способ прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом с с генотипом 1b

Формула изобретения

Способ прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом вируса 1b, включающий определение иммунологических показателей крови до начала противовирусной терапии для расчета прогностического показателя, отличающийся тем, что в качестве иммунологических показателей крови используют относительные количества содержания субпопуляций лимфоцитов крови, а прогностический показатель (ПП) рассчитывают по формуле:

ПП=21,08+0,057*X1+0,113*X2-0,203*X3+0,730*X4+0,749*X5, где

21,08 - константа (B);

X1 - процент CD45+/CD3+/CD4+ клеток от числа CD45+ лимфоцитов;

X2 - процент CD56+/CD107a + клеток от числа CD56+ лимфоцитов;





,

при этом подсчет процента субпопуляций лимфоцитов осуществляют методом проточной цитофлуориметрии, и при значении показателя ПП<350 прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию ХГС, при значении показателя ПП>350 прогнозируют отсутствие быстрого вирусологического ответа на противовирусную иммунотерапию хронического гепатита C с генотипом вируса 1b,

95%-ные доверительные интервалы ПП у больных ХГС, достигающих и не достигающих быстрого вирусологического ответа (БВО+ и БВО-, соответственно) на стандартную противовирусную терапию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии и инфекционным болезням, и может использоваться для прогноза быстрого вирусологического ответа у больных хроническим гепатитом C с генотипом вируса 1b на противовирусную терапию.

Вирус гепатита C (ВГС) является причиной развития хронического поражения печени у подавляющего большинства инфицированных индивидуумов, которое приводит к развитию цирроза, рака печени и в конечном итоге к печеночной недостаточности [1]. Около 3% населения планеты инфицировано ВГС (примерно 200 миллионов человек) [2], при этом эффективность стандартной комбинированной терапии пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином хронического гепатита C (ХГС) составляет всего 50% при генотипах ВГС 1 и 4 и около 80% при генотипах 2 и 3 [3]. Необходимо заметить, что наиболее распространенным в России является генотип 1b [4].

Проблема терапии ХГС, особенно при 1b генотипе вируса гепатита C, обусловлена не только ее относительно малой эффективностью, но также высокой стоимостью препаратов и необходимостью их длительного применения. Кроме того, противовирусная терапия может вызвать серьезные побочные эффекты [5].

Таким образом, необходим индивидуальный подход к назначению противовирусного лечения хронического гепатита C, где чрезвычайно важным моментом является прогнозирование эффективности терапии у того или иного пациента.

Известны способы прогнозирования вирусологического ответа на противовирусную терапию с применением интерферона-альфа, основанные на определении одиночных нуклеотидных полиморфизмов, или SNPs: патент US 7,108,978 B2 [6], патент WO 2011/128280 A1 [7]. Однако данные способы могут говорить лишь о предрасположенности индивидуума к тому или иному ответу на терапию, так как анализ основан только на генетическом материале с определением генотипического признака, что, как известно, не гарантирует его наличия как фенотипического признака в данный период жизни человека.

Существует способ прогноза вирусологического ответа, основанный на определении уровня вирусной нагрузки после второй недели лечения (патент WO2010/069809 A1 [8]). Существенным недостатком данного способа является то, что прогноз осуществляется уже на фоне приема противовирусной терапии.

Известен способ выбора тактики лечения больных хроническим вирусным гепатитом B и C на основе прогнозирования эффективности противовирусного лечения путем определения анатомических, анамнестических, иммунологических, биохимических данных [9, 10]. Данный подход к прогнозированию эффективности противовирусного лечения основан на интегральной оценке различных показателей здоровья пациента, что всегда представляет собой сложную задачу и не исключает субъективизма при конечном заключении.

Следует отметить, что в большой степени патогенез хронического вирусного гепатита определяется состоянием иммунной системы пациента [11], таким образом, характер ответа на лечение, также возможно прогнозировать исходя из особенностей иммунологического статуса человека. Например, существует способ прогноза эффективности лечения хронического гепатита, основанный на определении уровня ФНО (фактор некроза опухоли) в сыворотке крови (патент RU 2454666 C1) [12]. Однако данный способ описан только для пациентов с хроническим гепатитом B, кроме того, прогноз может быть осуществим при анализе сыворотки крови на 4-5 и 7-8 неделях приема противовирусной терапии.

Известен способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии при хроническом гепатите B, включающий применение препарата интерферона- (ИНФ- ), при котором определяют количество ФНО- в сыворотке крови и синтез in vitro интерферона- (ИФН- ) мононуклеарами (МНК) периферической крови до и через 4,5 часа после введения первой дозы препарата интерферона- , и при выявлении содержания ФНО- в сыворотке крови до введения, не превышающего 59,31 пг/мл, и повышении после введения интерферона- уровней содержания ФНО- более чем на 46,1% и синтеза ИФН- МНК более чем на 70,25% от исходных, прогнозируют вирусологический ответ в ходе 6-месячной интерферонотерапии, а при выявлении содержания ФНО- в сыворотке крови выше 74,51 пг/мл, и повышении после первой инъекции интерферона- уровней содержания ФНО- не более чем на 24,9%, синтеза ИФН- МНК не более чем на 70% или снижении обоих цитокинов относительно исходных показателей, прогнозируют отсутствие вирусологического ответа (патент RU 2287826 C1) [13]. Однако данный способ также используется только при гепатите B и после начала интерферонотерапии.

Наиболее близкий аналог (прототип) заявляемого изобретения - способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии вирусных гепатитов у детей (патент RU 2379689 C1) [14], позволяющий повысить точность прогноза эффективности лечения до начала интерферонотерапии. Способ основан на определении показателя лейкоцитмодулирующей активности сыворотки крови до начала интерферонотерапии: при значении показателя ниже 0,31 у.е. прогнозируют эффективность терапии, а при значении 0,31 у.е. и выше - ее неэффективность. Основным недостатком данного способа следует считать неточность и субъективность получаемого результата в силу неспецифичности самого феномена, лежащего в его основе (т.е. оценке общей флогогенности сыворотки больных при добавлении последней к лейковзвеси здоровых доноров, что не может адекватно отражать состояние противовирусного иммунного ответа), трудность воспроизведения в силу низкой оснащенности современных иммунологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хемилюминометрами, и, главное - возможность применения данного способа только в педиатрической практике из-за наличия качественных и количественных отличий по показателям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа взрослого и детского организмов.

Задачей изобретения является прогнозирование эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом вируса 1b.

Технический результат изобретения - получение точного прогноза быстрого вирусологического ответа у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом вируса 1b на противовирусную терапию на основе оценки клеточного звена иммунитета.

Это достигается за счет того, что в качестве иммунологических показателей крови используют относительные количества содержания субпопуляций лимфоцитов крови, а прогностический показатель (ПП) рассчитывают по формуле:

ПП=21,08+0,057*X1+0,113*X2-0,203*X3+0,730*X4+0,749*X5, где

21,08 - константа (B);

X1 - процент CD45+/CD3+/CD4+ клеток от числа CD45+ лимфоцитов;

X2 - процент CD56+/CD107a+ клеток от числа CD56+ лимфоцитов;

,

при этом подсчет процента субпопуляций лимфоцитов осуществляют методом проточной цитофлуориметрии, и при значении показателя ПП<350 прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию ХГС, при значении показателя ПП>350 прогнозируют отсутствие быстрого вирусологического ответа на противовирусную иммунотерапию хронического гепатита C с генотипом вируса 1b.

Процесс мечения лимфоцитов осуществляется моноклональными антителами (МКАТ) производства BD Biosciences (США) в соответствии с инструкцией по их применению и использованием как поверхностных (CD45, CD3, CD4, CD8, CD56, CD25), так и внутриклеточных (CD107a - маркер цитолитических гранул [15]; FoxP3 - маркер T-регуляторных клеток с супрессорной активностью [16]) эпитопов лимфоцитов. Подсчет процента лимфоцитов с различными фенотипическими характеристиками - CD45+/CD3+/CD4+, CD45+/CD3+/CD8+, CD45+/CD3-/CD56+, CD56+/CD107a+, CD45+/CD3+/CD25+, CD45+/CD3+/FoxP3+, CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+ проводится на основе программного обеспечения FACS Diva (Becton Dickinson, США) проточного цитофлуориметра.

В ходе научно-исследовательской работы, проводимой в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ имени А.И. Евдокимова (Научно-исследовательский медико-стоматологический университет Московского государственного медико-стоматологического университета имени А.И. Евдокимова) по теме: «Выявление новых клеточных мишеней терапевтического воздействия в иммунной системе больных хроническим гепатитом C» проводилось наблюдение за 28 больными (взрослые) хроническим гепатитом C (ХГС) с генотипом 1b. После всестороннего обследования, включающего определение параметров клеточного звена иммунитета (CD45+/CD3+; CD45+/CD3+/CD4+; CD45+/CD3+/CD8+; CD45+/CD3-/CD56+; CD45+/CD3+/ki67+; CD45+/CD3+/CD4+/ki67+; CD45+/CD3+/CD8+/ki67+; CD45+/CD3-/CD56+/ki67+; CD45+/CD3+/CD25+; CD45+/CD3+/FoxP3+; CD45+/CD3+/CD25high; CD45+/CD3+/CD25high/FoxP3+; CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+; CD56+/CD107a+), а также уровня вирусной нагрузки методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) пациенты с верифицированным диагнозом хронического гепатита C, получали курс противовирусной терапии пегилированным интефероном и рибавирином. После четырех недель приема терапии повторно проводилось количественное определение рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса гепатита C (ВГС) 1b генотипа с целью установления отсутствия или достижения быстрого вирусологического ответа. При этом положительным ответом (БВО+) считается отсутствие РНК ВГС в сыворотке крови при количественном исследовании чувствительной тест-системой ПЦР на 4 неделе противовирусной терапии [17]. В нашей работе достижение быстрого вирусологического ответа было зарегистрировано у 50% пациентов (14 человек) с ХГС, генотип 1b.

Для выявления иммунологических параметров, с наибольшей информативностью отражающих наличие или отсутствие быстрого вирусологического ответа у больных ХГС, проводилась статистическая обработка полученных до лечения данных методом построения ROC-кривых (ROC - receiver operating characteristic, операционная характеристика приемника) с последующим определением AUROC (area under ROC cure, площадь под ROC-кривой). При значениях AUROC выше 70% показатель условно считался информативным. Выявленные таким образом информативные показатели (относительное содержание CD45+/CD3+/CD4+, CD45+/CD3+/CD8+, CD45+/CD3-/CD56+, CD56+/CD107a+, CD45+/CD3+/CD25+, CD45+/CD3+/FoxP3+, CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+ клеток) использовались для выведения формулы «прогностического показателя» (ПП) методом регрессионного анализа. Полученное уравнение линейной регресии включало константу (B), равную 21,08, а значениям каждого информативного параметра соответствовал свой стандартизированный коэффициент Бета.

Подсчет процента субпопуляций лимфоцитов крови осуществляют методом проточной цитофлуориметрии. Данный метод является наиболее точным из существующих и позволяет оценить количественное содержание клеток с различным фенотипом с высокой доверительной вероятностью.

На основании определения 95%-ных доверительных интервалов ПП, было зарегистрировано, что у пациентов ХГС с БВО+ (достижение быстрого вирусологического ответа) 95%-ный доверительный интервал ПП находился в границах между 36 и 278, а у больных ХГС с БВО- (отсутствие быстрого вирусологического ответа) 95%-ный доверительный интервал ПП - от 422 до 1474. За границу раздела между группами пациентов ХГС с БВО+ и БВО- нами было условно выбрано значение 350.

Таким образом, при значении ПП<350 прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию ХГС, при значении ПП>350 прогнозируют отсутствие быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию хронического гепатита C (фиг.1).

Способ иллюстрируется фиг.1, на которой представлены 95%-ные доверительные интервалы ПП у больных ХГС, достигающих и не достигающих быстрого вирусологического ответа на стандартную противовирусную терапию.

Способ осуществляется следующим образом:

до начала противовирусной терапии у пациента производят забор цельной венозной крови, с последующим выделением мононуклеарных клеток с помощью фиколла и определением иммунологических показателей (относительное содержание CD45+/CD3+/CD4+, CD45+/CD3+/CD8+, CD45+/CD3-/CD56+, CD56+/CD107a+, CD45+/CD3+/CD25+, CD45+/CD3+/FoxP3+, CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+ клеток) методом проточной цитофлуориметрии, после чего рассчитывают ПП по предложенной формуле:

ПП=21,08+0,057*X1+0,113*X2-0,203*X3+0,730*X4+0,749*X5, где

21,08 - константа (B);

X1 - процент CD45+/CD3+/CD4+ клеток от числа CD45+ лимфоцитов;

X2 - процент CD56+/CD107a+ клеток от числа CD56+ лимфоцитов;

,

и при значении показателя ПП<350 прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа на противовирусную иммунотерапию хронического гепатита C с генотипом вируса 1b у данного больного, а при значении показателя ПП>350 прогнозируют отсутствие быстрого вирусологического ответа.

Клинический пример № 1.

Пациент Т., 37 лет, наблюдается амбулаторно в гепатологическом центре на базе Инфекционной клинической больницы № 1 с диагнозом «Хронический гепатит C умеренной активности, минимальный фиброз (стадия 1 по шкале METAVIR). Индекс по Knodell 4-1-4-1)».

По данным анамнеза впервые антитела к ВГС выявлены в сентябре 2010 г. при обследовании по контакту с женой, у которой перед операцией выявлены антитела к ВГС, но РНК (РНК - рибонуклеиновая кислота) ВГС в крови при дообследовании не выявлена. В Инфекционную клиническую больницу № 1 (ИКБ № 1) обратился в сентябре 2010 г., при биохимическом исследовании крови выявлено повышение активности АлАТ (АлАТ - аланинаминотрансфераза) до 159 мкмоль/л (микромоль/литр), выявлена РНК ВГС, генотип 1b. Проведена биопсия печени, выявлен минимальный фиброз (стадия 1 по шкале METAVIR). Индекс по Knodell 4-1-4-1). Лечения препаратами интерферона, пегилированного интерферона, рибавирина в течение жизни пациент не получал. За последние 6 месяцев отмечается подъем уровня АлАТ: 13.09.2011 г. - 48 ЕД/л. (единиц/литр), 20.02.12 - 86 ЕД/л. Сопутствующих заболеваний нет. Со слов пациента, аллергии на лекарственные препараты нет. Работает менеджером.

Перед началом противовирусной терапии в августе 2011 года пациент проходил всестороннее обследование. При физикальном обследовании - без особенностей. По данным ультразвукового исследования (УЗИ) брюшной полости очаговых изменений не отмечено. Объемных, жидкостных образований, свободной жидкости в брюшной полости не выявлено.

Общий анализ крови: эритроциты - 5,43*10¹² /л, гемоглобин - 162 г/л (грамм/литр), гематокрит - 47,5%, тромбоциты - 186*10⁹/л, лейкоциты - 6,1*10⁹/л, моноциты - 4,3%, гранулоциты - 62,7%, лимфоциты - 33%. Биохимический анализ крови: креатинин - 87 мкмоль/л, МНО - 1,0, АлАТ - 92 Ед/л, АсАТ - 25 Ед/л (АсАТ - аспартатаминотрансфераза), уровень прямого билирубина - 2,8 мкмоль/л (микромоль/литр), щелочной фосфатазы - 98 Ед/л, Г-ГТП - 49 Ед/л (ГГТП - гамма-глутамилтранспептидаза), альбумин - 43,4 г/л.

Относительные иммунологические показатели: CD45+/CD3+/CD4+=13,1% (X1), CD45+/CD3+/CD8+=18,6% (числитель для расчета X3 и X5), CD45+/CD3-/CD56+=27,9% (числитель для расчета X4), CD45+/CD3+/CD25+=4,2% (знаменатель для расчета X5), CD45+/CD3+/FoxP3+=0,1244% (знаменатель для расчета X3), CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+=0,0933% (знаменатель для расчета X4), CD56+/CD107a+=95,9% (X2).

ПП=21,08+0,057*X1+0,113*X2-0,203*X3+0,730*X4+0,749*X5=21,08+0,057*13,1+0,113*95,9-0,203*149,5+0,730*299+0,749*4,4=224,

где

21,08 - константа (B);

X1=13,1;

X2=95,9;

X3=18,6/0,1244=149,5;

X4=27,9/0,0933=299;

X5=18,6/4,2=4,4.

Вывод: ПП у данного больного равен 224, что меньше 350, у пациента прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа (БВО+).

Пациент получал терапию пегилированным ИФН 2b 1 раз в неделю подкожно и рибавирином в дозе, рассчитанной по массе тела. Вирусная нагрузка до лечения составляла 6,75*104 МЕ/мл (Международных Единиц/миллилитр) РНК ВГС, через месяц терапии не определялась, таким образом, был достигнут быстрый вирусологический ответ (БВО).

Таким образом, по значению ПП было спрогнозировано достижение БВО, что соответствует результатам после проведения месяца терапии.

Клинический пример № 2.

Пациентка П. 31 года наблюдается амбулаторно в гепатологическом центре на базе Инфекционной клинической больницы № 1 с диагнозом «Хронический гепатит C умеренной активности». По данным анамнеза и выписки из стационара впервые антитела к вирусу гепатита C выявлены в августе 2010 г., в процессе обследования в гинекологическом отделении городскую клиническую больницу № 70 (ГКБ № 70). По данным амбулаторной карты, в сентябре 2010 г. выявлена РНК ВГС, генотип 1b. При углубленном обследовании в сентябре 2011 по результатам фиброэластографии печени диагностирована первая стадия фиброза печени (кПА 6,8) Лечения препаратами интерферона, пегилированного интерферона, рибавирина в течение жизни пациентка не получала, не принимает никаких препаратов постоянно. За последние 6 мес. отмечается подъем уровня АлАТ: 16.08.2011 г. - 46 ЕД/л, 05.01.2012 г. - 49 ЕД/л. Сопутствующие, другие хронические заболевания отрицает. Со слов пациентки, аллергии на лекарственные препараты нет. В течение жизни болела ОРВИ и гриппом, стационарное лечение проходила по поводу неполного самопроизвольного выкидыша при беременности малого срока (экстренное выскабливание стенок полости матки). Работает менеджером.

Перед началом противовирусной терапии в августе 2011 года пациентка проходила всестороннее обследование. При физикальном обследовании - без особенностей. По данным УЗИ брюшной полости: эхопризнаки диффузных изменений печени по типу гепатоза-гепатита, дискинезия желчевыводящих путей.

Общий анализ крови: эритороциты - 4,26*10¹² /л, гемоглобин - 129 г/л, гематокрит - 37,3%, тромбоциты - 314*10 ⁹/л, лейкоциты - 4,7*10⁹/л, моноциты - 8,5%, гранулоциты - 59%, лимфоциты - 32,5%. Биохимический анализ крови: креатинин - 79 мкмоль/л, MHO - 0,92, АлАТ - 63 Ед/л, АсАТ - 38 Ед/л, уровень прямого билирубина - 2,2 мкмоль/л, щелочной фосфатазы - 92 Ед/л, Г-ГТП - 24 Ед/л, альбумин - 47,4 г/л.

Иммунологические показатели: CD45+/CD3+/CD4+=10,3% (X1), CD45+/CD3+/CD8+=4,8% (числитель для расчета X3 и X5), CD45+/CD3-/CD56+=38,7% (числитель для расчета X4), CD45+/CD3+/CD25+=0,2145% (знаменатель для расчета X5), CD45+/CD3+/FoxP3+=0,0165% (знаменатель для расчета X3), CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+=0,033% (знаменатель для расчета X4), CD56+/CD107a+=93,7% (X2).

ПП=21,08+0,057*X1+0,113*X2-0,203*X3+0,730*X4+0,749*X5=21,08+0,057*10,3+0,113*93,7-0,203*290,9+0,730*1172,7+0,749*22,4=846, где

21,08 - константа (B);

X1=10,3;

X2=93,7;

X3=4,8/0,0165=290,9;

X4=38,7/0,033=1172,7;

X5=4,8/0,2145=22,4.

Вывод: ПП у данного больного равен 846, что больше 350, у пациента прогнозируется отсутствие быстрого вирусологического ответа (БВО-) на противовирусную терапию.

Пациентка получала терапию пегилированным ИФН 2b (ИФН 2b - интерферон-альфа2b) 1 раз в неделю подкожно и рибавирином в дозе, рассчитанной по массе тела. Вирусная нагрузка до лечения составляла 1,09×10⁶ ME/мл РНК ВГС, через месяц терапии определялась вирусная нагрузка 7,14×10² ME/мл РНК ВГС таким образом не был достигнут быстрый вирусологический ответ.

Таким образом, по значению ПП было спрогнозировано отсутствие БВО, что соответствует результатам после проведения месяца терапии.

Литература

1. Ye, J. Hepatitis C virus: a new class of virus associated with particles derived from very low-density lipoproteins / J. Ye // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2012. - Vol.32. № 5. - P.1099-1103.

2. Lee, L.Y. New therapies for chronic hepatitis C infection: a systematic review of evidence from clinical trials / L.Y. Lee, C.Y. Tong, T. Wong, M. Wilkinson // Int J Clin Pract. - 2012. - Vol.66. № 4. - P.342-355.

3. Esforzado, N. Treatment of hepatitis C in dialysis patients / N. Esforzado, J.M. Campistol // Contrib Nephrol. - 2012. - Vol.176. - P.54-65.

4. Шахгильдян, И.В. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика) / И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. - 383 с.

5. Broecker, F. Short hairpin-looped oligodeoxynucleotides reduce hepatitis C virus replication / F. Broecker, K. Moelling // Virol J. - 2012. - Vol.9. № 1. - P.134.

6. Pat. US 7,108,978 B2. Classification C07H 21/02, C07H 21/04. Method for detecting a propensity of an individual to response effectively to treatment of interferon-alpha and ribavirin combined therapy / Chen J.-L. at al.; applicants and patentee Vita Genomics, Inc. - № 10/618,620; publication date 20.01.2005.

7. Pat. WO 2011/128280 A1. Classification C12Q 1/70. Prediction of Early Virological Response in HCV Treatment / Chu T. at al. - № PCT/EP 2011/055587; publication date 20.10.2011.

8. Pat. WO 2010/069809 A1. Classification C12Q 1/68, C12Q 1/70. Biomarkers for HCV treatment responce / Zhu Y. - № PCT/EP 2009/066567; publication date 24.06.2010.

9. С.Н. Соринсон. Вирусные гепатиты. - СПб.: ТЕЗА. 1998. С.147, 234.

10. В.Т. Ивашкин. Комбинированное лечение хронического гепатита B // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - № 5. - С.57-60.

11. Bode, J.G. Hepatitis C virus (HCV) employs multiple strategies to subvert the host innate antiviral response / J.G. Bode, E.D. Brenndorfer, D. Haussinger // Biol. Chem. - 2008. - Vol.389. № 10. - P.1283-1298.

12. Пат. RU 2454666 C1. МПК G01N 33/49. Способ прогнозирования эффективности противовирусной терапии (ПВТ) хронического гепатита B (ХГВ) / Соболевская О.Л. и др. - № RU 20110103823; опубл. 02.02.2011.

13. Пат. RU № 2287826 C1. МПК G01N 33/68. Способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии при хроническом гепатите B / Ягода A.В. и др. - № 2005123663/15; опубл. 20.11.2006.

14. Пат. RU 2379689 C1. МПК G01N 33/50. Способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии вирусных гепатитов у детей / Жукова Е.А. и др. - № 2008124539/15; опубл. 20.01.2010.

15. Dons koi, B.V. Measurement of NK activity in whole blood by the CD69 up-regulation af-ter co-incubation with K562, comparison with NK cytotoxicity assays and CD107a degranulation as-say / B.V. Dons koi, V.P. Chernyshov, D.V. Osypchuk // J Immunol Methods. - 2011. - Vol.372 № 1-2. - P.187-195.

16. Wu, M.Y. Tumor-infiltrating lymphocytes contain a higher proportion of FOXP3(+) T lymphocytes in cervical cancer / M.Y. Wu, T.Y. Kuo, H.N. Ho // J Formos Med Assoc. - 2011. - Vol.110. № 9. - P.580-586.

17. Ghany, M.G. Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update. AASLD PRACTICE GUIDELINES / M.G. Ghany, D.B. Strader, D.L. Thomas, L.B. Seeff // HEPATOLO-GY. - 2009. - Vol.49. № 4. - P.1335-1374.