,41618252 3244500000,3336 60580,38523417 2690250000,2428
RWJ6766396470 0,42231869327055000 0,336343570,27706591 1091600000,0985
RWJ674817 20000,13055682 1100801230,1132 1160,00737655 42908890,0039
RWJ6748553495 0,22814805110559816 0,11374380,02782105 244506470,0221
RWJ674855 31070,20278739 1209984210,1244 61770,39276971 2739650000,2473
RWJ6751046580,04295320 378410440,0389 6460,04107977 313523800,0283
RWJ675260 59910,39108297 2526900000,2598 84790,53915615 3065200000,2767
RWJ6752611953 0,1274561088653625 0,09126410,04076182 181625850,0164
RWJ675266 20240,13209087 1283950000,1320 49230,31302661 2320200000,2094
RWJ6753662979 0,1944643993454696 0,096135820,22775110 1370546530,1237
RWJ675369 37030,24169332 1381800000,1421 39800,25306032 1395500000,1260
RWJ67543021070 1,375383511089750000 1,1205212031,34831961 12810000001,1562
RWJ675578 12970,08466610 474459620,0488 300,001907730 0,0000
RWJ675605 145290,94839741 10133600001,0419 98710,62767480 5407250000,4881
RWJ675881 40630,26522619 2078917580,2137 39730,25264697 1771900000,1599
RWJ67594610,00006528 00,0000 70,000413340 0,0000

RWJ6759489716 0,63421242572520000 0,58877650 0,48643922329425000 0,2973
RWJ676061 9160,05979503 00,00001076 0,0683921040211776 0,0363
RWJ676085 7380,04817547 309430000,0318 5030,03198626 00,0000
RWJ6761378367 0,54618448373185000 0,38377976 0,50720168260000000 0,2347
RWJ676139 200791,31069260 11047500001,1359 168841,07363836 10523450000,9499
RWJ67643113789 0,90012403789085000 0,8113113690,72296588 5470550000,4938
RWJ676432 166521,08698348 10453950001,0749 149500,95065340 8543250000,7711
RWJ6765763760,41618252 3244500000,3336 60580,38523417 2690250000,2428
RWJ676639 64700,42231869 3270550000,3363 43570,27706591 1091600000,0985
Без обработки3891 0,2539656697657703 0,100460910,38733268 1093366090,0987
AA4348 0,28379790104735084 0,1077122 0,007758105341271 0,0048
AA/3a 153191,00000000 9725950001,0000 157261,00000000 11079000001,0000
RWJ3510017380,44211577 00,0000 00,000000000 0,0000
RWJ351958 00,00000000 00,00000 0,000000000 0,0000
DMSO 560,03353293454796 0,0148211 0,166447544455058 0,1626
RWJ352190 13130,78642715 285064370,9266 54854,32684722 852456713,1115
RWJ352244120,00738523 859490,0028 670,052590061300640 0,0475
RWJ352628 28991,73612774 327032351,0630 74605,88456482 1497725255,4668
RWJ353258 5620,33632735 113882400,3702 7870,62108861 107430820,3921
RWJ3551311180,07045908 25742790,0837 570,04522745 25847080,0943
RWJ3559231360,08163673 4106480,0133 00,000000000 0,0000

RWJ35620519 0,011377250 0,000000,00000000 00,0000
RWJ3828673 0,00159681431883 0,0140310,02419143 8471860,0309
RWJ39547733 0,019760480 0,00002250,17749145 52238790,1907
RWJ414342 160,009780440 0,0000496 0,391270058966327 0,3273
RWJ414984 260,01556886459801 0,0149189 0,149355771819533 0,0664
RWJ425264 10,000399200 0,000042 0,033394691605538 0,0586
RWJ425268 220,0129740582062 0,0027311 0,245069685749996 0,2099
RWJ425271 00,000000000 0,00000 0,0000000000,0000
RWJ425348 260,015568860 0,00000 0,0000000000,0000
RWJ445224 2020,12095808 6272800,02041079 0,8514330814326715 0,5229
RWJ447228 30,00179641 00,00004 0,00315540101114 0,0037
RWJ553709 13100,78423154 243824550,7926 32492,56323955 758346312,7680
RWJ659780 200,011776450 0,0000425 0,335261648880858 0,3242
RWJ663860 90,0053892237140 0,0012134 0,105706022144545 0,0783
RWJ662440 70,0041916248154 0,00165 0,00420720170177 0,0062
RWJ664545 700,04191617589594 0,01920 0,0000000000,0000
RWJ665436 12150,72774451 75688490,2460 00,000000000 0,0000
Без обработки1145 0,685429146979814 0,2269не проводилось способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
AA 1000,05988024 12648070,0411 510,04049435923625 0,0337
AA/3a 16701,00000000 307642931,0000 12681,00000000 273967871,0000

RWJ66558843 0,00510815706614 0,00550 0,0000000000,0000
RWJ665862 70,00079815102445 0,00080 0,0000000000,0000
RWJ666167 460,005467320 0,000046 0,00548446818478 0,0044
RWJ666168 50,00059861284777 0,002232 0,003855022309043 0,0124
RWJ666205 2580,03092825 40093950,0312 3910,04665766 143403070,0769
RWJ666213620,00742278 7822610,0061 1120,01335347 27924730,0150
RWJ667045360,00431000 3120390,0024 20,000278201731575 0,0093
RWJ667046 590,00702371 3977110,0031103 0,012320173561761 0,0191
RWJ667069 220,00267380 7701280,00600 0,000000000 0,0000
RWJ669182 770,009258521631067 0,01270 0,0000000000,0000
RWJ669327 1290,01540426 9976290,007898 0,011644544138261 0,0222
RWJ670804 23860,28565728 208666470,1625 25940,30931563 611614680,3280
RWJ670908 1720,02063213 6252990,0049133 0,015896993578458 0,0192
RWJ670984 80,00099769 3949480,0031530 0,0631905316678849 0,0894
RWJ671232 170,00207519 00,000053 0,006279312270954 0,0122
RWJ672667 110,00127704 00,000036 0,004331932287281 0,0123
RWJ672932 20,00023944 00,00000 0,000000000 0,0000
RWJ672934 1740,02087158 14517270,0113 00,000000000 0,0000
RWJ673313 800,00961769 9403670,0073333 0,039702735586343 0,0300
RWJ673515 118861,42305850 2236466671,7415 103311,23173834 3099000001,6618
RWJ673829 5450,06524862 58493810,0455 4040,04820761 67383050,0361

RWJ67383010 0,00115732315367 0,0025350,00421270 30720130,0165
RWJ674239 24730,29603320 806766670,6282 42090,50182815 1439166670,7718
RWJ67424080,00091787 2336870,0018 60,000715360 0,0000
RWJ674241 10,00007981 13092980,0102 00,000000000 0,0000
RWJ674320 00,00003991 00,00000 0,000000000 0,0000
Без обработки 76530,91619443 262727070,2046 120501,43665050 744535880,3993
AA150,00175593 00,0000 2100,02503776 37779450,0203
AA/3a83531,00000000 1284243041,0000 83871,00000000 1864800001,0000
RWJ355923 73190,91843393 3876950001,0342 54361,07644321 4374950000,9520
RWJ6645456620 0,83065629333205000 0,888947670,94395485 3974350000,8649
RWJ353709 62170,78014807 3379200000,9014 50130,99277156 4372350000,9515
эталонное соед-ие5934 0,74463546363935000 0,970841220,81621943 3481350000,7576
JNJ18157698 104471,31089221 3826800001,0208 69081,36805624 5604750001,2196
JNJ522678010963 1,37570586296920000 0,792156791,12456679 4635250001,0087
JNJ7830433 17660,22160873 1627900000,4343 21840,43241905 1898750000,4132
JNJ87066462914 0,36566696230965000 0,616127760,54975740 1251250000,2723
JNJ8710481 36000,45175053 2760800000,7365 41210,81612041 2946650000,6412
JNJ87104811977 0,24808633164760000 0,439522660,44865828 1520600000,3309
JNJ10148307 9964,51,25040783 3638550000,9706 97281,92642836 6356550001,3832
JNJ101648302536,5 0,31829590179185000 0,478023970,47460145 1506000000,3277
JNJ10164895 5706,50,71608734 3199300000,8534 50961,00920883 3413600000,7428

JNJ101720584645,5 0,58294642257295000 0,68644507 0,89256362312605000 0,6803
JNJ10178727 2892,50,36296900 2131650000,5686 30430,60253490 2695700000,5866
JNJ101790262460,5 0,30875894203350000 0,542524100,47727498 2097950000,4565
JNJ10179130 47830,60020078 3060850000,8165 45560,90226755 3264750000,7104
JNJ101825626916,5 0,86792571377885000 1,008045040,89196950 3650900000,7945
JNJ10182562 7370,50,92489647 3650750000,9739 53001,04950985 3992650000,8688
JNJ1018465510533 1,32174677475250000 1,267851861,02693336 4047100000,8807
JNJ10222784 35130,44083323 2427500000,6476 25220,49945539 2145750000,4669
Без обработкине проводилось способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 не проводилось способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
AA не проводилосьспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 не проводилось способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
AA/3a 79691,00000000 3748700001,0000 50501,00000000 4595400001,0000
JNJ10222784563 0,3125000057351132 0,329517440,03386884 1653650001,1010
JNJ10222927 1580,08777778 147866320,0850 830,0016123414201404 0,0946
JNJ10231273 30,00166667 00,00004 0,0000777028439 0,0002
JNJ10259847 50,00277778 00,000010 0,000194260 0,0000
JNJ10259847 150,00805556548982 0,00320 0,0000000000,0000
JNJ17154215 240,01305556689535 0,004011 0,0002136800,0000
JNJ17154215 940,0519444411142426 0,064012 0,000223401767033 0,0118
JNJ17157659 150,008055560 0,000021 0,000398234567590 0,0304

JNJ1716304233 0,018055562188847 0,012669 0,0013403813689421 0,0911
JNJ10166565 40,001944440 0,00003 0,00005828291660 0,0019
JNJ17174664 880,048888897121122 0,0409399 0,0077411765100086 0,4335
JNJ17187027 110,005833331073763 0,00625 0,0000874200,0000
JNJ17187053 80,004444440 0,00009 0,0001651200,0000
JNJ17193774 1090,06027778 157141700,0903 1360,00263219 157259840,1047
JNJ1720097650,00250000 1254430,0007 50,000097130 0,0000
JNJ17205955 200,01083333 31356530,0180 80,000155410 0,0000
JNJ17205955 90,00472222 723870,000417 0,00033024736311 0,0049
JNJ17205994 60,00305556 6440150,00374 0,000077700 0,0000
JNJ17226703 770,0427777812632849 0,072628 0,000543929312311 0,0620
JNJ17982133 140,00750000887585 0,00511 0,0000194352047 0,0003
JNJ17989049 230,012777782117429 0,012213 0,0002428200,0000
Без обработки не проводилосьспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 4320,00838222 429873880,2862
AA147 0,0813888920330009 0,11688 0,0001456987206 0,0006
AA/3a 18001,00000000 1740523461,0000 14780,02870158 1501900001,0000

Таблица V

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Пролиферативный отклик - Сильно положительные результаты Уровень экспрессии SOX-17 - Сильно положительные результатыУровень экспрессии HNF-3в - Сильно положительные результаты
Название соединения Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Название соединенияОтносит. контрольного образца Wnt 3a/AAНазвание соединения Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
RWJ352628 5,8846RWJ673515 1,7415RWJ352628 5,4668
RWJ352190 4,3268JNJ10184655 1,2678RWJ352190 3,1115
RWJ553709 2,5632Уровень экспрессии SOX-17 - Умеренно положительные результаты RWJ5537092,7680
JNJ101483071,9264 RWJ6761391,1359 RWJ6735151,6618
RWJ6735151,4231 RWJ6754301,1205 JNJ101483071,3832
JNJ52267801,3757 RWJ6764321,0749 JNJ181576981,2196
RWJ6754301,3754 RWJ3526281,0630 Уровень экспрессии HNF-3b - Умеренно положительные результаты
JNJ18157698 1,3681RWJ675605 1,0419RWJ675430 1,1562
JNJ10184655 1,3217RWJ355923 1,0342JNJ10222784 1,1010
RWJ676139 1,3107JNJ18157698 1,0208JNJ5226780 1,0087

Пролиферативный отклик - Умеренно положительные результатыJNJ10182562 1,0080RWJ355923 0,9520
JNJ5226780 1,1246эталонное соед-ие 0,9708RWJ353709 0,9515
RWJ676432 1,0870JNJ10148307 0,9706RWJ676139 0,9499
RWJ355923 1,0764RWJ352190 0,9266JNJ10184655 0,8807
RWJ676139 1,0736RWJ353709 0,9014JNJ10182562 0,8688
JNJ10182562 1,0495RWJ664545 0,8889RWJ664545 0,8649
JNJ10184655 1,0269JNJ10164895 0,8534RWJ674239 0,7718
JNJ10164895 1,0092JNJ10179130 0,8165RWJ676432 0,7711
RWJ353709 0,9928RWJ676431 0,8113эталонное соед-ие 0,7576
RWJ675605 0,9484RWJ553709 0,7926JNJ10164895 0,7428
RWJ664545 0,9440JNJ5226780 0,7921JNJ10179130 0,7104
JNJ10182562 0,9249JNJ8710481 0,7365JNJ10172058 0,6803
JNJ10179130 0,9023JNJ26533156 0,7189JNJ8710481 0,6412
RWJ676431 0,9001JNJ10172058 0,6864JNJ10178727 0,5866
JNJ10172058 0,8926JNJ10222784 0,6476способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
RWJ445224 0,8514RWJ674239 0,6282способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
эталонное соед-ие 0,8162JNJ8706646 0,6161способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
JNJ8710481 0,8161RWJ675948 0,5887способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
JNJ26533156 0,7992JNJ10178727 0,5686способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

RWJ3521900,7864 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
RWJ553709 0,7842способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
RWJ665436 0,7277способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
RWJ675948 0,6342способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
RWJ353258 0,6211способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764
JNJ10178727 0,6025способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

Таблица VI

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое

отклонение
Коэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,13481,0099 1,10921,08460,0660 6,1116,5
Без обработки0,9344 0,59770,8454 0,79250,174522,0 85,2
AA/DMSO 0,38780,2434 0,22520,28550,0891 31,230,7
AA/Wnt3a/DMSO 0,60981,08040,7635 0,81790,2403 25,8100,0
RWJ3510010,3418 0,42760,57510,4482 0,118026,3 48,2
RWJ351958 0,13620,15310,1532 0,14750,0098 6,615,8
RWJ3521901,3764 1,27531,32081,3242 0,05063,8 142,3
RWJ352244 0,69230,59940,6134 0,63500,0501 7,968,2
RWJ3526281,7896 1,47212,19081,8175 0,360219,8 195,3
RWJ353258 1,75911,62741,6518 1,67940,0701 4,2180,4
RWJ3551310,3702 0,31930,33680,3421 0,02597,6 36,8
RWJ355923 0,58760,63840,9154 0,71380,1764 24,776,7
RWJ3562050,3074 0,23280,29200,2774 0,039414,2 29,8
RWJ382867 0,13110,12450,1288 0,12810,0034 2,613,8
RWJ3954770,1270 0,27780,19160,1988 0,075738,1 21,4
RWJ414342 0,21660,30620,2915 0,27140,0481 17,729,2
RWJ4149840,4362 0,37280,24810,3524 0,095727,2 37,9
RWJ425264 0,15600,14810,1359 0,14670,0101 6,915,8
RWJ4252680,2932 0,38830,62580,4358 0,171339,3 46,8
RWJ425271 0,13620,14790,1298 0,13800,0092 6,714,8
RWJ4253480,2198 0,21590,23000,2219 0,00733,3 23,8

RWJ4452240,7624 0,27050,2478 0,42690,290868,1 45,9
RWJ447228 0,12390,1233 0,12690,12470,0019 1,513,4
RWJ5537090,1277 0,12540,6980 0,31700,3299104,1 34,1
RWJ659780 0,26650,3215 0,26050,28280,0336 11,930,4
RWJ6624400,2395 0,32350,1333 0,23210,095341,1 24,9
RWJ663860 0,26460,1873 0,12930,19370,0679 35,020,8
RWJ6645450,3590 0,27900,1515 0,26320,104739,8 28,3
RWJ665436 0,46900,5805 0,33490,46150,1230 26,649,6
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,15251,12691,1140 1,13110,0196 1,771,0
Без обработки1,2057 1,23581,31321,2516 0,05554,4 78,6
AA/DMSO 0,26220,20730,2830 0,25080,0391 15,615,8
AA/Wnt3a/DMSO1,3943 1,79761,80001,5922 0,213613,4 100,0
RWJ665588 0,19300,22230,2167 0,21070,0156 7,413,2
RWJ6658620,1757 0,18130,18350,1802 0,00402,2 11,3
RWJ666167 0,14730,18800,1732 0,16950,0206 12,210,6
RWJ6661680,1330 0,13620,18670,1520 0,030119,8 9,5
RWJ666205 0,81910,54930,6526 0,67370,1361 20,242,3
RWJ6662130,4008 0,27790,38690,3552 0,067318,9 22,3
RWJ667045 0,12200,12480,1251 0,12400,0017 1,47,8
RWJ6670460,2883 0,33080,55030,3898 0,140636,1 24,5
RWJ667069 0,28350,40240,5698 0,41860,1438 34,426,3
RWJ6691820,3704 0,60730,52800,5019 0,120624,0 31,5
RWJ669327 0,22660,18150,2289 0,21230,0267 12,613,3
RWJ6708041,0820 1,18621,10761,1253 0,05434,8 70,7

RWJ6709080,3590 0,54570,6123 0,50570,131326,0 31,8
RWJ670984 0,21980,3564 0,32020,29880,0708 23,718,8
RWJ6712320,2928 0,29200,3659 0,31690,042413,4 19,9
RWJ672667 0,33490,3013 0,35070,32900,0252 7,720,7
RWJ6729320,1852 0,19240,2349 0,20420,026913,2 12,8
RWJ672934 0,21700,3003 0,18770,23500,0584 24,914,8
RWJ6733130,3094 0,25150,1881 0,24970,060724,3 15,7
RWJ673515 1,84521,7710 1,55911,72510,1485 8,6108,3
RWJ6738290,7305 0,70670,6250 0,68740,05538,0 43,2
RWJ673830 0,21130,1800 0,15470,18200,0284 15,611,4
RWJ6742391,5225 1,59120,1081 1,07390,837178,0 67,4
RWJ674240 0,40061,2807 0,11620,59920,6071 101,337,6
RWJ6742410,1972 0,18390,1162 0,16580,043426,2 10,4
RWJ674320 0,13510,1318 0,11690,12790,0097 7,68,0
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,05681,0604способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,05860,0025 0,271,9
Без обработки 1,1544 0,9576способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,05600,1392 13,271,7
Только AA+DMSO 0,63290,8434способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,73820,1488 20,247,1
AA+Wnt3a+

DMSO
1,27041,8669способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,42290,2960 20,8100,0
RWJ6748170,5617 0,2098способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,38580,2488 64,519,9
RWJ6748550,6850 0,5853способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,63520,0705 11,139,2
RWJ6748550,7496 0,9187способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,83420,1196 14,354,5
RWJ6751040,2320 0,2124способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,22220,0139 6,27,3

RWJ6752600,8079 1,4391способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,12350,4463 39,776,9
RWJ6752610,8310 0,7318способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,78140,0701 9,050,5
RWJ6752661,0646 1,1384способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,10150,0522 4,775,2
RWJ6753660,6344 1,0400способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,83720,2868 34,354,8
без клеток0,1335 0,2070способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17030,0520 30,53,3
RWJ6753690,8643 0,4060способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,63520,3241 51,039,2
RWJ6754301,7922 1,8533способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,82280,0432 2,4130,9
RWJ6755780,1914 0,2371способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,21430,0323 15,16,7
RWJ6756051,8401 1,7563способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,79820,0593 3,3129,0
RWJ6758811,0301 1,0356способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,03290,0039 0,469,9
RWJ6759460,1306 0,1338способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13220,0023 1,70,3
RWJ6759481,7143 1,6506способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,68250,0450 2,7120,0
RWJ6760610,4170 0,4956способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,45630,0556 12,225,4
RWJ6760850,1772 0,2348способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,20600,0407 19,86,0
RWJ6761371,0231 1,2392способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,13120,1528 13,577,5
RWJ6761391,9718 2,0997способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 2,03580,0904 4,4147,3
RWJ6764311,5168 1,6872способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,60200,1205 7,5113,8
RWJ6764321,6935 1,9710способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,83230,1962 10,7131,6
RWJ676571,2655 1,1829способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,22420,0584 4,884,7
RWJ6766391,3481 1,3168способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,33250,0221 1,793,0
JNJ265119660,6444 0,7239способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,68420,0562 8,243,0
JNJ265119790,2046 0,3076способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,25610,0728 28,49,9
JNJ265120051,3627 1,0693способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,21600,2075 17,184,0
JNJ265330650,8722 0,9660способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,91910,0663 7,261,1
JNJ265330911,0332 0,4554способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,74430,4086 54,947,6
JNJ265331040,8775 0,7347способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,80610,1010 12,552,4
JNJ265331561,7865 1,2008способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,49370,4142 27,7105,5
JNJ267141810,2396 0,1584способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,19900,0574 28,95,5

JNJ267141940,8122 1,0827способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,94750,1913 20,263,3
JNJ267142070,1342 0,1363способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13530,0015 1,10,6
JNJ267142201,0462 0,5838способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,81500,3270 40,153,1
JNJ268755630,4586 0,2903способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,37450,1190 31,819,0
JNJ227916710,1277 0,1402способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13400,0088 6,60,5
JNJ268934380,1258 0,1324способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12910,0047 3,60,1
JNJ269412260,1219 0,1216способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12180,0002 0,2-0,5
JNJ285721280,4223 0,4721способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,44720,0352 7,924,7
JNJ288506010,1514 0,1396способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14550,0083 5,71,4
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,74230,7081способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,72520,0242 3,387,7
Без обработки 0,4936 0,5689способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,53130,0532 10,059,8
Только AA+DMSO 0,14330,1939способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16860,0358 21,27,6
AA+Wnt3a+

DMSO
0,68080,9406способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,81070,1837 22,7100,0
JNJ179948730,2447 0,1331способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18890,0789 41,810,6
JNJ179948990,1537 0,1302способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14200,0166 11,73,8
без клеток0,1163 0,1147способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11550,0011 1,00,0
JNJ179949120,2994 0,2592способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,27930,0284 10,223,6
JNJ179949250,1353 0,2121способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17370,0543 31,38,4
JNJ1801250,1267 0,1419способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13430,0107 8,02,7
JNJ180140610,1376 0,1676способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15260,0212 13,95,3
JNJ180140740,1134 0,1103способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11190,0022 2,0-0,5
JNJ180183380,1318 0,1478способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13980,0113 8,13,5

JNJ180183510,2569 0,2124способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,23470,0315 13,417,1
JNJ180479910,2674 0,2636способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,26550,0027 1,021,6
JNJ180557260,4357 0,3467способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,39120,0629 16,139,7
JNJ180778000,1265 0,1588способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14270,0228 16,03,9
JNJ181570740,1662 0,2521способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,20920,0607 29,013,5
JNJ181570870,1596 0,1566способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15810,0021 1,36,1
JNJ181576460,2725 0,1636способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,21810,0770 35,314,8
JNJ181577111,2256 1,0636способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,14460,1146 10,0148,0
JNJ181577110,1134 0,1070способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11020,0045 4,1-0,8
JNJ193633570,1469 0,1495способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14820,0018 1,24,7
JNJ193692330,1169 0,1122способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11460,0033 2,9-0,1
JNJ193692460,1595 0,1422способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15090,0122 8,15,1
JNJ193700261,0484 1,0749способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,06170,0187 1,8136,1
JNJ193762400,3012 0,2347способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,26800,0470 17,521,9
JNJ193860420,1267 0,1510способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13890,0172 12,43,4
JNJ194108331,1902 1,1487способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,16950,0293 2,5151,6
JNJ194108590,6400 0,7076способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,67380,0478 7,180,3
JNJ194108720,1701 0,1752способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17270,0036 2,18,2
JNJ195589290,3435 0,3488способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,34620,0037 1,133,2
JNJ195673140,4032 0,3548способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,37900,0342 9,037,9
JNJ195673270,1602 0,1502способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15520,0071 4,65,7
JNJ195673400,1604 0,2079способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18420,0336 18,29,9
JNJ195674050,1646 0,1592способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16190,0038 2,46,7
JNJ195735410,1779 0,2273способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,20260,0349 17,212,5
JNJ195748670,1225 0,1443способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13340,0154 11,62,6
JNJ195748800,1300 0,1291способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12960,0006 0,52,0
JNJ209487980,1263 0,1336способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13000,0052 4,02,1
JNJ211927300,2778 0,1326способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,20520,1027 50,012,9

JNJ211946670,2569 0,1219способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18940,0955 50,410,6
JNJ211962270,1640 0,1158способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13990,0341 24,43,5
JNJ248436111,1486 0,8970способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,02280,1779 17,4130,5
JNJ248436110,1358 0,1201способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12800,0111 8,71,8
JNJ243261850,1257 0,1257способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12570,0000 0,01,5
JNJ248435720,4676 0,4803способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,47400,0090 1,951,6
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,69350,7803способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,73690,0614 8,3104,8
Без обработки 0,47350,6069способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,54020,0943 17,571,5
Только AA+DMSO 0,14280,1656способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15420,0161 10,56,3
AA+Wnt3a+

DMSO
0,57020,8468способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,70850,1956 27,6100,0
JNJ248435850,1599 0,2380способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,19900,0552 27,813,8
JNJ257535200,1287 0,1244способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12660,0030 2,41,6
без клеток0,1241 0,1100способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11710,0100 8,50,0
JNJ257534030,1235 0,1152способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11940,0059 4,90,4
JNJ257571730,1199 0,1278способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12390,0056 4,51,1
JNJ257571730,1174 0,1162способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11680,0008 0,7-0,1
JNJ257572381,1100 0,9464способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,02820,1157 11,3154,1
JNJ257587070,1247 0,1115способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11810,0093 7,90,2
JNJ257587850,2640 0,1688способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,21640,0673 31,116,8
JNJ257588500,2313 0,1307способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18100,0711 39,310,8
JNJ257588630,8639 0,9218способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,89290,0409 4,6131,2
JNJ258734190,2540 0,2320способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,24300,0156 6,421,3

JNJ258875370,1809 0,3077способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,24430,0897 36,721,5
JNJ259006410,1892 0,1872способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18820,0014 0,812,0
JNJ259006540,1967 0,2492способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,22300,0371 16,717,9
JNJ259007060,3346 0,1619способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,24830,1221 49,222,2
JNJ260477230,1106 0,1138способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11220,0023 2,0-0,8
JNJ260549120,1224 0,1445способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13350,0156 11,72,8
JNJ260645710,1312 0,1270способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12910,0030 2,32,0
JNJ260676260,1653 0,2114способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18840,0326 17,312,0
JNJ260676520,1732 0,1467способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16000,0187 11,77,2
JNJ260699010,1618 0,2754способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,21860,0803 36,717,2
JNJ260778831,0006 0,9631способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,98190,0265 2,7146,2
JNJ261169220,6472 0,4319способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,53960,1522 28,271,4
JNJ261206010,1539 0,1469способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15040,0049 3,35,6
JNJ261206140,1127 0,1309способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12180,0129 10,60,8
JNJ261287260,6887 0,5860способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,63740,0726 11,488,0
JNJ261304030,1141 0,1094способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11180,0033 3,0-0,9
JNJ261347710,2774 0,1690способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,22320,0767 34,317,9
JNJ261502020,9482 1,1150способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,03160,1179 11,4154,6
JNJ261536470,7687 0,6804способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,72460,0624 8,6102,7
JNJ261580150,7125 0,3347способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,52360,2671 51,068,7
JNJ261580540,1446 0,1221способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13340,0159 11,92,7
JNJ261580931,0968 1,3108способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,20380,1513 12,6183,8
JNJ261581060,3167 0,3415способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,32910,0175 5,335,8
JNJ261613430,1261 0,1144способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12030,0083 6,90,5
JNJ261707940,2223 0,2930способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,25770,0500 19,423,8
JNJ261708200,1265 0,1236способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12510,0021 1,61,3
JNJ261708331,1940 0,9431способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,06860,1774 16,6160,9
JNJ261770861,0689 0,6879способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,87840,2694 30,7128,7

JNJ261777621,0444 0,7603способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,90240,2009 22,3132,8
JNJ261844570,1443 0,1209способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13260,0165 12,52,6
JNJ262190500,1152 0,1309способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12310,0111 9,01,0
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеква-дратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,75900,7451способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,75210,0098 1,398,0
Без обработки 0,5687 0,4490способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,50890,0846 16,660,4
Только AA+DMSO 0,19880,1522способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17550,0330 18,88,9
AA+Wnt3a+

DMSO
0,68370,8460способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,76490,1148 15,0100,0
JNJ262190630,1911 0,1101способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15060,0573 38,05,0
JNJ262204540,2772 0,1151способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,19620,1146 58,412,1
без клеток0,1278 0,1084способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11810,0137 11,60,0
JNJ262417740,1443 0,2120способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17820,0479 26,99,3
JNJ262419170,4413 0,2238способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,33260,1538 46,233,2
JNJ262432040,1098 0,1085способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,10920,0009 0,8-1,4
JNJ262471430,1389 0,2147способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17680,0536 30,39,1
JNJ262487290,1852 0,1342способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15970,0361 22,66,4
JNJ262611050,1114 0,1295способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12050,0128 10,60,4
JNJ263617120,5375 0,6158способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,57670,0554 9,670,9
JNJ263617250,1259 0,1441способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13500,0129 9,52,6
JNJ263667300,1206 0,1312способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12590,0075 6,01,2
JNJ263679910,2269 0,2857способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,25630,0416 16,221,4
JNJ263679910,1140 0,1079способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11100,0043 3,9-1,1
JNJ263999060,9589 0,8868способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,92290,0510 5,5124,4

JNJ263999061,0442 0,9622способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,00320,0580 5,8136,8
JNJ263999450,1961 0,1735способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18480,0160 8,610,3
JNJ263999710,5732 0,5216способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,54740,0365 6,766,4
JNJ263999840,1273 0,1217способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12450,0040 3,21,0
JNJ263999970,5932 0,6671способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,63020,0523 8,379,2
JNJ264000490,1444 0,1368способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14060,0054 3,83,5
JNJ264831971,0786 1,0891способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,08390,0074 0,7149,3
JNJ264833100,5418 0,2338способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,38780,2178 56,241,7
JNJ264832230,1268 0,2052способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16600,0554 33,47,4
JNJ264832360,1169 0,1184способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11770,0011 0,9-0,1
JNJ264832490,8618 1,0400способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,95090,1260 13,3128,8
JNJ264832490,8430 1,0187способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,93090,1242 13,3125,7
JNJ264832620,3659 0,3168способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,34140,0347 10,234,5
JNJ265119010,9184 0,8116способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,86500,0755 8,7115,5
JNJ265119270,2384 0,3156способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,27700,0546 19,724,6
JNJ265119530,2297 0,1469способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,18830,0585 31,110,9
RWJ676940,1955 0,1256способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16060,0494 30,86,6
RWJ6769400,1658 0,1704способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16810,0033 1,97,7
RWJ6775450,1399 0,1303способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,13510,0068 5,02,6
RWJ6789860,1234 0,1236способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12350,0001 0,10,8
RWJ6806650,1397 0,2147способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17720,0530 29,99,1
RWJ6806670,1218 0,1310способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12640,0065 5,11,3
RWJ6806680,1456 0,1981способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17190,0371 21,68,3
RWJ6806690,5412 0,1898способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,36550,2485 68,038,2
RWJ6808580,1996 0,1245способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,16210,0531 32,86,8
RWJ6808580,1418 0,2014способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,17160,0421 24,68,3
RWJ6808790,1106 0,1197способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11520,0064 5,6-0,5
RWJ6808850,1159 0,1272способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12160,0080 6,60,5

JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициониро-ванная среда 0,80770,7210способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,76440,0613 8,074,7
без обработки+DMSO 0,46380,4073способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,43560,0400 9,236,7
AA/Wnt3a0,8466 0,9935способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,98300,2592 26,4100,0
JNJ102227840,8095 0,9055способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,85750,0679 7,985,5
JNJ102229270,3519 0,4708способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,41140,0841 20,433,9
JNJ102312730,1609 0,1275способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,14420,0236 16,43,1
JNJ102598470,5020 0,2733способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,38770,1617 41,731,2
JNJ102598470,3413 0,4146способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,37800,0518 13,730,1
JNJ171542150,1176 0,1174способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11750,0001 0,10,0
JNJ171542150,1148 0,1410способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,12790,0185 14,51,2
JNJ171576590,2394 0,2450способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,24220,0040 1,614,4
JNJ171630420,3672 0,3098способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,33850,0406 12,025,5
JNJ101665650,2722 0,1593способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,21580,0798 37,011,3
JNJ171746640,5079 0,4349способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,47140,0516 11,040,9
JNJ171870270,1076 0,1168способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11220,0065 5,8-0,6
JNJ171870530,2569 0,2151способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,23600,0296 12,513,7
JNJ171937740,2846 0,4376способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,36110,1082 30,028,1
JNJ172009760,1168 0,1136способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11520,0023 2,0-0,3
JNJ172059550,1168 0,1152способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11600,0011 1,0-0,2
JNJ172059550,1137 0,1195способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11660,0041 3,5-0,1
JNJ172059940,1154 0,1152способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11530,0001 0,1-0,3
JNJ172267030,2188 0,2353способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,22710,0117 5,112,6
JNJ179821330,4588 0,2521способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,35550,1462 41,127,5

JNJ179890490,3081 0,1961способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,25210,0792 31,415,5
JNJ № Исходные данные способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Среднее значение Среднеквадратическое отклонениеКоэффициент вариации, %% контрольного образца
Кондициониро-ванная среда 0,79141,1189способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,95520,2316 24,293,3
Без обработки 0,42150,5259способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,47370,0738 15,639,8
без клеток0,1152 0,1160способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11560,0006 0,50,0
AA/Wnt3a0,7168 0,8836способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 1,01510,2016 19,9100,0
RWJ6809910,2882 0,2308способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,28440,0499 17,618,8
RWJ6809920,3049 0,2845способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,31270,0282 9,021,9
RWJ6809930,5403 0,2570способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,38550,1332 34,630,0
RWJ6811400,7323 0,3034способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,43880,2041 46,535,9
RWJ6811420,1185 0,1216способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,11990,0018 1,50,5
RWJ6811460,2496 0,2683способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,23020,0376 16,312,7
RWJ6819450,1548 0,1356способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15130,0134 8,84,0
RWJ681980,1555 0,1450способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,15810,0161 10,24,7
RWJ6822050,2347 0,1920способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,37850,2589 68,429,2
RWJ4472280,1842 0,2093способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,37930,2585 68,229,3
RWJ6754300,7223 0,8707способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,42910,2452 57,234,8
RWJ3559230,6268 0,3192способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 0,33540,1667 49,724,4

Таблица VII

Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Сильно положительные результатыспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 Умеренно положительные результаты
>=120% контрольного образцаспособ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 60-120% контрольного образца
JNJ № % контрольного значения способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ № % контрольного значения
RWJ352628195,3 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26511901 115,5
JNJ26158093 183,8способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ676431 113,8
RWJ353258 180,4способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ673515 108,3
JNJ26170833 160,9способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26533156 105,5
JNJ26150202 154,6способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26153647 102,7
JNJ25757238 154,1способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ676639 93,0
JNJ19410833 151,6способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26128726 88,0
JNJ26483197 149,3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ10222784 85,5
JNJ18157711 148,0способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ67657 84,7
RWJ676139 147,3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26512005 84,0
JNJ26077883 146,2способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ19410859 80,3
RWJ352190 142,3способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26399997 79,2
JNJ26399906 136,8способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ676137 77,5
JNJ19370026 136,1способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ675260 76,9
JNJ26177762 132,8способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ355923 76,7
RWJ676432 131,6способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ675266 75,2
JNJ25758863 131,2способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26116922 71,4
RWJ675430 130,9способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26361712 70,9
JNJ24843611 130,5способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ670804 70,7
RWJ675605 129,0способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ675881 69,9

JNJ26483249128,8 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26158015 68,7
JNJ26177086 128,7способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ352244 68,2
JNJ26483249 125,7способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 RWJ674239 67,4
JNJ26399906 124,4способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26399971 66,4
RWJ675948 120,0способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26714194 63,3
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 JNJ26533065 61,1
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764 способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, патент № 2528764

Таблица VIII

Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентра-ция JNJ10220067JNJ17163796 JNJ17189731 JNJ17223375JNJ18157698
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло

клеток
SD Число клетокSD Число

клеток
SD
101,0060,051 0,0390,049 0,1930,1471,280 0,0141,049 0,062
5 1,0580,0471,164 0,0180,889 0,0351,3480,007 1,1040,014
2,51,031 0,0541,0220,023 0,8960,035 1,3180,0280,932 0,087
1,25 0,8990,040 1,1210,0231,120 0,0721,159 0,0411,0060,023
0,6250,742 0,0951,092 0,0441,1070,093 1,0290,018 0,8320,026
0,3130,7540,010 0,9310,056 1,1320,0181,018 0,0440,742 0,127
0,156 0,8220,0740,804 0,0021,082 0,0410,7760,054 0,7120,020

Концентра-ция JNJ26158015JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871JNJ17228458
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD Число клетокSD Число

клеток
SD
100,0010,001 0,0960,103 0,0580,074 0,2900,3070,000 0,000
5 0,0340,035 0,2620,2680,173 0,2070,458 0,2630,089 0,067
2,5 0,5660,4610,592 0,0190,428 0,3260,640 0,1040,4380,050
1,250,897 0,1031,124 0,1010,8500,238 0,7390,129 0,6360,016
0,6250,921 0,1221,106 0,0560,9100,061 0,8050,036 0,7360,025
0,3131,028 0,0690,888 0,2130,8680,131 0,7850,094 0,7910,038
0,1561,027 0,0670,890 0,0790,7420,051 0,7740,027 0,8320,005
Концентра-ция JNJ19370026JNJ26150202 JNJ26170833 JNJ26177086JNJ26177762
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD Число клетокSD Число

клеток
SD
100,0000,000 0,4960,690 0,1290,170 0,4120,0810,996 0,246
5 0,0240,034 0,7680,4900,530 0,0801,128 0,0260,908 0,179
2,5 1,0970,2941,001 0,1291,174 0,0161,031 0,2171,0050,086
1,251,446 0,0761,158 0,0431,1130,057 0,9140,100 1,2000,085
0,6251,296 0,1830,699 0,2481,1880,041 0,8010,136 1,1110,300
0,3131,034 0,1970,617 0,2321,1580,102 0,7850,121 0,9590,094
0,1560,826 0,0300,812 0,1200,9740,065 0,6590,068 0,9120,059

Концентра-ция JNJ26512005JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ26714194JNJ3026582
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD Число клетокSD Число

клеток
SD
100,0000,000 0,0210,027 0,0020,002 0,0520,0670,053 0,024
5 0,0000,000 0,3390,2541,011 0,499 1,1610,1340,905 0,036
2,5 0,1920,233 1,3500,1701,724 0,042 1,2930,0201,019 0,015
1,25 0,5520,458 1,2770,1011,652 0,032 1,2130,0871,163 0,062
0,625 0,8950,054 0,7130,1511,357 0,023 1,0250,0451,231 0,152
0,313 0,7340,075 0,6650,2071,213 0,177 1,2410,0311,216 0,007
0,156 0,5940,078 0,4690,4651,206 0,142 1,0410,0071,103 0,065

Таблица IX

Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентрация JNJ10220067JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375JNJ18157698
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD Интенсивность

Sox17
SD
10 0,8890,1440,029 0,0340,140 0,0951,183 0,0440,969 0,040
5 1,0040,0210,824 0,0350,785 0,0771,171 0,0101,013 0,002
2,5 1,0230,0920,849 0,0030,842 0,0321,169 0,0310,838 0,068
1,25 0,9540,1000,985 0,0821,028 0,0431,106 0,0060,940 0,071
0,625 0,7930,1350,986 0,0591,016 0,0000,931 0,0330,767 0,014
0,313 0,8030,0480,916 0,0281,058 0,0170,943 0,0560,692 0,167
0,156 0,9410,1060,822 0,0361,039 0,0150,789 0,0740,651 0,032
Концентрация JNJ26158015JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871JNJ17228458
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD Интенсивность Sox17SD
100,0010,001 0,0340,027 0,0540,063 0,2670,280 0,0000,001
50,0170,020 0,0710,054 0,1410,169 0,4020,229 0,0560,035

2,50,200 0,1570,497 0,0760,373 0,3260,605 0,0410,286 0,034
1,25 0,7920,066 0,9930,144 0,7830,2820,686 0,185 0,5870,023
0,6250,624 0,1181,061 0,0660,887 0,0620,786 0,0610,695 0,001
0,313 0,9340,127 0,9370,136 0,8590,1760,780 0,132 0,7530,098
0,1560,986 0,0550,888 0,0620,666 0,0150,782 0,0610,816 0,043
Концентрация JNJ19370026JNJ26150202 JNJ26170833 JNJ2G177086JNJ26177762
[мкМ] Интенсивность Sox17SD Интенсивность Sox17SD Интенсивность Sox17SD Интенсивность Sox17 SDИнтенсивность Sox17 SD
10 0,0000,000 0,4910,6810,281 0,3580,330 0,0590,701 0,307
5 0,0350,049 0,1580,224 0,4600,189 0,8460,036 0,7280,146
2,5 1,3360,192 0,8000,2011,018 0,1390,887 0,1910,928 0,019
1,25 1,2380,030 0,9100,045 0,9600,106 0,8190,179 1,1590,093
0,625 0,9970,095 0,5670,1901,050 0,0380,755 0,1261,136 0,186
0,313 0,7910,172 0,5150,276 1,0320,063 0,6670,125 1,0060,009
0,156 0,6690,037 0,7080,1480,950 0,0870,628 0,0530,922 0,096

Концентрация JNJ26512005JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194JNJ302G582
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD Интенсивность Sox17SD
100,0000,000 0,0180,021 0,0020,0010,054 0,0620,074 0,048
5 0,0000,000 0,2350,1741,052 0,2811,250 0,1771,0060,070
2,50,270 0,3821,153 0,2231,4590,074 1,1860,069 1,1200,038
1,250,678 0,4341,055 0,0461,3220,078 1,1120,038 1,1220,009
0,6250,978 0,0210,569 0,1241,1730,015 0,9130,005 1,2410,230
0,3130,742 0,0480,555 0,1181,1020,165 1,1400,036 1,2310,012
0,1560,508 0,0490,451 0,4431,0600,126 0,9980,006 1,0340,008

Таблица X

Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация JNJ10220067JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375JNJ18157698
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD
100,1640,209 0,0010,000 0,0490,0280,123 0,1060,770 0,077
5 0,1470,1410,616 0,4970,583 0,1550,9540,146 0,4960,011
2,50,140 0,1121,2950,402 1,1080,170 0,7950,1010,384 0,247
1,25 0,3070,198 1,2330,0581,195 0,1470,541 0,8510,3950,002
0,6250,138 0,0710,606 0,1211,1080,014 0,3320,849 0,2210,009
0,3130,0630,008 0,3970,020 0,8870,0780,206 0,0850,172 0,071
0,156 0,0690,0010,214 0,0250,699 0,1090,1420,039 0,1380,048
Концентрация JNJ26158015JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871JNJ17228458
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD
100,0010,000 0,7850,192 0,2080,1340,377 0,0400,000 0,000
5 0,0230,0241,067 0,2360,320 0,0870,3360,081 0,0520,009
2,50,681 0,2231,3680,025 0,3880,019 0,2960,0160,089 0,003
1,25 1,0110,461 1,4770,1470,334 0,1130,222 0,0350,1060,003
0,6250,927 0,1080,899 0,1080,2670,148 0,2820,096 0,1690,041
0,3130,6860,022 0,5400,094 0,1920,0560,208 0,0030,119 0,026
0,156 0,4580,0010,206 0,0890,147 0,0670,1740,051 0,0670,015
Концентрация JNJ19370026JNJ26150202 JNJ26170B33 JNJ26177086JNJ26177762
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD

100,000 0,0000,4520,094 0,0020,001 1,1170,0431,022 0,422
5 0,0020,000 0,4330,0501,325 0,0150,793 0,0301,2810,109
2,50,668 0,0590,521 0,2291,3550,026 0,6000,122 1,1970,068
1,250,9880,032 0,2930,038 1,1820,0760,442 0,0181,039 0,213
0,625 0,3900,0320,200 0,1220,928 0,1270,3710,072 0,6860,014
0,3130,250 0,0900,072 0,0250,7720,050 0,1000,015 0,4370,066
0,1560,0950,020 0,0570,044 0,3360,0560,072 0,0150,276 0,043
Концентрация JNJ26512005JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194JNJ3026582
[мкМ]Число клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSDЧисло клетокSD
100,0070,002 0,0000,000 0,0000,0000,044 0,0380,004 0,001
5 0,0020,0010,127 0,0690,415 0,0230,3820,110 0,0170,003
2,50,001 0,0010,1510,059 0,4250,082 0,3450,0010,033 0,037
1,25 0,0900,097 0,1080,0510,325 0,0420,284 0,0760,0440,028
0,6250,248 0,0580,230 0,1680,3140,062 0,2660,021 0,1000,099
0,3130,2640,048 0,0860,033 0,2670,0980,347 0,0840,057 0,032
0,156 0,1330,0690,063 0,0040,218 0,0120,1920,014 0,0700,048

Таблица XI

Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация JNJ10220067JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375JNJ18157698
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD
0,1570,0510,003 0,1320,003 0,6780,0930,116 0,0470,095 0,025
0,313 0,0520,0080,311 0,0050,951 0,0100,1550,071 0,1100,030
0,6250,103 0,0580,453 0,0761,1600,013 0,2770,061 0,1540,013
1,250,3120,255 1,0120,051 1,0420,1340,459 0,0660,317 0,062
2,5 0,1000,0620,986 0,2690,869 0,1580,7260,079 0,2970,235
50,105 0,0890,4800,423 0,4320,111 1,1140,0660,353 0,080
10 0,1210,141 0,0020,0020,022 0,0050,140 0,1100,6940,123
Концентрация JNJ26158015JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871JNJ17228458
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD
0,1570,3640,044 0,1490,058 0,1250,0510,132 0,0630,039 0,010

0,3130,577 0,0620,398 0,1660,1290,018 0,1460,005 0,0700,027
0,6250,9850,072 0,6780,197 0,2120,1340,196 0,0840,137 0,049
1,25 0,9430,4191,110 0,0420,202 0,1030,1290,029 0,0750,017
2,50,559 0,2380,8570,012 0,2090,045 0,1770,0300,053 0,005
5 0,0190,019 0,1940,0070,154 0,0230,174 0,0700,0380,001
100,001 0,0010,129 0,0370,1290,067 0,2000,022 0,0000,000
КонцентрацияJNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170B33JNJ26177086 JNJ26177762
[мкМ]Интенсивность Sox17 SDИнтенсивность Sox17 SDИнтенсивность Sox17 SDИнтенсивность Sox17 SDИнтенсивность Sox17 SD
0,157 0,0740,0240,040 0,0300,291 0,0860,0540,014 0,1860,040
0,3130,170 0,0460,051 0,0160,7460,088 0,0800,006 0,3420,068
0,6250,2460,036 0,1500,095 0,9410,1110,268 0,0500,563 0,019
1,25 0,9810,0750,155 0,0101,119 0,0450,3320,006 0,9360,186
2,50,914 0,0380,4080,279 1,3050,066 0,4320,1541,146 0,137
5 0,0010,001 0,2510,0921,185 0,0120,543 0,0041,1270,121
100,000 0,0000,262 0,0680,0000,000 0,8220,024 0,7590,328

Концентрация JNJ26512005JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194JNJ3026582
[мкМ]Интенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SDИнтенсивность Sox17SD
0,1570,0850,041 0,0490,011 0,1730,0090,146 0,0410,059 0,051
0,313 0,2400,0300,068 0,0100,203 0,0610,2820,135 0,0540,040
0,6250,165 0,0430,222 0,2010,2200,070 0,2020,013 0,0730,066
1,250,1140,134 0,0760,034 0,2020,0020,165 0,0300,053 0,035
2,5 0,0010,0010,120 0,0660,299 0,0190,2050,002 0,0420,049
50,001 0,0010,0870,036 0,3000,095 0,2340,0780,016 0,001
10 0,0090,003 0,0000,0000,000 0,0000,042 0,0280,0040,003

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, представляющих клеточную линию человека, включающий стадии:

a. культивирования плюрипотентных клеток, и

b. обработки плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион.

2. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки представляют собой клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток.

3. Способ по п.2, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, выбранных из группы, состоящей из: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tral-60 и Tral-81.

4. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.

5. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 1 до 72 часов.

6. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 12 до 48 часов.

7. Способ по п.1, где плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение 48 часов.

8. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 100 нМ до 100 мкМ.

9. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 1 мкМ до 10 мкМ.

10. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации 10 мкМ.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2528764

patent-2528764.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N5/02:
способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом -  патент 2528250 (10.09.2014)
способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани -  патент 2527182 (27.08.2014)
способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкмнк) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ммск) -  патент 2525143 (10.08.2014)
композиция для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей -  патент 2522816 (20.07.2014)
клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности -  патент 2510833 (10.04.2014)
способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда -  патент 2505602 (27.01.2014)
стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции -  патент 2499043 (20.11.2013)
малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека -  патент 2493250 (20.09.2013)
стимуляция пути wnt при перепрограммировании соматических клеток -  патент 2492232 (10.09.2013)
способ оценки нейтрофилоцитопоэза на основе способности клеток реагировать на нейтрофилокины -  патент 2473903 (27.01.2013)


Наверх