штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина

Классы МПК:C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины
C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии
C12P21/00 Получение пептидов или протеинов
C12R1/19 Escherichia coli
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-11-15
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента биологически активного флагеллина. Охарактеризованный штамм получен трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ151FliC, полученной на основе вектора рЕТ151FliC, в который был встроен ген fliC, кодирующий биологически активный флагеллин, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в Seq ID No 3. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369. Представленное решение обладает более высокой продуцирующей способностью в отношении рекомбинантного флагеллина, являющегося эффективным адъювантом. 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Рисунки к патенту РФ 2524133

штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантного флагеллина с помощью штамма бактерий Escherichia coli.

Бактериальный белок флагеллин является эффективным стимулятором иммунной системы. Взаимодействуя с клеточным рецептором TLR-5, который экспрессируется на поверхности клеток эпителия, эндотелия сосудов, нейтрофилов, моноцитов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов, флагеллин вызывает быструю продукцию клетками противовоспалительных цитокинов и хемакинов, активирующих иммунные клетки и привлекающих их к месту внедрения патогена. Особую роль в развитии иммунного ответа играет взаимодействие флагеллина с TLR-5 дендритных клеток, стимулирующее созревание дендритных клеток, выражающееся, в частности, в экспрессии на их поверхности CD80, CD86, MHCII. Стимулированные флагеллином дендритные клетки усиленно продуцируют TNF-штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 , IL-8, IL-1штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 , MCP-1, MIP-1штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 , MIP-1штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 , RANTES. Показано, что дендритные клетки, стимулированные флагеллингом, в свою очередь, стимулируют пролиферацию Т-клеток и продукцию ими интерферона-штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина, патент № 2524133 . Активация флагеллином моноцитов и макрофагов также усиливает иммунный ответ посредством стимулирования фагоцитоза.

Иммуностимулирующее действие флагеллина проявляется как при его системном введении, так и при воздействии на слизистые оболочки. Взаимодействие с рецептором TLR-5 высокоспецифично и происходит при низких концентрациях флагеллина - до 8,5×10-10 М. Кроме того, поскольку TLR-5 расположен на поверхности клеток, взаимодействие с ним флагеллина не требует предварительного фагоцитоза, чем объясняется быстрота реакции клеток на флагеллин.

Известен ряд патентов, где флагеллин используется в качестве адъюванта при иммунизации против ряда патогенов, в том числе белка, слитого с целевым антигеном в единую полипептидную цепь [WO 2006078657, WO 2011028875], в виде смеси с целевым иммуногеном [EA 201001820] или в виде вирусоподобных частиц, содержащих флагеллин и целевой антиген [US 201205082, WO 2009128949].

Известен патент, где флагеллин может использоваться в качестве иммуностимулятора и иммуномодулятора для лечения заболеваний, связанным с хронической бактериальной инфекцией [WO 2007098371].

Известно также антиапоптотическое действие флагеллина, которое позволило использовать его в качестве радиопротектора и хемопротектора [EA 010291, WO 2009102818].

Недостатком данной технологии является недостаточная эффективность рекомбинантного флагеллина, а также высокая себестоимость флагеллина, связанная с его низким выходом.

Известна технология получения рекомбинантного флагеллина, где предложено его получение из Flic Salmonella entericf Serovar Typhimurium ATCC 14028 [заявка EA 201001820, 2010]. Недостаток данного метода получения флагеллина заключается в необходимости работы с культурой Salmonella, что требует повышенных мер безопасности, увеличивает объем финансовых затрат и времени на получение флагеллина.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является разработка авторов [Матюнина Е.А. и др. «Получение рекомбинантного белка FliC в клетках Е. coli»<URL: http://shmain.ru/nauchnye-stati/matyunina-e-a-al-shexadat-r-i-duxovlinov-i-v-poluchenie-rekombinantnogo-belka-flic-v-kletkax-e-coli.html>, где показана возможность получения флагеллина из Е. coli, однако дальнейшие проведенные авторами испытания показали, что он является денатурированным и поэтому неактивным, что вызвало необходимость проведения дополнительных работ, приведших к созданию настоящего изобретения.

Для устранения всех этих недостатков существует необходимость в бактериальных продуцентах, обеспечивающих высокий уровень продукции высокоактивного флагеллина.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии, позволяющей получать активный рекомбинантный флагеллин (с удельной активностью не менее 106 Единиц активности/мг), и повышение выхода продукции.

Технический результат был достигнут созданием штамма Escherichia coli BL21[DE3]pET151FliC - продуцента высокоактивного рекомбинантного флагеллина, полученного трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] (Invitrogen, США, генотип F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET151FliC, созданной in vitro и содержащей ген рекомбинантного флагеллина fliC, вектор pET151FliC, кодирующий биологически активный флагеллин Salmonella typhymurium Т10 по Seq ID No 3.

Полученный штамм E.coli BL21[DE3]pET151FliC депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369 от 30.10.2012.

Штамм E. coli ВКПМ № В-11369 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами:

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин, например, на среде LB. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования - 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, гидролизуют мочевину.

Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: Рекомбинантный белок - флагеллин, длиной 528 аминокислотных остатков, состоящий из флагеллина FliC Salmonella typhimurium T10 (495 амк) и служебной последовательности длиной 33 аминокислоты

Активность штамма

Продуктивность штамма - рекомбинантный флагеллин составляет не менее 37% белка клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.

Криоконсервация. В запаянных ампулах, штамм, лиофильно-высушенный в среде, содержащей на 30 мл воды - 5 г сахарозы, 1,5 г желатина, хранится при комнатной температуре в течении 20 лет.

Культивирование штамма: культивирование при температуре 28-38°С в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) или жидкой LB-среде соответственно. Селективные условия - добавление 100 мкг/мл ампициллина.

Ферментация: ферментацию ведут в жидкой среде PYP-5052, содержащей 0,2% лактозы, с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, при перемешивании и аэрировании, при температуре 28-38°С в течение 18 часов.

На фиг.1 приведены электрофореграммы лизатов клеток Escherichia coli ВКПМ № В-11369 при культивировании в условиях индукции синтеза белка лактозой и без индукции, где 1-белковый маркер молекулярного веса, кДа; 2-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 индукции экспрессии 0,2% лактозой; 3-лизат клеток штамма Е.coli ВКПМ № В-11369 без индукции экспрессии 0,2% лактозой.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Е.coli ВКПМ № В-11369.

Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантного флагеллина в клетках Е.coli.

Методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров FliC-For (SEQ ID NO 1) и FliC-Rev (SEQ ID NO 2) на матрице геномной ДНК вакцинного штамма Salmonella typhimurium T10 (RU2192886) был амплифицирован ген fliC, кодирующий флагеллин, который далее был сшит с вектором рЕТ151. Последовательность нуклеотидов полученного гена совпадает с последовательностью флагеллина FliC (флагеллина фазы 1) Salmonella enterica serovar Typhimurium, имеющейся в GeneBank (BAA02846.1) Полученный ген был вставлен в экспрессионный вектор рЕТ151 с получением экспрессионной плазмиды pET151FliC.

Плазмида рЕТ151 FliC обеспечивает синтез в клетках Escherichia coli полноразмерного бактериального флагеллина, дополнительно содержащего с N-конца служебную последовательность длиной 33 аминокислоты, которая обеспечивает высокоэффективную инициацию синтеза белка рибосомами Е.coli, содержит участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина (гистидиновый таг), предназначенную для последующей очистки рекомбинантного флагеллина с помощью металлохелатной хроматографии, сайт узнавания антителом V5, а также сайт гидролиза протеиназой TEV, позволяющий при необходимости удалить большую часть служебной последовательности обработкой очищенного рекомбинантного флагеллина вышеназванной протеиназой с последующим повторным циклом металлохелатной хроматографии. Последовательность нуклеотидов искусственного гена, кодирующего рекомбинантный флагеллин, представлена в SEQ ID No 3.

Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантного флагеллина и исследование его продуктивности.

Полученной плазмидой pET151FliC были трансформированы клетки Escherichia coli штамма BL21[DE3]Star, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой. Кроме того, они не содержат протеазу Ion и несут мутацию в гене, кодирующем протеазу OmpT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков. Данный штамм содержит также мутацию в гене rne, кодирующий рибонуклеазу Е, что приводит к увеличению стабильности мРНК в клетке и, как следствие, к повышению продукции клетками данного штамма рекомбинантного белка.

В результате был получен штамм E.coli ВКПМ № В-11369 - продуцент бактериального белка FliC.

Для поддержания полученного штамма-продуцента белка FliC использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы.

Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде PYP-5052 с 0,2% лактозой, в термостатированной качалке роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 250 об/мин в течение 18 часов. Оптическая плотность (ОП600) культуры после окончания культивирования составила 7 О.Е. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления лактозы). Образцы биомассы клеток лизировали и анализировали методом диск-электрофореза в ПААГе в денатурирующих условиях с последующей денситометрией.

Результат представлен на фиг.1.

Как видно из фиг.1, индукция лактозой культуры клеток E.coli ВКПМ № В-11369 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 57 килодальтон, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного флагеллина. Анализ денситограммы полиакриламидного геля, представленного на фиг.1, выполненный с помощью программы TotalLab, показал, что рекомбинантный флагеллин составляет 37% общего белка клеточного лизата.

Пример 3. Очистка рекомбинантного флагеллина и изучение его биологической активности.

Рекомбинантный флагеллин очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим диализом. Чистота выделенного флагеллина составила не менее 97% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией.

Биологическая активность рекомбинантного флагеллина оценивалась в тесте, основанном на способности клеток линии А-549 секретировать интерлейкин-8 при добавлении в культуральную среду флагеллина. Для постановки теста клетки линии А-549 вносили в количестве 5×104 на лунку в 96-луночную плоскодонную культуральную плату («Costar») в 100 мкл среды DMEM/F12 с 10% фетальной сыворотки. Плату инкубировали 24 часа в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO2 в условиях абсолютной влажности. За время инкубации клетки в плате образовывали плотный монослой. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты флагеллина в различных концентрациях в объеме 100 мкл в культуральной среде (не менее 3 параллельных лунок для каждой концентрации). Затем плату инкубировали еще 24 часа в СО2-инкубаторе и собирали супернатанты, в которых определяли концентрацию ИЛ-8 с помощью коммерческого набора на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин»).

Результаты двух экспериментов по определению биологической активности рекомбинантного флагеллина представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 1
Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/млКонцентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение)
1003799±590
205368±715
45119±370
0,81567±266
0,16442±115
0,032161±69
0,006477±2
Контроль98±31

Таблица 2
Определение активности рекомбинантного флагеллина в эксперименте 2
Концентрация рекомбинантного флагеллина, нг/млКонцентрация ИЛ-8 в супернатантах, пг/мл (среднее ± станд. отклонение)
105658±957
24470±950
0,4795±34
0,08202±30
0,016114±19
0,003274±38
0,0006494±7
Контроль104±13

Из таблиц 1 и 2 следует, что рекомбинантный флагеллин, продуцируемый клетками штамма E.coli ВКПМ № В-11369, обладает биологической активностью и дозозависимо усиливает продукцию ИЛ-8 клетками А549, 50% эффективная доза для рекомбинантного флагеллина составляет примерно 10 нг/мл.

Преимуществом штамма E.coli ВКПМ № В-11369 является высокая биологическая активность в качестве адъюванта.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Escherichia coli BL21[DE3]pET151FliC - продуцент биологически активного рекомбинантного флагеллина, полученный трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ151FliC, полученной на основе вектора рЕТ151FliC, в который был встроен ген fliC, кодирующий биологически активный флагеллин, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в Seq ID No 3, депонированный во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2524133

patent-2524133.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала

Патенты РФ в классе C12N1/21:
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3 ; человека -  патент 2528059 (10.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
плазмида 40nagal, определяющая синтез -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения -  патент 2525682 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
рекомбинантная плазмидная днк pqe30/derf2l, кодирующая белок der f 2l клеща dermatophagoides farinae и штамм бактерий escherechia coli m15/ pqe30/derf2l - продуцент такого белка. -  патент 2522817 (20.07.2014)

Класс C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины

Патенты РФ в классе C12N15/31:
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью -  патент 2524429 (27.07.2014)
способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени -  патент 2518302 (10.06.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
рекомбинантный полипептид а2, селективно связывающий hsa, рекомбинантная днк pa2, кодирующая hsa-связывающую часть полипептида a2, его продуцент - рекомбинантный штамм escherichia coli m15-a2, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pqe 32-pa2, обеспечивающую получение полипептида a2 и применение полипептида а2 для диагностики микроальбуминурии и выделения hsa из сыворотки крови -  патент 2506271 (10.02.2014)
полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок пертактин, вектор, включающий такую последовательность, и вакцинные композиции, содержащие белок пертактина или вектор -  патент 2499046 (20.11.2013)
гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение -  патент 2497830 (10.11.2013)
нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов -  патент 2494758 (10.10.2013)
конструкции, содержащие составные экспрессионные кассеты, для терапии рака -  патент 2487165 (10.07.2013)
способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба -  патент 2478717 (10.04.2013)

Класс C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

Патенты РФ в классе C12N15/63:
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
способ получения наноматериала на основе рекомбинантных жгутиков археи halobacterium salinarum -  патент 2526514 (20.08.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новая мутация, вовлеченная в повышенную толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам -  патент 2525933 (20.08.2014)
способ создания трансгенных животных со стабильным и высоким уровнем экспрессии целевого белка в молоке -  патент 2525712 (20.08.2014)
синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии -  патент 2524431 (27.07.2014)

Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов

Патенты РФ в классе C12P21/00:
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
способ получения пептидов, специфично распознающих определенные типы клеток и предназначенных для терапевтических целей -  патент 2528739 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
способ получения цитохрома с -  патент 2528061 (10.09.2014)
рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения -  патент 2527067 (27.08.2014)
способы, относящиеся к модифицированным гликанам -  патент 2526250 (20.08.2014)
l-фукоза 1 6 специфичный лектин -  патент 2524425 (27.07.2014)

Класс C12R1/19 Escherichia coli

Патенты РФ в классе C12R1/19:
способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам -  патент 2529367 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
микробиологический способ получения 1,2-пропандиола -  патент 2521502 (27.06.2014)
рекомбинантный штамм escherichia coli tg1(prvmoscow3253g-l) для получения набора пцр-стандартов и набор пцр-стандартов для определения концентрации штамма вируса бешенства "москва 3253" в рабическом антигене -  патент 2511029 (10.04.2014)
способ определения гексоз в супрамолекулярных структурах клеток escherichia coli -  патент 2510846 (10.04.2014)
сухая хромогенная питательная среда для обнаружения колиформных бактерий и e.coli (варианты) -  патент 2508400 (27.02.2014)
сухая дифференциально-диагностическая питательная среда для обнаружения и учета e.coli и колиформных бактерий -  патент 2508399 (27.02.2014)
способ применения симбиотического препарата пролизэр на основе штамма escherichia coli vl-613 для бройлеров высокопродуктивных кроссов -  патент 2495587 (20.10.2013)


Наверх