ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы

Классы МПК:C12N15/05 клетки растений
C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Автор(ы):, , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Вафин Рамиль Ришадович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-01-29
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники использованием прямого праймера 4F-c: 5'-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3'. Также описан способ ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI. Цель изобретения - разработка способов проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2528748

способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748

Описание изобретения

Изобретение относится к области биохимии, а также селекции и семеноводства, в частности к молекулярной идентификации генотипов пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов для маркер-вспомогательной селекции сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.

Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) с праймерами: 4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3 / и 4R: 5/-TCGTACCCGTCG-ATGAAGTCGA-3/ , инициирующими амплификацию соответствующих аллель-специфичных продуктов Wx-Al-, Wx-Bl- и Wх-Dl-локусов. [1].

Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР [1] является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-Blb от активного аллеля Wx-Ble, а также трудность дискриминации Wx-Ala от Wx-Alg.

Цель изобретения - разработка способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Нами разработан способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, схожий с прототипом [1], включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из dH2O, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, с тем отличием, что на этапе ПЦР используется прямой праймер: 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ /(SEQ ID NO: 1), а процедура ПДРФ-анализа проводится с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.

Условия проведения реакции

Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы осуществляли сорбционным способом («ДНК-сорб С», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР и ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколам идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, представленным в табл.1-2.

Детекцию результатов ДНК-анализа проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 =310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллелей Waxy-генов пшеницы: CLUSTAL W (v.1.83).

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию предложенного способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, ввиду корректной интерпретации генерируемых ПЦР-продуктов (фиг.3) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (фиг.4), сопоставимых с расчетными данными (фиг.1-2).

Источники информации

1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. - 2009. - V.12. - N.1. - P.1-9.

Табл.1
Протокол ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (прототип)
Протокол ПЦР
Реагенты Исходная концентрацияРабочая концентрация 1 проба (мкл)10 проб (мкл)
dH2O способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 13,4134
dNTPs2,5 мМ0,25 мМ2 20
Буфер 10× 220
Taq ДНК полимераза5 ед 1 ед0,22
4F50 мкМ 0,5 мкМ0,2 2
4R50 мкМ0,5 мкМ0,2 2
Проба ДНК способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 2способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
ВСЕГО способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 20способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ (16 н.)
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3 / (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 58°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 257 (261) bp=Wx-Ala или Wx-Alg (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb
Наличие 227 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 299 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb

Табл.2
Протокол ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (предлагаемый способ)
Протокол ПЦР
Реагенты Исходная концентрацияРабочая концентрация 1 проба (мкл)10 проб (мкл)
dH2O способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 13,4134
dNTPs 2,5 мМ0,25 мМ 220
Буфер 10×220
Taq ДНК полимераза 5 ед1 ед0,2 2
4F-c 50 мкМ 0,5 мкМ0,22
4R 50 мкМ0,5 мкМ 0,22
Проба ДНКспособ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 2способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
ВСЕГО способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 20способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ (21 н.)
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3 / (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 64°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Протокол ПДРФ
Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация1 проба (мкл) 10 проб (мкл)
dH2Oспособ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 1,7517,5
BSA 10 мг/мл0,1 мг/мл 0,252,5
SE-буфер W10×2,525
AcsI 20 U10 U0,5 5
ПЦР-пробаспособ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 20способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
ВСЕГО способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748 25способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных   вариантов waxy-генов пшеницы, патент № 2528748
Инкубация при 50°C в течение 3 часов
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 266 bp=Wx-Ble
Наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.2.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.3.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: A) прототип (праймеры 4F+4R). B) предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c+4R). M) ДНК-маркеры 100-1500 bp (СибЭнзим). 1-9) генотипы пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 1-4) Wx-Ala/Bla/Dla; 5-7) Wx-Alg/Bla/Dla. 8-9) Wx-Ala/Blb/Dla.

Пояснение к фиг.4.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: M) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа пшеницы с комбинацией аллелей Wx-Ala/Bla/Dla (304/262/232 bp). 2-7) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 2) Wx-Ala/Bla/Dla (156/148/114/84 bp); 3-5) Wx-Alg/Bla/Dla (156/148/84 bp); 6-7) Wx-Ala/Blb/Dla (156/148/114 bp).

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, отличающийся тем, что используется прямой праймер 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3 //(SEQ ID NO: 1) со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-продуктов:

наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,

наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,

наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.

2. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий п.1, отличающийся тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI, со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-ПДРФ-фрагментов:

наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,

наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,

наличие 266 bp=Wx-Ble,

наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2528748

patent-2528748.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N15/05 клетки растений

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

Патенты РФ в классе C12Q1/68:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)
способ и набор для детекции микроорганизмов -  патент 2527897 (10.09.2014)


Наверх