способ прогнозирования течения бактериальных гнойных менингитов у детей

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения бактериальных гнойных менингитов у детей путем определения клеточных популяций в цереброспинальной жидкости, отличающийся тем, что в клеточных популяциях иммуноцитохимическим методом определяют наличие CD31 и S100 позитивных клеток в 1-2 день заболевания, и при содержании CD31 более 0,5% и наличии S100 позитивных клеток прогнозируют неблагоприятное течение БГМ, а при содержании CD31 менее 0,5% и отсутствии S100 позитивных клеток прогнозируют благоприятное течение заболевания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно инфектологии и патологической анатомии, может быть использовано для прогнозирования течения и исходов бактериальных гнойных менингитов (БГМ) различной этиологии у детей.

Актуальность проблемы БГМ определяется тяжестью их течения (Покровский В.И. и соавт., 1976; Лобзин Ю.В. и соавт., 2003), частым развитием угрожающих жизни церебральных и экстрацеребральных осложнений и стойких резидуальных последствий, а также сохраняющейся высокой летальностью, достигающей в различных возрастных группах от 15% до 70% (Сорокина М.Н. и соавт., 2003; Цинзерлинг В.А. и соавт., 2005; Платонов А.Е. и соавт., 2007).

БГМ у детей являются самой частой нейроинфекционной патологией (Сорокина М.Н., Иванова В.В., Скрипченко Н.В., 2003). БГМ характеризуются высокой летальностью (до 37%), высокой частотой осложнений (до 85%) и инвалидизирующих проявлений у каждого реконвалесцента (Платонов А.Е., Николаев М.К., 2007). Это обусловлено, с одной стороны, анатомо-физиологическими особенностями нервной системы, такими как: большей относительной величиной головного мозга, его высокой гидрофильностью, обильной васкуляризацией, незавершенностью процессов миелинизации, повышенной судорожной готовностью, с чем связано быстрое развитие отека головного мозга и синдрома внутричерепной гипертензии, септического шока и ДВС-синдрома, судорожно-коматозного статуса (Щеплягина Л.А., 2006). С другой стороны, причинами осложненного течения острых нейроинфекций являются неэффективный интратекальный иммунный ответ, неспособный предотвратить диссеминацию и обеспечить элиминацию возбудителя, обусловленный частой незрелостью нейроиммунных процессов у детей (Скрипченко Н.В., 1993).

Морфологические особенности БГМ у детей во многом обусловлены патогенными свойствами возбудителя, которые вызывают закономерные типовые патологические процессы, от характера и степени выраженности которых зависят течение и прогноз заболевания. Течение заболевания и прогноз определяется глубиной повреждения сосудов микроциркуляторного русла и мозговой ткани, проявляющихся основными типовыми патологическими изменениями (спазм или парез сосудов, наличие тромбоза сосудов, диапедезных периваскулярных кровоизлияний и других) (Насыров, Р.А. Патоморфогенез бактериальных гнойных менингитов у детей / Р.А. Насыров, М.В. Маньков // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - № 3. - С.59-61). Таким образом, раннее прогнозирование течения БГМ у детей является необходимым условием для своевременной коррекции терапии, направленной на профилактику осложнений и минимизацию последствий БГМ.

Известны способы, определяющие тяжесть БГМ, основанные на подсчете клеточного состава ЦСЖ с определением основных клеточных популяций:

лимфоцитов, плазматических клеток, мононуклеарных фагоцитов, нейтрофилов, базофилов, тучных клеток, клеток арахноидэндотелия, эпендимы, сосудистых сплетений желудочков (Бургман Г.П., Возная А.Ц. Практическое руководство по исследованию цереброспинальной жидкости. - М.: Медгиз, 1956. 48 с.). Методика основана на изучении содержания клеточных элементов в 1 мкл и подсчете относительного содержания каждой из клеточных популяций. Однако этот способ субъективен и позволяет дифференцировать клеточные элементы лишь на основании фенотипических особенностей, в условиях патологии претерпевающих значительные изменения, и не обеспечивает точности прогноза БГМ.

Известен способ диагностики тяжести воспалительного процесса при БГМ у детей (патент RU № 2340902 МПК G01N 33/68), в основе которого лежит определение уровня содержания альфа-2-макроглобулина в ЦСЖ методом иммунотурбидиметрии. Различная концентрация альфа-2-макроглобулина в ЦСЖ является критерием определения степени тяжести воспалительного процесса при БГМ. Вместе с тем, определение только степени тяжести воспалительного процесса не позволяет прогнозировать течение БГМ и развитие резидуальных последствий.

Известен способ прогнозирования течения БГМ (патент RU № 2467696, МПК А61В 10/00, G01N 33/48), основанный на вычислении интегрального показателя, учитывающего возраст пациентов, уровень нарушения сознания на момент госпитализации, время поступления в стационар от момента начала заболевания, концентрацию белка в ЦСЖ и наличие генерализованных судорог. Величина интегрального показателя лежит в основе прогнозирования циклического или ациклического течения БГМ, а также высокой вероятности наступления летального исхода. Однако метод разработан и может быть использован только у взрослых пациентов и не используется у детей. Кроме того, прогностическими критериями рассматриваемого способа являются анамнестические данные, а также клинические симптомы, являющиеся лишь внешним проявлением патологического процесса, тогда как критерии, отражающие морфоструктурные изменения, за исключением учета концентрации белка в ЦСЖ, не учитываются. Таким образом, способ не обеспечивает точность прогнозирования.

Наиболее близким к заявленному способу является метод прижизненной ликворологической оценки церебральной эндотелиальной деструкции (Пилипенко, В.В. Методика и возможности прижизненной ликворологической оценки церебральной эндотелиальной деструкции при энтеровирусном менингите / В.В. Пилипенко, И.А. Вознюк, М.В. Клур и соавт. // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. Т.4, № 4 - 2010. - С.20-24), основанный на определении уровня содержания десквамированных эндотелиальных клеток в ЦСЖ, отражающий степень выраженности церебральной эндотелиальной деструкции.

Авторы показали эффективность использования цитологического метода в определении уровня содержания десквамированных эндотелиальных клеток в ЦСЖ у взрослых при энтеровирусных менингитах. В данном способе иммуноцитохимический (ИЦХ) метод с мышинными моноклональными антителами к эндотелиальным клеткам (CD31) использовался в качестве метода сравнения.

На основании этого метода оценивалась только воспроизводимость цитологического метода.

Метод использовался у взрослых пациентов, переносящих энтеровирусный менингит, и не был использован у детей, переносящих БГМ. Метод не предполагает определение выраженности повреждения нервной ткани, не обеспечивает точности прогнозирования как благоприятных, так и неблагоприятных исходов БГМ у детей.

Устранение указанных недостатков может быть осуществлено применением предлагаемого авторами способа прогнозирования течения бактериальных гнойных менингитов у детей.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности прогноза течения БГМ у детей за счет определения уровня содержания S100-позитивных и CD31-позитивных клеток в ЦСЖ.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем определение клеточных популяций в цереброспинальной жидкости, авторы в клеточных популяциях иммуноцитохимическим методом в цереброспинальной жидкости определяют наличие CD31 и S100 позитивных клеток в 1-2 день заболевания, и при содержании CD31 более 0,5% и наличии S100 позитивных клеток прогнозируют неблагоприятное течение БГМ, а при содержании CD31 менее 0,5% и отсутствии S100-позитивных клеток в ранний период заболевания прогнозируют благоприятное течение заболевания.

Многолетний опыт работы с БГМ у детей позволил нам установить отсутствие прямой зависимости исходов заболевания от тяжести течения в первые дни болезни, когда у части больных при одинаково тяжелом течении заболевания отмечалась стойкая положительная динамика и выздоровление при адекватной этиотропной и патогенетической терапии, тогда как у части больных при тех же условиях заболевание приобретало затяжное и осложненное течение, а также характеризовалось стойкими резидуальными последствиями.

Авторы для повышения точности прогноза течения БГМ у детей использовали метод ИЦХ, позволяющий фенотипировать клеточные популяции, конституционально экспрессирующие CD31 и S100, в условиях нормы не встречающиеся в ЦСЖ.

Авторами показана ценность использования комплексного ИЦХ исследования в увеличении точности прогноза течения БГМ у детей, при котором осуществляется фенотипирование различных клеточных популяций, содержащихся в патологически измененной ЦСЖ, характеризующих повреждение сосудов микроциркуляторного русла (CD31) и деструктивных изменений нервной ткани (S100).

Установлено, что лишь совокупность прогностических критериев, отражающих состояние различных структурных образований при БГМ, обеспечивает точность прогноза течения заболевания. Многолетними исследованиями, проводившимися в НИИ детских инфекций, показано, что при нейроинфекционных заболеваниях у детей до 85% повреждений нервной ткани обусловлено гипоксией вследствие ишемии, непосредственно связанной с повреждением сосудов микроциркуляторного русла.

Авторами установлена прогностическая ценность определения уровня содержания десквамированных CD31-позитивных клеток в ЦСЖ, являющихся прямым маркером эндотелиального повреждения. Авторами показано, что высокий уровень содержания CD31- позитивных клеток в ЦСЖ отражает глубокие и распространенные повреждения сосудов микроциркуляторного русла.

Многочисленные клинико-морфологические сопоставления при БГМ, проведенные авторами, позволили установить в качестве прогностического критерия пороговый уровень содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ 0,5% от всех клеточных элементов, содержащихся в ЦСЖ. Установлено, что при уровне содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ в количестве <0,5% в начальном периоде заболевания наиболее вероятно благоприятное течение БГМ. Содержание CD31-позитивных клеток в ЦСЖ при уровне >0,5% от всех клеточных элементов, содержащихся в ЦСЖ, наиболее вероятно свидетельствует о неблагоприятном течении БГМ.

Авторами обнаружено, что для повышения точности прогнозирования течения БГМ у детей необходимо использование нейроспецифического белка S100. Установлено, что наличие S100-позитивных клеток в ЦСЖ является свидетельством деструктивного патологического процесса в ткани головного мозга, указывая на крайне неблагоприятное течение БГМ, а деструкция нервной ткани лежит в основе неврологического дефицита у таких детей.

Авторами доказана высокая прогностическая ценность ИЦХ количественной оценки повреждения эндотелия сосудов, осуществляемая по определению уровня содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ, а также количественной оценки глубины повреждения ткани головного мозга, определяемой по уровню содержания клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100 в ЦСЖ, определяемых в первые-вторые сутки пребывания детей в стационаре и в случае отсутствия положительной клинико-лабораторной динамики повторно на 3-4 сутки пребывания.

Авторами показано, что определение прогностических критериев тяжести течения БГМ, характеризующих наиболее важные и лежащие в основе формирования неблагоприятных исходов БГМ звенья патогенеза этих нейроинфекционных заболеваний в ранние сроки заболевания позволяет своевременно корректировать терапию и проводить профилактику осложнений. Данный способ осуществляется следующим образом. У детей, больных БГМ, при люмбальной пункции получали ЦСЖ в первые-вторые сутки пребывания в стационаре и повторно на 3-4 сутки пребывания в стационаре при отсутствии или недостаточно выраженной положительной динамике клинических проявлений заболевания. Из полученной при люмбальной пункции ЦСЖ приготавливались цитологические препараты с использованием цитоцентрифуги Cytospin 4 (Thermo), позволяющей получить клеточный монослой на предметном стекле. После фиксации 70% этиловым спиртом цитологические препараты подвергались ИЦХ окрашиванию в аппарате для иммуноцитохимических и иммуногистохимических исследований Autostainer A360 (Thermo). Для проведения ИЦХ реакции использовались мышиные моноклональные антитела к S100 (в разведении 1/100) и к CD31 (в разведении 1/80) производства Novocastra Lab (Великобритания), а также высокочувствительная и высокоспецифичная полимерная иммуногистохимическая система En Vision (DAKO, Дания). В качестве оптически плотной метки, визуализирующей продукт реакции ангиген-антитело в клеточном материале, использовался диаминобензидин. После проведения ИЦХ реакции цитологические препараты докрашивали и заключали.

Учет результатов ИЦХ исследования осуществлялся при микроскопии в проходящем свете в 5 полях зрения при суммарном увеличении микроскопа ×400. S100-позитивные и CD31-позитивные клетки имели отчетливое коричневое окрашивание, тогда как остальные (негативные) клеточные элементы окрашивались гематоксилином в синий цвет (рис.1 и рис.2). Определялось среднее процентное соотношение клеток, экспрессирующих S100 и CD31 ко всем имеющимся в цитологическом препарате клеточным элементам. Имеющиеся в цитологическом препарате эритроциты при подсчете не учитывались.

При наличии S100-позитивных клеток вне зависимости от их количества и наличия >0,5% CD31-позитивных клеток в ЦСЖ в начале заболевания прогнозируют неблагоприятное течение БГМ. При отсутствии S100-позитивных клеток и при содержании <0,5% CD31-позитивных клеток в ЦСЖ в начале заболевания прогнозируют благоприятное течение БГМ.

Таким образом, предложенный авторами способ отличается новизной, неочевидностью, изобретательским уровнем, что обеспечивает положительный результат. В доступной нам литературе подобного способа прогнозирования течения БГМ у детей раннего возраста не обнаружено, а совокупность предложенных авторами признаков позволяет нам заявить способ как заявочный материал на изобретение.

Под нашим наблюдением находились 24 ребенка в возрасте до 3 лет с БГМ пневмококковой (n=3), менингококковой (n=9) и гемофильной (n=11) этиологии. В 66,6% наблюдений заболевание характеризовалось благоприятным исходом с положительной клинической динамикой на фоне адекватной этиотропной и патогенетической терапии в виде купирования общеинфекционного синдрома и неврологической симптоматики, санации ликвора к 9-10 дню пребывания в стационаре и отсутствием тяжелых резидуальных последствий. В 33,4% наблюдалось неблагоприятное течение заболевания с длительным сохранением общеинфекционного синдрома, неврологической симптоматики и патологических изменений в ЦСЖ, а также частым развитием осложнений в виде эпилепсии, гидроцефалии, тугоухости и парезов. Результаты ИЦХ исследования ЦСЖ представлены в табл.1.

Таблица 1
Среднее содержание CD31-позитивных и S100-позитивных клеток в ЦСЖ у детей, переносящих БГМ с благоприятным и неблагоприятным исходами
Исход заболевания		1-2 день	3-4 день	9-10 день
Благоприятный исход (n=16)	CD31, %	0,320,14	-	0,160,07
	8100, %	0	-	0
Неблагоприятный исход (n=8)	CD31, %	1,450,33	1,170,54	0,820,65
	S100, %	0,020,01	0,010,01	0

Отмечено, что у пациентов, переносящих БГМ с благоприятным исходом, клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100 в ЦСЖ, не содержится ни в дебюте заболевания, ни в период санации ликвора, что обусловлено отсутствием выраженного повреждения мозговой ткани. У этих же пациентов отмечалось низкое содержание CD31-позитивных десквамированных эндотелиоцитов в ЦСЖ (0,320,14% в начале заболевания с достоверным снижением их содержания до 0,160,07% к 7-8 дню пребывания в стационаре, p=0,0003), отражающее умеренное повреждение сосудов микроциркуляторного русла при БГМ в разгаре заболевания с его снижением по мере развития саногенеза. Неблагоприятное течение БГМ характеризовалось высоким уровнем повреждения сосудов микроциркуляторного русла головного мозга, о чем свидетельствует достоверно более высокий уровень содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ (1,450,33% у больных с неблагоприятным течением против 0,320,14% у больных с благоприятным течением БГМ, p<0,05). Тяжесть повреждения ткани головного мозга у детей с неблагоприятным течением БГМ документировалась наличием в ЦСЖ клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100.

Из представленных данных следует, что для БГМ с благоприятным исходом характерно отсутствие в ЦСЖ клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100, а также низкий уровень содержания CD31-позитивных клеток (не более 0,5%). Для БГМ с неблагоприятным течением характерно наличие высокого уровня содержания CD31-позитивных клеток (более 0,5%) и наличие клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100 в ЦСЖ в первые дни заболевания, сохраняющиеся в нем на 3-4 и 7-8 дни пребывания в стационаре.

Эффективность предлагаемого способа прогнозирования течения БГМ может быть подтверждена клиническими примерами.

Пример 1. Ребенок М., 10 месяцев, остро заболел БГМ менингококковой этиологии с типичной клинической картиной. По данным лабораторного исследования ЦСЖ на 2 день заболевания характер изменений носил гнойный характер, цитоз составил 1500/3 за счет нейтрофилов, в клиническом анализе крови 21,2 тыс. в мкл. При ИЦХ исследовании ЦСЖ на 2 день болезни содержание CD31-позитивных клеток составило 0,2%, клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100, выявлено не было. Результаты ИЦХ исследования ЦСЖ позволили прогнозировать благоприятный исход заболевания. На фоне адекватной этиотропной и патогенетической терапии состояние ребенка и лабораторные показатели улучшались, и на 9 день болезнь ЦСЖ была санирована, цитоз составил 50/3 за счет моноцитов, лейкоцитоз в периферической крови составил 8 тыс. в мкл. При ИЦХ исследовании на 9 день болезни CD31-позитивных и S100-позитивных клеток выявлено не было. Ребенок был выписан домой, проведя в стационаре 11 койкодней.

Пример 2. Ребенок Г., 2 года 6 месяцев, переносил БГМ, вызванный Hib. При поступлении в стационар состояние ребенка было тяжелым за счет общеинфекционного синдрома и выраженной неврологической симптоматики, что потребовало наблюдения и интенсивной терапии в условиях ОРИТ. Изменения ЦСЖ носили выраженный гнойный характер, на 2 день заболевания цитоз составил 13824/3 за счет нейтрофилов, в клинической крови наблюдался выраженный лейкоцитоз - до 25,2 тыс. в мкл. При ИЦХ исследовании уровень содержания CD31-позитивных клеток составил 0,9%, S100-позитивных клеток выявлено не было. В динамике, к 10 дню болезни на фоне адекватной этиотропной и патогенетической терапии состояние ребенка улучшилось, показатель цитоза снизился до 640/3 за счет моноцитов, лейкоцитоз нормализовался до 7,8 тыс. в мкл. В ЦСЖ было отмечено снижение уровня содержания CD31-позитивных клеток до 0,4%, S100-позитивных клеток по-прежнему выявлено не было. На 11 день болезни показатель цитоза составил 362/3, состояние имело тенденцию к улучшению. Ребенок находился в стационаре 15 койкодней и был выписан домой с выздоровлением. Представленный клинический пример демонстрирует наблюдение с выраженным повреждением сосудов микроциркуляторного русла головного мозга при тяжелом БГМ, о чем свидетельствует высокий уровень содержания CD31-позитивных десквамированных эндотелиоцитов в ЦСЖ в дебюте заболевания и медленная санация ликвора, однако без катастрофических повреждений ткани головного мозга, что документируется отсутствием в ней клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100. Несмотря на высокий уровень содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ в дебюте заболевания, отсутствие S100-позитивных клеток и значительное снижение уровня содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ в динамике позволили прогнозировать благоприятный исход заболевания.

Пример 3. Ребенок И., 1 год 1 месяц, переносил пневмококковый БГМ с выраженной неврологической симптоматикой и развитием яркого общеинфекционного синдрома. При лабораторном исследовании ликвора на 2 сутки заболевания установлен гнойный характер изменения ликвора с цитозом 3500/3 за счет нейтрофилов, высоким лейкоцитозом - до 27,3 тыс. в мкл. При ИЦХ исследовании выявлен высокий уровень содержания CD31-позитивных клеток в ЦСЖ, составивший 1,4%, а также наличие 0,02% клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100, что позволило уже на 2 день заболевания прогнозировать неблагоприятный исход заболевания. Заболевание носило затяжной характер, Длительность лихорадочного периода составила 22 дня. На 15 день болезни в ЦСЖ цитоз составил 435/3 за счет нейтрофилов и моноцитов, содержание CD31-позитивных клеток составило 0,8%, а клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100, снизилось до 0,01%. Ребенок находился на стационарном лечении 34 койкодня с развитием нейросенсорной тугоухости. Пример иллюстрирует неблагоприятное течение БГМ, прогноз которого стал возможным при выявлении высокого уровня содержания CD31-позитивных клеток и выявлении клеток, экспрессирующих нейроспецифический белок S100 в ЦСЖ уже на 2 сутки заболевания.

Таким образом, применение предложенного способа ликворо-цитологического прогноза течения БГМ у детей позволяет прогнозировать на ранних сроках болезни благоприятное и неблагоприятное течение заболевания, а также проводить мониторинг состояния сосудов микроциркуляторного русла головного мозга в ходе заболевания и корректировать терапию. Ранняя профилактика осложнений на основании неблагоприятного прогноза приводит к снижению затрат на лечение развившихся осложнений.