способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1

Классы МПК:C12N15/06 клетки животных
C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):Вафин Рамиль Ришадович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-01-29
публикация патента:

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров:

DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1)

DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2)

DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3),

а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2). 2 ил., 2 табл. способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

Рисунки к патенту РФ 2528743

способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена DGAT1 (дкацилглицерол O-ацилтрансфераза 1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Так, в способе, предложенном J. Komisarek (2008) [1], используются праймеры F: 5/-TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3 / и R: 5/-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3/ , инициирующие амплификацию локуса DGAT1-гена длиной 378 bp, с последующим его эндонуклеазным расщеплением рестриктазой BglI для генерации и интерпретации образующихся генотип-специфичных фрагментов (генотип AA=254/96/28 bp, генотип KK=282/96 bp и генотип AK=282/254/96/28 bp).

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену DGAT1 на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Нами разработан способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Условия проведения реакции

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб Б», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл.1.

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 =310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (AA, KK, AK) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов (AA=82/18 bp, KK=100 bp и AK=100/82/18 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 100 bp и 82 bp являются идентификационными, а минорный ПДРФ-фрагмент длиной 18 bp - неинформативным, из-за его малого размера, что существенно не снижает точность ДНК-анализа.

Источники информации

1. Komisarek, J.A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle / J. Komisarek, A, Michalak // Animal Science Papers and Reports. - 2008. - V.26. - N.2. - P.89-95.

Таблица 1
Протокол ПЦР-ПДРФ для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям A и K гена DGAT1
Протокол ПЦР
Реагенты Исходная кон центрацияРабочая концентрация 1 проба (мкл)10 проб (мкл)
dH2O способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 13.4134
ДМСО100% 5%1 10
dNTP 2,5 мМ0,25 мМ 220
Буфер 10× 220
Таq ДНК Полимераза5 ед 1 ед0,22
SEQ ID NO: 1 50 мкМ0,25 мкМ 0,11
SEQ ID NO: 250 мкМ 0,25 мкМ0,11
SEQ ID NO: 3 50 мкМ0,5 мкМ 0,22
Проба ДНКспособ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 1способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743
ВСЕГО способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 20способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

Праймеры:

способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

Режим амплификации

×1:94°C - 4 мин

×40:94°C - 10 сек, 72°C - 10 сек

×1:72°C - 5 мин

ХРАНЕНИЕ +10°C

ПЦР-продукт = 100 bp

Протокол ПДРФ

РеагентыИсходная концентрацияРабочая концентрация 1 проба10 проб
dH2O способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 1,2512,5
BSA10 мг/мл 0,1 мг/мл0,25 2,5
SE-буфер Y10× 2,525
TaqI20 U 20 U110
ПЦР-пробаспособ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 20способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743
ВСЕГО способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743 25способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

Инкубация при 65°C в течение ночи

ПЦР-ПДФР-фрагменты:

Генотип AA=82/18 bp

Генотип KK=100 bp

Генотип AK=100/82/18 bp

Электрофорез в 3% агарозе

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1 - Фланкируемые участки праймеров, используемые для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1 предложенным способом проведения ПЦР-ПДРФ.

Пояснение к фиг.2 - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Обозначения:

M) ДНК-маркеры 100 bp+50 bp (СибЭнзим).

1-4, 6, 8-11, 13, 15, 17-18) генотип АК гена DGAT1 кр.рог.ск.

5, 16) генотип AA гена DGAT1 кр.рог.ск.

7, 12. 14) генотип КК гена DGAT1 кр.рог.ск.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого   скота по аллелям а и к гена dgat1, патент № 2528743

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2528743

patent-2528743.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N15/06 клетки животных

Патенты РФ в классе C12N15/06:
экспрессионная генетическая конструкция poptivec/f8bdd, кодирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови viii человека с делецией в-домена, и клеточная линия dg-ov-f8bdd-18, продуцирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови viii человека с делецией в-домена -  патент 2429294 (20.09.2011)
способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка -  патент 2425882 (10.08.2011)
способ селекции клеток in vivo с помощью лизомустина -  патент 2425149 (27.07.2011)
способ снятия барьера гистонесовместимости при ксеногенной клеточной терапии -  патент 2308278 (20.10.2007)
гибридная клеточная линия (варианты), препарат антител (варианты), способ диагностики рассеянного склероза у человека (варианты), способ лечения человека, полипептид -  патент 2137131 (10.09.1999)
способ повышения продукции протеина с (варианты) -  патент 2110574 (10.05.1998)
способ введения чужеродной днк в сперматозоиды -  патент 2081914 (20.06.1997)
способ слияния клеток -  патент 2032746 (10.04.1995)

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

Патенты РФ в классе C12Q1/68:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)
способ и набор для детекции микроорганизмов -  патент 2527897 (10.09.2014)


Наверх