способ интраоперационной диагностики рака щитовидной железы

Формула изобретения

1. Способ интраоперационной диагностики рака щитовидной железы, включающий определение химотрипсинподобной активности протеасом в ткани опухоли и в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, заключающийся в том, что из удаленной во время операции пораженной доли щитовидной железы вырезают образец ткани опухоли и образец визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, гомогенизируют образцы тканей в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТР, 10 мМ Na₂S₂O₅ в соотношении веса ткани, мг, к объему буфера, мкл, 1: 6, центрифугируют полученные гомогенаты в течение, по меньшей мере, 5 сек, получают надосадочные жидкости образцов тканей, содержащие протеасомы ткани опухоли или протеасомы визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, затем каждую надосадочную жидкость в количестве 2, 4 и 6 мкл помещают в 100 мкл раствора, содержащего 30 мкМ флуорогенного субстрата Suc-LLVY-AMC химотрипсинпобных центров протеасом и 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl₂ , 1 мМ АТР, проводят реакцию гидролиза Suc-LLVY-AMC протеасомами при 37°С в течение, по меньшей мере, 5 мин, затем добавляют по 250 мкл 1,4% раствора SDS для прекращения реакции гидролиза, оценивают химотрипсинподобную активность протеасом по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра, при превышении величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце ткани опухоли, по меньшей мере, в 3 раза величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани диагностируют рак щитовидной железы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно перед операцией готовят буфер и раствор, содержащий флуорогенный субстрат в пластиковых пробирках 1,5 мл с помощью автоматических пипеток на 2-10 мкл и 20-100 мкл с пластиковьми наконечниками.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенизируют образцы ткани десятью движениями пестика вверх-вниз и затем в течение, по меньшей мере, 5 сек электрогомогенизатором IKA I10 basic Homogenizer work center.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенаты центрифугируют на центрифуге-встряхивателе Fuge/Vortex в течение, по меньшей мере, 5 сек.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что интенсивность флуоресценции измеряют на флуориметре с фильтрами, позволяющими создать длину волны возбуждения 380 нм и измерить флуоресценцию образцов ткани при длине волны испускания 440 нм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что до и после проведения реакции гидролиза капли раствора встряхивают и сбрасывают со стенок пробирок центрифугированием в течение, по меньшей мере, 1-2 сек.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики злокачественных опухолей в условиях больницы на интраоперационном этапе.

Рак щитовидной железы относится к тем онкологических заболеваниям, число которых растет во всем мире. Тиреоидная патология у жителей Российской Федерации стала встречаться чаще, а за последние 10 лет возросла вдвое. В специализированных онкологических учреждениях стала возрастать группа больных раком щитовидной железы после нерадикальных первичных операций, проведенных в хирургических стационарах общего профиля.

Особенностями течения рака щитовидной железы является стертость клинической картины, безболезненность пальпируемых узлов, раннее метастазирование в лимфоузлы и другие органы. Доброкачественные узловые образования щитовидной железы встречаются значительно чаще злокачественных образований (90%-95% и 5%-10% соответственно).

В настоящее время основным методом дооперационной диагностики, обязательным при подозрении на опухолевое поражение щитовидной железы, является ультразвуковое исследование. Использование современных ультразвуковых аппаратов со специальными датчиками 7,5 и 5 МГц позволяет выявлять очаги опухолевого роста до 0,2-0,5 см в наибольшем измерении. Это обеспечивает возможность обнаружения дополнительных, не определяемых с помощью других методов дооперационного обследования узловых образований у каждого второго больного, поступившего на оперативное лечение. Чувствительность этого метода в выявлении непальпируемых очагов опухолевого роста достигает 91%.

Учитывая низкую информативность как отдельных методов диагностики щитовидной железы, так и их совокупности, к любому узловому образованию щитовидной железы необходимо относиться как к потенциальному раку.

В последние годы у пациентов удаляют одновременно как пораженную опухолью долю щитовидной железы, так и долю, визуально не затронутую опухолью, в целях предотвращения развития в ней рака. Кроме того, у пациентов удаляют часть лимфатических узлов для выявления процесса метастазирования.

Возможный диагноз рака ставится по результатам дооперационной пункционной биопсии - гистологического исследования ткани железы после ее аспирации тонкой иглой. В редких случаях биопсия позволяет определить форму течения рака, и соответственно прогнозировать исход и наиболее эффективный курс лечения. Интраоперационная диагностика включает прицельную аспирационную биопсию со срочным цитологическим исследованием, цитологическое исследование отпечатков с опухоли, срочное гистологическое исследование удаленной ткани.

Цитологическое исследование пунктатов из очагов опухолевого роста лишь в 60% случаев позволяет правильно диагностировать рак щитовидной железы.

При отсутствии морфологической верификации диагноза до операции высокой эффективностью обладает метод срочного цитологического исследования соскобов или отпечатков с удаленного опухолевого узла. Он обязательно должен быть применен при сохранении части пораженной доли органа или выявлении лимфатических узлов, подозрительных по метастазированию. С аналогичной целью возможно использование срочного гистологического исследования замороженных срезов опухоли. Однако трудность интерпретации морфологических изменений при высокодифференцированных опухолях и высокая частота гипер- и гиподиагностических ошибок требуют участия опытного морфолога.

Плановое гистологическое исследование всех удаленных узловых образований шитовидной железы является обязательным условием для выявления рака этого органа. Учитывая частоту т.н. "скрытого рака щитовидной железы", все удаленные образования на шее также должны быть морфологически верифицированы.

Известен способ интраоперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы [RU 2299687, МПК А61В 8/06], заключающийся в измерении микроциркуляции в течении 2 мин с поверхности щитовидной железы над образованием и определении среднеарифметического значения показателя микроциркуляции М, при его значении 16,83±2,1 пф.ед. определяют норму, при его значении 12,49±2,2 пф.ед. диагностируют узловой коллоидный зоб, при значении 20,26±1,17 пф.ед. - рак щитовидной железы и при значении 28,37±5,4 пф.ед. - токсическую аденому.

Известен способ интраоперационной диагностики рака щитовидной железы [SU 1392651, МПК А61В 5/05], заключающийся в измерении электрического сопротивления ткани щитовидной железы при низкой и высокой частотах тока, определении их соотношения и при значении этого соотношения 1,7±0,03 диагностирование рака щитовидной железы.

Известен также способ интраоперационной диагностики тиреоидной патологии [RU2003119588, МПК А61 В1/04], включающий оптическую оценку ткани щитовидной железы при различных ее заболеваниях. Во время операции проводят фотозондирование щитовидной железы с помощью двух зондов фотодатчиков, и при цифровых данных прибора от 0,5б±0,03 до 1,0±0,02 диагностируют неопухолевые заболевания щитовидной железы, а свыше 1,2±0,05 - опухолевые, без разделения их на доброкачественные и злокачественные.

Известна заявка [US2011/0053199A1, МПК C12Q1/37] «Описание убиквинтин-протеасомной системы и ее применение в клинических приложениях для диагностики рака», где описан метод диагностики хронической лимфоцитарной лейкемии, острой миелоидной лейкемии и острой лимфобластомной лейкемии, также предполагается использование оценки активностей протеасом, в том числе химотрипсинподобной активности для диагностики гепатоклеточной карциномы.

Однако известные способы не позволяют быстро и безошибочно диагностировать рак щитовидной железы ни до операции, ни в процессе операции.

Известен опыт хирургического лечения узловых образований щитовидной железы с применением интраоперационной патогистологической диагностики. До операции всем больным проводились УЗИ и тонкоигольная аспирационная биопсия с цитологическим исследованием полученного материала. Всего рак щитовидной железы по данным гистологического исследования удаленных препаратов констатирован в 92 (100%) случаях. Из них у 18 (19,6%) больных до операции был диагностирован доброкачественный процесс, и планировалось выполнение органосохраняющей операции. После проведения интраоперационного патогистологического исследования у этих пациентов выявлен рак щитовидной железы, что позволило принять решение о выполнении большей по объему радикальной операции [Яковец Ю.И., Чистяков А.А., Гончар А.Г., Остапенко Ю.В., Темниченко Д.П., Дьячков О.Н. Донецкий областной противоопухолевый центр, Донецк, Украина].

Однако интраоперационное гистологическое исследование щитовидной железы, применяемое для определения характера опухолевого процесса, в настоящее время подвергается критике как не удовлетворяющее потребностям клиники. Даже после рутинной обработки материала патологоанатом не всегда в состоянии ответить на вопрос о злокачественности процесса.

Известен опыт аутофлуоресцентного исследования злокачественных опухолей щитовидной железы. Суть аутофлуоресцентного исследования: при облучении исследуемого участка ткани лазерным излучением красного цвета (длина волны 635 нм) происходит фотохимическая реакция в молекулах порфиринов, входящих в структуру клеток и тканей (нуклеотиды, гемоглобин, миоглобин, цитохромы и др). Возбужденные молекулы при возвращении к своему обычному состоянию выделяют квант света. В результате формируется собственное, эндогенное, аутофлуоресцентное излучение, по физическим параметрам отличное от исходного, возбуждающего. Чем более интенсивно делятся клетки, тем ярче исходящее от них аутофлуоресцентное излучение. При этом интенсивность аутофлуоресценции позволяет достоверно судить о характере пролиферативных процессов в исследуемом участке тканей: физиологическая пролиферация; заживление раневого дефекта, доброкачественная или злокачественная опухоль. Исследование выполняли непосредственно после удаления органа в процессе операции (в течение 30 минут). В качестве диагностического критерия оценивали соотношение аутофлуоресценции опухоли и окружающей неизмененной ткани. Во всех наблюдениях (100%) таковое соотношение превышало 30% (эмпирически установленный пороговый уровень аутофлуоресценции, свидетельствующий о высокой пролиферативной активности в образовании) [Вельшер Л.З., Решетов Д.Н., Стаханов М.Л., Цалко С.Э., Мазурова М.П. Московский государственный медико-стоматологический университет, кафедра онкологии и лучевой терапии].

В работе [В.В. ГРЕКОВ. Особенности морфологической диагностики рака у больных с узловыми образованиями щитовидной железы. - ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. Научно-практическое издание. Приложение 1. 2012. МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ, стр.51] были проанализированы диагностические ошибки при выявлении рака щитовидной железы, повлекшие за собой неадекватный объем оперативного вмешательства. При сравнительном анализе результатов дооперационного цитологического и послеоперационного планового гистологического исследований узловых заболеваний щитовидной железы установлено, что до настоящего времени существуют трудности в дооперационной верификации узловых образований щитовидной железы. Специальных методик, позволяющих абсолютно достоверно исключить злокачественный рост в узле щитовидной железы до операции, не существует. Ложноположительные результаты цитологических заключений по раку щитовидной железы имели место у 36 пациентов, ложноотрицательные результаты - у 39 пациентов, направленных на операцию с ошибочной цитологической верификацией доброкачественных узловых образований щитовидной железы. Особо стоит отметить группу больных, у которых рак щитовидной железы был выявлен только при плановом гистологическом послеоперационном исследовании, так как каждый из этих случаев потребовал пересмотра лечебной тактики.

Таким образом, в настоящее время диагностика рака щитовидной железы проводится после операции путем гистологического анализа удаленных опухолей, что занимает несколько дней.

Интраоперационное исследование опухолевых образований щитовидной железы играет важную роль в подтверждении и уточнении диагноза, определении объема хирургического вмешательства, а также в распознавании различных по форме и этиологии воспалительных, гиперпластических и опухолевых процессов в клинически неясных случаях.

Изучение молекулярных механизмов развития злокачественных опухолей является одной из актуальных проблем биологии и медицины. В этой связи наиболее перспективно исследование мультифункциональных ферментативных систем, к числу которых относятся протеасомы. Протеасомы - это мультисубъединичные протеазы, участвующие в регуляции многочисленных клеточных процессов и играющие важную роль в патогенезе злокачественных опухолей, однако их активность в тканях опухолей человека изучена недостаточно. Изменение их функционирования связано с различными патологическими состояниями, в том числе злокачественным перерождением клеток и ростом опухолей.

В работах [Т.М. Астахова, Е.Е. Шашова, А.С.Плеханова, Ю.В. Люпина, Ю.В. Богомягкова, И.Р. Сумеди, Г.В. Родоман, Н.А. Кузнецов, Е.М. Слонимская, И.В. Кондакова, Н.П. Шарова. Химотрипсинподобная активность протеасом в развитии карцином молочной и щитовидной желез человека. Тезисы докладов 8-й конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012». Санкт-Петербург. 20 апреля 2012 г. С.24-25] и [Ю.В. Богомягкова. Активность протеасом в опухолях щитовидной железы человека: связь с клинико-морфологическими параметрами. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (12-13 декабря 2011 г.). Онтогенез, 2012, том 43, № 4, С.235] описан механизмов развития злокачественных опухолей. В клетках человека протеасомы существуют во множественных формах, различающихся структурой и спецификой гидролиза белков. Множественные формы протеасом регулируют многочисленные клеточные процессы путем устранения белков и/или образования пептидов, в этих процессах участвующих. Злокачественная трансформация клеток сопровождается изменениями экспрессии отдельных форм протеасом, и что эти изменения отражаются на протеолитических активностях общего пула протеасом. Химотрипсинподобную активность протеасом определяли в цитоплазматической фракции клеток по гидролизу коммерческого флуорогенного субстрата N-succinyl-leu-leu-val-tyr-7-amido-4-methyl coumarin и нормализовали на 1 мг белка. Активность примесных протеаз оценивали с помощью ингибитора протеасом, Z-leucyl-leucyl-leucinal (MG132). В работе использовали верифицированный клинический материал и образцы карцином щитовидной железы на стадиях. Контролем служили образцы прилежащих к опухолям тканей. Активность в опухоли выражали в процентах по отношению к активности в прилежащей ткани. Оказалось, что активность в карциноме щитовидной железы превышает активность в прилежащей к опухоли ткани.

В этой работе не исследована активность протеасом в доброкачественных опухолях щитовидной железы.

Определение активности протеасом было описано и в работе [Протеолитическая регуляция экспрессии ростовых факторов и hif-1 при раке эндометрия Л.В. Спирина, Н. В. Юнусова, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, В.Д. Коваль, А.Л. Чернышева, О.В. Шпилева. -Сибирский онкологический журнал. 2012. № 2 (50)]. Химотрипсинподобную активность тотального пула протеасом, 26S и 20S пулов протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей, а также во фракциях протеасом, по гидролизу флуорогенного олигопептида N-SuccinylLeu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом, на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Реакционная смесь для определения активности 20S протеасом содержала 20 мМ трис-HCl (рН=7,5), 1 мМ дитиотреитол, 30 мкМ N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin. Для определения активности 26S протеасом в реакционную смесь дополнительно вводили 5 мМ хлорида магния и 1 мМ АТФ. Реакцию проводили при 37°С в течение 20 мин и останавливали 1% додецил сульфатом натрия. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяли специфический ингибитор протеасом - MG132. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.

В работе [N.P. Sharova, T.M. Astakhova, Ya.D. Karpova, Yu.V. Lyupina, A.I. Alekhin, N.G. Goncharov, I.R. Sumedi, V.A. Chemer, G.V. Rodoman, N.A. Kuznetsov, P.A. Erokhov. Changes in proteasome pool in human papillary thyroid carcinoma development. Cent. Eur. J. Biol. 2011. V.6, No 4, P.486-496] исследовали химотрипсинподобную активность протеасом стандартным способом: во-первых, не в грубом, а в осветленном гомогенате папиллярной карциномы щитовидной железы, во-вторых, с применением ингибитора активности протеасом, в-третьих, с нормализацией на бета-актин, что не позволило выявить значительной разницы между злокачественной опухолью и прилежащей тканью. Кроме того, в этой работе не исследовали Химотрипсинподобную активность протеасом доброкачественныех опухолей щитовидной железы.

В работе [Kimura H.J., Chen C.Y., Tzou S.C., Rocchi R., Landek-Salgano M.A., Suzuki K., et al., Immunoproteasome overexpression underlies the pathogenesis of thyroid oncocytes and primary hypothyroidism: studies in humans and mice, PLoS One, 2009, 11, e7857] исследовали экспрессию иммунных субъединиц протеасом.

В работе [J Nucl Med. 2012 Nov; 53(11):1764-71. doi: 10.2967/jnumed.ll 1.101295. Epub 2012 Oct 10. Antitumor effects of proteasome inhibition in anaplastic thyroid carcinoma. Altmann A, Markert A, Askoxylakis V, Schoning T, Jesenofsky R, Eisenhut M, Haberkom U. Source Department of Nuclear Medicine, University Hospital Heidelberg, Heidelberg, Germany. a.altmann@dkfz.de] исследовали действие бортезомиба, ингибитора активности протеасом, на опухолевые клетки.

В работе [Clin Nucl Med. 2012 Jun; 37(6):539-44. doi: 10.1097/RLU.0b013e31824c5f24. First experience with proteasome inhibitor treatment ofradioiodine nonavid thyroid cancer using bortezomib. Putzer D, Gabriel M, Kroiss A, Madleitner R, Eisterer W, Kendler D, Uprimny C, Bale RJ, Gasti G, Virgolini IJ. Source Department of Nuclear Medicine, Innsbruck Medical University, Austria, daniel.putzer@i-med.ac.at] исследовали действие бортезомиба, ингибитора активности протеасом, на опухолевые клетки.

В работе J Clin Endocrinol Metab. 2012 Jan; 97(1):E115-20. doi: 10.1210/jc.2011-0484. Epub 2011 Nov 9. BAG3 down-modulation reduces anaplastic thyroid tumor growth by enhancing proteasome-mediated degradation of BRAF protein. Chiappetta G, Basile A, Arra C, Califano D, Pasquinelli R, Barbieri A, De Simone V, Rea D, Giudice A, Pezzullo L, De Laurenzi V, Botti G, Losito S, Conforti D, Turco MC. Source Functional Genomic Unit, National Cancer Institute, Fondazione G. Pascale, via M. Semmola, 80131 Naples, Italy. chiappetta.gennaro@gmail.com] исследовали эффект увеличения протеасомо-зависимой деградации белка BRAF на опухолевые клетки.

В работе Surg Oncol. 2012 Mar 15; 105(4):357-64. doi: 10.1002/jso.22113. Epub 2011 Oct 17. Targeting the proteasome as a promising therapeutic strategy in thyroid cancer.

Wunderlich A, Amdt T, Fischer M, Roth S, Ramaswamy A, Greene BH, Brendel C, Hinterseher U, Bartsch DK, Hoffmann S. Source Department of Surgery, University Hospital of Giessen and Marburg, Philipps-University of Marburg, Marburg, Germany] исследовали действие бортезомиба, ингибитора активности протеасом, на опухолевые клетки.

В работе [J Clin Endocrinol Metab. 2011 Мау; 96(5):Е763-71. doi: 10.1210/jc.2010-2642. Epub 2011 Feb 23. Proteasome inhibition induces a p38 МАРК pathway-dependent antiapoptotic program via Nrf2 in thyroid cancer cells. Du ZX, Yan Y, Zhang HY, Liu BQ, Gao YY, Niu XF, Meng X, Wang HQ. Source Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China. dzx_doctor@hotmail.com] исследовали действие бортезомиба, ингибитора активности протеасом, на рад факторов и на опухолевые клетки.

Однако в шести вышеперечисленных работах не исследовали активность протеасом карциномы щитовидной железы.

Стандартный способ определения химотрипсинподобной активности протеасом в ткани включает следующие операции: этап приготовления осветленного гомогената ткани путем центрифугирования гомогената в течение 30-60 минут на центрифуге, позволяющей получить ускорение, по крайней мере, 10000 g; обязательное использование проб с добавлением ингибитора химотрипсинподобной активности протеасом с целью исключения вклада примесных протеолитических активностей при гидролизе субстрата; нормализацию полученных на флуориметре значений активности на содержание общего или какого-либо конститутивного белка в исследуемых образцах. Этот стандартный процесс занимает несколько часов.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является повышение точности и сокращение времени интраоперационной диагностики рака щитовидной железы для выбора адекватного объема оперативного вмешательства.

Для решения поставленной задачи способ интраоперационной диагностики рака щитовидной железы, включающий определение химотрипсинподобной активности протеасом в ткани опухоли и в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, заключаюется в том, что из удаленной во время операции пораженной доли щитовидной железы вырезают образец ткани опухоли и образец визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, гомогенизируют образцы тканей в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТР, 10 мМ Na₂S₂O₅ в соотношении веса ткани, мг, к объему буфера, мкл, 1: 6, центрифугируют полученные гомогената в течение, по меньшей мере, 5 сек, получают надосадочные жидкости образцов тканей, содержащие протеасомы ткани опухоли или протеасомы визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, затем каждую надосадочную жидкость в количестве 2, 4 и 6 мкл помещают в 100 мкл раствора, содержащего 30 мкМ флуорогенного субстрата Suc-LLVY-AMC химотрипсинпобных центров протеасом и 20 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl₂ , 1 мМ АТР, проводят реакцию гидролиза Suc-LLVY-AMC протеасомами при 37°С в течение, по меньшей мере, 5 мин, затем добавляют по 250 мкл 1,4% раствора SDS для прекращения реакции гидролиза, оценивают химотрипсинподобную активность протеасом по интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра, при превышении величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце ткани опухоли, по меньшей мере, в 3 раза величины интенсивности флуоресценции гидролизованного субстрата в образце визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, диагностируют рак щитовидной железы.

В частном варианте предварительно перед операцией готовят буфер и раствор, содержащий флуорогенный субстрат в пластиковых пробирках 1,5 мл с помощью автоматических пипеток на 2-10 мкл и 20-100 мкл с пластиковыми наконечниками.

В другом частном варианте гомогенизируют образцы ткани десятью движениями пестика вверх-вниз и затем в течение, по меньшей мере, 5 сек электрогомогенизатором IKA 110 basic Homogenizer work center.

В другом частном варианте гомогенаты центрифугируют на центрифуге-встряхивателе Fuge/Vortex в течение, по меньшей мере, 5 сек.

В другом частном варианте интенсивность флуоресценции измеряют на флуориметре с фильтрами, позволяющими создать длину волны возбуждения 380 нм и измерить флуоресценцию образцов ткани при длине волны испускания 440 нм.

В другом частном варианте до и после проведения реакции гидролиза капли раствора встряхивают и сбрасывают со стенок пробирок центрифугированием в течение, по меньшей мере, 1-2 сек.

Химотрипсинподобная активность протеасом является уникальной характеристикой, «паспортом» опухолей щитовидной железы пациентов. При раке щитовидной железы (папиллярная карцинома, медуллярная карцинома) Химотрипсинподобная активность протеасом повышена в опухолевой ткани как минимум в 3 раза по сравнению с прилежащей тканью. Отмечались случаи повышения активности в 20-50 раз. В доброкачественных опухолях (фолликулярной аденоме, аденоматозной гиперплазии), напротив, Химотрипсинподобная активность протеасом снижена или не изменена по сравнению с прилежащей тканью.

Предлагаемый способ позволит исключить применение ингибитора, поскольку вклад примесных протеолитических активностей при гидролизе используемого субстрата протеасомами щитовидной железы не превышает 3%. Это значение не отражается на результате. Вместе с тем, исключение ряда проб с ингибитором протеасом позволяет в свою очередь дополнительно сократить время определения активности протеасом.

Предлагается нормализация химотрипсинподобной активности протеасом щитовидной железы на единицу веса сырой ткани, поскольку обнаружено, что именно при таком способе определения активности выявляются наиболее четкие и значительные отличия активности в прилежащей ткани и опухолях щитовидной железы. Данный способ обсчета активности позволил осуществить разработку быстрого метода ее определения и анализа.

В предлагаемом способе активность протеасом определяется не в осветленном, а в грубом гомогенате ткани, который получают путем центрифугирования гомогената в течение 1 минуты на максимальной скорости центрифуги-вортекса при низких значениях g. Это позволяет быстро разогнать и остановить центрифугу и значительно сократить время определения активности.

Предлагаемый способ быстрой диагностики злокачественности опухолей щитовидной железы по определению химотрипсинподобной активности протеасом во время операции при проведении предварительной подготовки занимает 15-20 минут.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Пациент А.

Перед операцией проводили следующую подготовительную работу.

Приготавливали:

- 2 мл гомогенизирующего буфера состава: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ АТР, 10 мМ Na ₂S₂O₅;

- 1 мл раствора, содержащего флуорогенный субстрат химотрипсинпобных центров протеасом: 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl₂ , 1 мМ АТР, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC (коммерческий флуорогенный субстрат химотрипсинпобных центров протеасом, Sigma);

- 3 мл 1,4% раствора SDS.

Далее расставляли в штативе 8 пластиковых 1,5 мл-х пробирок стандартного веса фирмы Eppendorf и раскапывали в них раствор, содержащий флуорогенный субстрат химотрипсинпобных центров протеасом с помощью автоматических пипеток на 2-10 мкл и 2-100 мкл с соответствующими пластиковыми наконечниками фирмы Eppendorf по схеме, приведенной в таблице 1.

Таблица 1
№ пробирки	Количество раствора, содержащего флуорогенный субстрат, мкл	Количество надосадочной жидкости образца щитовидной железы, мкл
1	100	-
2	100	-
3	100	2
4	100	4
5	100	6
6	100	2
7	100	4
8	100	6

Растворы в 1-й и 2-й пробирках использовали как фоновые.

Растворы в 3, 4 и 5 пробирках использовали для исследования визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани.

Растворы в 6, 7 и 8 пробирках использовали для исследования ткани опухоли.

В 3, 4 и 5 пробирках проводили гидролиз Suc-LLVY-AMC протеасомами образцов визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани.

В 6, 7 и 8 пробирках проводили гидролиз Suc-LLVY-AMC протеасомами образцов ткани опухоли.

Затем включали следующие приборы:

- водяной термостат, выставив температуру на 37°С;

- флуориметр (Versa Fluor Fluorometer фирмы BIO-RAD) с фильтрами, позволяющими создать длину волны возбуждения 380 нм и промерить флуоресценцию образцов при длине волны испускания 440 нм;

- центрифугу-встряхиватель (Fuge/Vortex фирмы BioKom);

- весы (Sartorius 1212 МР).

Подготавливали: маленькие ножницы с острыми узкими концами; пластиковых пестика для 1,5 мл-х пробирок фирмы Eppendorf; 8 кювет на 300 мкл для флуориметра; электрогомогенизатор (IKA ПО basic Homogenizer work center); автоматические пипетки и наконечники фирмы Eppendorf на 2-10 мкл и 100-1000 мкл; плотик для инкубации пробирок в водяном термостате.

Во время операции у пациента удаляли пораженную долю щитовидной железы, вырезали из нее образец из центра опухоли и размещали в 3, 4 и 5 пробирках, образец визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани и размещали в 6, 7 и 8 пробирках. Взвешивали пробирки с образцами ткани. Вычитали из общего веса заранее известный стандартный вес пробирок и определяли вес образцов. Вес образца прилежащей ткани составил 55 мг, а вес образца опухолевой ткани - 62 мг. Образцы размельчали ножницами в пробирках и добавляли гомогенизирующий буфер в соотношении 1:6 (вес, мг: объем, мкл). К образцу прилежащей ткани добавляли 330 мкл буфера, к образцу опухоли - 372 мкл.

В каждой пробирке образцы гомогенизировали пластиковым пестиком 10-ю движениями пестика вниз-вверх. Затем гомогенизировали образцы электрогомогенизатором IKA в течение 5 секунд.

Центрифугировали пробирки на максимальной скорости центрифуги-встряхивателя Fuge/Vortex фирмы BioKom в течение 5 секунд, что позволило сбросить на дно частички ткани, т.е. получить осадок и грубый гомогенат в виде надосадочной жидкости.

Полученные надосадочные жидкости добавляли в пробирки по схеме, приведенной в таблице 1. Закрывали крышки пробирок, встряхивали каждую из них на центрифуге-встряхивателе и сбрасывали капли со стенок пробирок центрифугированием на этой же центрифуге в течение 1-2 сек.

Пробирки помещали в водяной термостат в плотике и проводили гидролиз Suc-LLVY-AMC протеасомами образца визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани и образца ткани опухоли при 37°С в течение 5 минут.

Далее реакцию останавливали добавлением в пробирки по 250 мкл 1,4%-ного раствора SDS. Встряхивали пробирки и сбрасывали капли со стенок центрифугированием в течение 1-2 сек.

Раскапывали содержимое пробирок в кюветы (по 250 мкл) и измеряли интенсивность флуоресценции на флуориметре Versa Fluor Fluorometer фирмы BIO-RAD. Флуоресценцию содержимого пробирок 1 и 2, которая в данном примере составляла 2-4 единицы, выставляли на флуориметре как фоновую, по отношению к которой производили измерения в пробирках 3-8. По полученным значениям флуоресценции делали вывод о злокачественном или доброкачественном статусе опухоли.

В таблице 2 приведены показания флуориметра (химотрипсинподобная активность протеасом) в ткани опухоли щитовидной железы и в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани

Таблица 2
Количество надосадочной жидкости образца щитовидной железы, мкл	Химотрипсинподобная активность протеасом (количество гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра)
	в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани	в ткани опухоли
2	102	652
4	164	1004
6	204	1164

Проведены по три измерения активности протеасом для каждого образца с целью исключения случайной ошибки диагностики.

Следует отметить, что выявленную по шкале прибора активность не надо дополнительно пересчитывать, поскольку предложенная процедура определения химотрипсинподобной активности протеасом, включающая фиксированное соотношение веса образца ткани к объему гомогенизирующего буфера (1:6), подразумевает нормализацию активности на единицу веса сырой ткани, что делает быстрой и легкой интерпретацию результатов.

Измерение химотрипсинподобной активности протеасом в приведенном примере показало, что в ткани опухоли активность протеасом увеличена в 5,5-6,5 раз по сравнению с визуально неизмененной прилежащей к опухоли тканью.

Факт увеличения активности в опухоли свидетельствует о ее злокачественном статусе и указывает на необходимость удаления обеих долей щитовидной железы и ряда лимфатических узлов у пациента.

Последующий послеоперационный гистологический анализ опухолевой ткани выявил папиллярный рак (злокачественная опухоль).

Пример 2

Пациент Б.

Перед операцией проводили подготовительную работу, как и в примере 1.

От хирурга было получено 71 мг и 54 мг опухолевой и прилежащей ткани соответственно; после размельчения ножницами опухолевой ткани к образцам добавили 426 мкл и 324 мкл гомогенизирующего буфера. Все последующие этапы проводили, как в примере 1.

В таблице 3 приведены показания флуориметра (химотрипсинподобная активность протеасом) в ткани опухоли щитовидной железы и в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани.

Таблица 3
Количество надосадочной жидкости образца щитовидной железы, мкл	Химотрипсинподобная активность протеасом (количество гидролизованного субстрата в единицах показаний флуориметра)
	в визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани	в ткани опухоли
2	130	116
4	264	264
6	498	462

Измерение химотрипсинподобной активности протеасом в приведенном примере показало, что в ткани опухоли активность протеасом не увеличена по сравнению с визуально неизмененной прилежащей к опухоли ткани, что свидетельствует о доброкачественном статусе опухоли.

Этот результат позволил дать рекомендации хирургу завершать операцию и оставить пациенту вторую долю щитовидной железы.

Последующий послеоперационный гистологический анализ опухолевой ткани выявил фолликулярную аденому (доброкачественная опухоль).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволит быстро и достоверно диагностировать рак щитовидной железы от доброкачественных опухолевых образований, выбрать наиболее эффективный, целесообразный и адекватный метод хирургического лечения, выполнить эндокринологически щадящие, но онкологически радикальные оперативные вмешательства у пациентов со злокачественными опухолями щитовидной железы, а также принять решение о целесообразности выполнения шейных лимфодиссекций. В случае определения доброкачественного статуса опухоли во время операции можно не удалять вторую долю щитовидной железы и прилежащие лимфатические узлы, что значительно улучшит состояние пациента.

Внедрение в клиническую практику предлагаемой интраоперационной диагностики опухолевых образований щитовидной железы вне зависимости от результатов предоперационных обследований позволит снизить частоту диагностических ошибок и выполнить радикальный объем оперативного вмешательства. Предлагаемый способ обеспечит повышение объективности диагностики и устранение ее зависимости от недостаточной квалификации специалиста, что особенно важно в сложных диагностических случаях, т.к. способ сводит к минимуму возможность диагностической ошибки из-за субъективной оценки специалистом того или иного качественного морфологического признака.

Предложенный способ интраоперационной диагностики злокачественности опухолей щитовидной железы может быть широко востребован онкологическими клиниками.