набор синтетических олигонуклеитидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (rhodiola quadrifida (pall.) fisch. et mey.)

Классы МПК:C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
C12N15/11 фрагменты ДНК или РНК; их модифицированные формы
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-06-10
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey). Набор включает видоспецифичные участки для создания прямого, обратного праймеров и разрушаемого зонда, а именно прямой праймер - CGGCAACGGATATCTCGGCT-3', обратный праймер - 5'-GGCCTCGCААССАССACTTGTC-3', разрушаемый зонд - (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3'-(гаситель). Предложенное изобретение позволяет достоверно, быстро и с высокой чувствительностью идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) в ходе проведения скрининга растительного сырья. 1 ил., 1 пр.

Рисунки к патенту РФ 2526499

набор синтетических олигонуклеитидов для выявления видовой принадлежности   родиолы четырехнадрезной (rhodiola quadrifida (pall.) fisch.   et mey.), патент № 2526499

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце, в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля.

При проведении анализа методов детекции продукта полимеразной цепной реакции выбран метод на основе разрушаемого зонда, так как он относится к специфичным методам детекции, возможно свободное использование без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J.F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434], и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53,2-3].

Прототип - рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers/ZPlanta Med. 2007, Oct; 73(13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. В прототипе используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений.

Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируется лекарственное растение с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров отличные от заявленных. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, где для идентификации данного растения используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав).

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) не известны.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.

Пример:

1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 10 сек, 58°С - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь конечным объемом 25 мкл содержит: 14,1 мкл Н2O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgCl 2; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис.1.

Для выявления родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.), в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GGCCTCGCAACCACCACTTGTC-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3'-(гаситель). Гаситель располагается и на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов. Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющий быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, отличающийся тем, что для выявления родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) используют видоспецифичные участки для создания прямого, обратного праймеров и разрушаемого зонда:

в качестве прямого праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3',

в качестве обратного праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GGCCTCGCААССАССACTTGTC-3',

в качестве разрушаемого зонда - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2526499

patent-2526499.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

Патенты РФ в классе C12Q1/68:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)

Класс C12N15/11 фрагменты ДНК или РНК; их модифицированные формы

Патенты РФ в классе C12N15/11:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
способ определения генотипов золотистого стафилококка -  патент 2526497 (20.08.2014)
набор для выявления возбудителя ку-лихорадки в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (пцр-рв) -  патент 2525059 (10.08.2014)
набор последовательностей олигонуклеотидов для диагностики герминальных мутаций в гене ret, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к раку щитовидной железы -  патент 2524433 (27.07.2014)
синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии -  патент 2524431 (27.07.2014)
одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения -  патент 2523596 (20.07.2014)
способ амплификации и детекции нуклеотидных последовательностей в реакционной смеси и используемый в нем набор -  патент 2523589 (20.07.2014)


Наверх