способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных клеток крови пуповины человека

Классы МПК:A61K48/00 Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии
A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах  1/00
Автор(ы):, , , , , , ,
Патентообладатель(и):Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Министерства здравоохранения Российской Федерации) (RU),
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный университет" (ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) Федеральный университет") (RU),
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук" (КИББ КазНЦ РАН) (RU),
Челышев Юрий Александрович (RU),
Шаймарданова Гульнара Фердинантовна (RU),
Мухамедшина Яна Олеговна (RU),
Исламов Рустем Робертович (RU),
Ризванов Альберт Анатольевич (RU),
Федотова Валерия Юрьевна (RU),
Черенкова Екатерина Евгеньевна (RU),
Соловьева Валерия Владимировна (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-01-09
публикация патента:

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, предварительно трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора(gdnf). Использование изобретения позволяет улучшить результаты посттравматической регенерации спинного мозга, сократить сроки пребывания больных с травмой спинного мозга в стационаре и повысить качество жизни таких больных. 1 пр.

Формула изобретения

Способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, предварительно трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к методам лечения травмы спинного мозга при помощи введения в область повреждения генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, и может быть использовано в нейрохирургии и травматологии.

Способы лечения последствий нейротравмы остаются малоэффективными из-за низкого регенераторного потенциала в мозге. Повышение результативности лечения при данной патологии связывают с генно-клеточной терапией. Трансплантация клеток при экспериментальной травме спинного мозга незначительно стимулирует регенерацию и обеспечивает частичное восстановление утраченных функций. Усиление терапевтического эффекта трансплантации клеток достигают путем их генетической модификации с применением невирусных и вирусных векторов. Трансплантация таких клеток обеспечивает длительную гиперэкспрессию ключевых молекул, которые поддерживают выживание и дифференцировку нейральных клеток. При экспериментальной травме спинного мозга показано, что трансплантация генетически модифицированных клеток при помощи вирусных и плазмидных векторов с клонированными генами нейротрофических факторов, противоапоптозных молекул, молекул адгезии и других стимуляторов нейрорегенерации, оказывается более эффективной, чем трансплантация тех же нативных клеток.

Для доставки в область травматического повреждения спинного мозга терапевтических генов применяют дифференцированные, стволовые, индуцированные плюрипотентные стволовые и прогениторные клетки. Достаточно перспективными представляются клетки крови пуповины, что связано с их низкой иммуногенностью, доступностью, простотой и безопасностью получения, способностью выдерживать длительное хранение. Эти клетки интенсивно исследуют для трансплантаций при травмах мозга (Cao, F. J., S. Q. Feng. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 ChinMed J (Engl) 122(2). - 2009. - P.225-231; Schira, J., M. Gasis, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Brain 135(Pt 2). - 2012. - P.431-446). Доставка генов при помощи вирусных векторов на различных экспериментальных моделях нейродегенеративных заболеваний показало улучшение функции, что позволяет рассматривать данный метод как наиболее перспективный для направленной терапии при патологии ЦНС.

Член семейства трансформирующего фактора роста бета (TGFспособ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 ) глиальный нейротрофический фактор (англ. glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) является мощным фактором поддержания жизнеспособности нейронов многих популяций, включая мотонейроны. Именно поэтому с данным нейротрофическим фактором связывают перспективы лечения неврологических расстройств.

При экспериментальной травме спинного мозга введение в область повреждения GDNF оказывает нейропротекторное действие, поддерживает экспрессию белков нейрофиламентов, пептида, связанного с кальцитониновым геном (CGRP) и связанного с ростом аксонов белка 43 (GAP-43) (Cheng, Н., J. P. Wu, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 J Neurosci Res 69(3). - 2002. - P.397-405). В комбинации с трансплантацией шванновских клеток GDNF сдерживает выработку астроцитами молекул-ингибиторов роста аксонов, что приводит к уменьшению тормозящего влияния глиального рубца на регенерацию нервных волокон (Deng, L.-X., J. Нu, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Experimental neurology 229(2). - 2011. - P.238-250). Многие молекулы, вырабатываемые GFAP-иммунопозитивными астроцитами, оказывают нейротрофическое влияние, а сами астроциты формируют потенциальное пространство для роста аксонов. Приведенные результаты легли в основу концепции о поддерживающем рост аксонов фенотипе GFAP-иммунопозитивных астроцитов (growth-supportive phenotype) (White, R. E., M. Rao, et al. (2011). способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Transforming growth factor alpha transforms astrocytes to a growth-supportive phenotype after spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 JNeurosci 31(42): 15173-15187). GDNF оказывает прямое стимулирующее влияние на рост аксонов при травме спинного мозга, стимулирует их миелинизацию, уменьшает апоптоз и дегенерацию ткани (Iannotti, С., Н. Li, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Exp Neurol 183(2). 2003. - P.379-393). При экспериментальной травме спинного мозга не только локальное, но также и системное применение GDNF сдерживает развитие патологических проявлений (Као, С.-Н., S.-H. Chen, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Exogenous administration of glial cell line-derived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Resuscitation 77(3). - 2008. - P.395-400). При этом GDNF способствует увеличению количества и калибра регенерирующих аксонов, а также стимулирует рост аксонов в культуре нейронов спинального ганглия (Zhang, L., Z. Ma, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 GDNF-enhanced axonal regeneration and myelination following spinal cord injury is mediated by primary effects on neurons.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Glia 57(11). - 2009. - P.1178-1191).

Известен способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга путем доставки в область повреждения не самого нейротрофичского фактора, а его гена. В эксперименте с травмой спинного мозга было показано улучшение функциональных и структурных показателей при локальной доставке гена gdnf в составе плазмидного вектора при помощи катионных липосом (Lu, К. W., Z. Y. Chen, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Protective effect of liposome-mediated glial cell line-derived neurotrophic factor gene transfer in vivo on motoneurons following spinal cord injury in rats.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Chin J Traumatol 7(5). - 2004. - P.275-279), наночастиц биорастворимого полимера (Wang, Y.-C., Y.-T. Wu, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Sustained intraspinal delivery of neurotrophic factor encapsulated in biodegradable nanoparticles following contusive spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Biomaterials 29(34). - 2008. - P.4546-4553) или в комплексе с антителами против рецепторов нейротрофических факторов (Barati, S., P. R. Hurtado, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 GDNF gene delivery via the p75(NTR) receptor rescues injured motor neurons.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Exp Neurol 202(1). - 2006. - P.179-188). По сравнению с невирусными векторами вирусные векторы обладают большей трансфекционной активностью. Инъекция в область травматического повреждения спинного мозга генетической конструкции на основе вируса простого герпеса с геном gdnf улучшает восстановление функции (Natsume, A., D. Wolfe, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Enhanced functional recovery after proximal nerve root injury by vector-mediated gene transfer.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Exp Neurol 184(2). - 2003. - P.878-886). Локальная доставка в область травмы спинного мозга того же гена при помощи аденовирусного вектора предотвращает ретроградную атрофию кортикоспинальных мотонейронов и стимулирует восстановление двигательной функции (Tang, X.-Q., Y. Wang, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Adenovirus-mediated delivery of GDNF ameliorates corticospinal neuronal atrophy and motor function deficits in rats with spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Neuroreport 15(3). - 2004. - P.425-429). Инъекция трансгена позволяет трансфицировать клетки, локализация которых ограничена достаточно узкой областью введения. Между тем при травме спинного мозга в патологический процесс вовлекается обширная область, прилегающая к эпицентру травмы. Поэтому для наиболее полного проявления терапевтического действия вводимого гена необходимо обеспечить его присутствие не только в эпицентре травматического повреждения, но и в прилегающих областях, как правило, достаточно удаленных от этой зоны. Для решения этой задачи наиболее перспективным подходом представляется доставка терапевтических генов на клеточных носителях. Многочисленными экспериментальными исследованиями установлено, что трансплантация трансфицированных клеток, несущих трансген, оказывает стимулирующее влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга. Доставку гена gdnf при помощи трансдуцированных ретровирусом фибробластов в область полной перерезки или дорсальной гемисекции спинного мозга крысы осуществили крысам (Blesch, А., М. Н. Tuszynski. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Cellular GDNF delivery promotes growth of motor and dorsal column sensory axons after partial and complete spinal cord transections and induces remyelination.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 J Comp Neurol 467(3). - 2003. - P.403-417), у которых удалось выявить признаки регенерации нервных волокон и их ремиелинизацию. Однако при этом волокна не прорастали через область повреждения и не восстанавливали связи с клетками-мишенями, что не приводило к улучшению двигательной или чувствительной функции. Клеточно-опосредованная доставка гена gdnf осуществлена в область полной перерезки спинного мозга крысы в грудном отделе путем трансплантации трансфицированных глиальных клеток обонятельных структур (Yan, Н. В., Z. М. Zhang, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 The repair of acute spinal cord injury in rats by olfactory ensheathing cells graft modified by glia cell line-derived neurotrophic factor gene in combination with the injection of monoclonal antibody IN-1.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Zhonghua Wai Ke Za Zhi 47(23). - 2009. - P.1817-1820). При сравнении групп животных с трансплантацией трансфицированных и нативных клеток авторам удалось показать устойчивое прорастание регенерирующих волокон через область разрыва только в первом случае, что сопровождалось улучшением восстановления двигательной функции.

Трансплантация клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга сдерживает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое действие, стимулирует неоваскуляризацию (Chen, С. Т., N. Н. Foo, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Infusion of human umbilical cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through anti-inflammatory, vasculogenic and neurotrophic mechanisms.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Pediatr Neonatol 49(3). - 2008. - P.77-83), снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает выживание нейронов (Dasari, V. R., К. К. Veeravalli, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 J. Neurotrauma 26(11). - 2009. - P.2057-2069). На ряде экспериментальных моделей установлено, что клетки крови пуповины, вырабатывая колониестимулирующий фактор 1, тромбопоэтин и интерлейкин-11, обладают иммуномодулирующим действием (Suen, Y., S. М. Lee, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Decreased macrophage colony-stimulating factor mRNA expression from activated cord versus adult mononuclear cells: altered posttranscriptional stability.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Blood 84(12). - 1994. - P.4269-4277; Taguchi, A., T. Soma, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 J Clin Invest 114(3). - 2004. - P.330-338; Vendrame, M., J. Cassady, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Stroke 35(10). - 2004. - P.2390-2395). Согласно нашим данным трансплантация этих клеток, трансфицированных плазмидой с генами нейротрофических факторов, в область травмы спинного мозга крысы оказывает выраженное стимулирующее влияние на нейрорегенерацию (Шаймарданова Г.Ф., Мухамедшина Я.О. и др. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Эффект трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, рекомбинантные гены VEGF и FGF2.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Ж.Морфология 142(4). - 2012. - Р.31-36).

Близким к заявленному изобретению является способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, примененный в исследовании (Yan, Н. В., Z. М. Zhang, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 The repair of acute spinal cord injury in rats by olfactory ensheathing cells graft modified by glia cell line-derived neurotrophic factor gene in combination with the injection of monoclonal antibody IN-1.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Zhonghua Wai Ke Za Zhi 47(23). - 2009. - P.1817- 1820), согласно которому выделенные из организма глиальные клетки обонятельных структур трансфицировали in vitro лентивирусным вектором с геном gdnf. Эти клетки трансплантировали крысам в область повреждения сразу после полной перерезки спинного мозга в грудном отделе. При помощи поведенческого теста «ВВВ» показано более выраженное восстановление двигательной функции, чем у животных с той же травмой, но без введения клеток, а также у животных с той же травмой, но с введением нетрансфицированных тех же клеток. Примененный в исследовании способ клеточно-опосредованной доставки гена gdnf имеет следующие недостатки:

способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 способ доставки гена gdnf при помощи лентивирусного вектора, по сравнению с применением других наиболее исследованных вирусных векторов, таких как вирус простого герпеса, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, является наименее безопасным с точки зрения неконтролируемой дифференцировки трансплантированных клеток и онкогенности;

способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 примененные в качестве носителей трансгена глиальные клетки обонятельных структур, как и шванновские клетки, характеризуются низким миграционным потенциалом, что ограничивает доставку терапевтического гена в ткань-мишень, расположенную на удалении от эпицентра травматического повреждения;

способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 глиальные клетки обонятельных структур, как и шванновские клетки, по сравнению со стволовыми клетками и ранними клетками-предшественницами характеризуются слабым выживанием, что снижает длительность терапевтического действия доставляемых с ними генов.

Задачей заявляемого способа является стимулирование посттравматической регенерации спинного мозга путем трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным репликационно-дефектным аденовирусом, несущим ген глиального нейротрофического фактора (gdnf), что позволит преодолеть вышеупомянутые недостатки ближайшего аналога изобретения и обеспечить достижение нового технического результата, а именно:

способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 обеспечить более полное восстановление структур спинного мозга, ответственных за выполнение двигательной и чувствительной функции;

способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 сократить сроки пребывания больных с травмой спинного мозга в стационаре и повысить качество жизни больных данного контингента.

Поставленная задача решается способом стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга путем однократной трансплантации тотчас после повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf).

Исследования эффективности генно-клеточной терапии при травме спинного мозга в условиях трансплантации в область повреждения трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом мононуклеарных клеток крови пуповины в качестве носителей клонированного терапевтического гена глиального нейротрофического фактора (gdnf) в доступных заявителю источниках информации не выявлены.

Сущность заявленного технического решения заключается в стимулировании посттравматической регенерации спинного мозга путем однократной трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, предварительно трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf).

Заявляемый способ выполняют по известной последовательности этапов. Для создания рекомбинантного аденовируса использован экспрессионный плазмидный вектор pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, Catalog #V493-20, США), в который клонирован ген gdnf по технологии Gateway® (Invitrogen, США) с помощью реакции LR-рекомбинации (реакция основана на сайт-специфической рекомбинационной системе фага способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 ). Полученная таким образом рекомбинантная плазмида, кодирующая аденовирусный геном со вставкой гена gdnf (pAd-GDNF), позволяет получить рекомбинантный аденовирус, содержащий необходимый трансген. С помощью рестрикции ферментом Pad была получена линейная плазмида pAd-GDNF, которой трансфицировали клетки НЕК-293А (Invitrogen, Catalog #R705-07, США) для сборки и репликации аденовируса. Расщепление вектора способствует взаимодействию левого и правого инвертированных концевых повторов и удалению бактериальных последовательностей (а именно участка начала репликации pUC и гена устойчивости к ампициллину). Сборка и репликация рекомбинантного аденовируса происходит в клетках линии НЕК-293А - иммортализированная линия первичных эмбриональных клеток почки человека, трансформированных фрагментами ДНК аденовируса серотипа 5. Клеточная линия содержит стабильно интегрированную в геном копию гена e1, который экспрессирует белки E1 (Е1а и E1b), необходимые для получения рекомбинантного аденовируса. После получения неочищенного вирусного лизата для повышения вирусного титра проводили амплификацию аденовируса Ad5-GDNF в клетках НЕК-293А. Через 2 дня после заражения в культуре клеток наблюдался цитопатический эффект, что указывает на то, что клетки продуцируют вирусные частицы. Пуповинную кровь забирали после получения информированного согласия беременной и дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству крови. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека получали методом седиментации в градиенте плотности фиколла (Hawley, Hawley et al. 2004). После выделения мононуклеарные клетки пуповины крови человека высевали в количестве 2×107 клеток в 10 см культуральные чашки для суспензионных клеток (способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Jet Biofilспособ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 ) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) и содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы (FBS).

Клетки трансдуцировали добавлением 100 мкл рекомбинантного аденовируса Ad5-GDNF (8×108 БОЕ/мл) на 10 см культуральную чашку. После трансдукции клетки инкубировали в течение суток при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2 . Клетки концентрировали ценрифугированием и очищали от культуральной среды промывкой в растворе Dulbecco (DPBS) без ионов Са2+ и Mg2+. Отмытые клетки ресуспензировали в DPBS и в камере Горяева оценивали их количество и жизнеспособность после окраски трипановым синим. Далее генетически модифицированные клетки использовали для трансплантации в область повреждения крысам с моделью контузионной травмы спинного мозга.

Заявленный способ стимулирования регенерации спинного мозга путем трансплантации трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с геном gdnf мононуклеарных клеток крови пуповины человека был изучен на лабораторных крысах и детально описан в следующих примерах.

Эксперименты проведены на белых крысах-самцах весом 150-200 г в соответствии с требованиями локального этического комитета при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет». Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°С со свободным доступом к воде и пище. Хирургические манипуляции на крысах проводили после их наркотизирования путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г).

На модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы изучено влияние на нейрорегенерацию трансплантации в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с геном глиального нейротрофического фактора (gdnf). Крысам под наркозом на уровне восьмого сегмента спинного мозга после ламинэктомии наносили дозированную контузионную травму вертикально падающим металлическим стержнем весом 10 г с высоты 25 мм. Тотчас после ненесения травмы в две точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы и на 0,5 мм латеральнее срединной линии при помощи гамильтоновского шприца инъецировали предварительно трансдуцированные рекомбинантным аденовирусом с геном gdnf мононуклеарные клетки крови пуповины человека по 1 млн клеток в 5 мкл DPBS (фосфатно-солевой буфер Dulbecco, стерильный, без ионов Са2+ и Mg 2+, БиолоТ, Россия) в каждую точку. Животным контрольной группы в аналогичных условиях эксперимента вводили те же клетки, трансфицированные аденовирусным вектором с геном зеленого флуоресцентного белка (egfp).

Для оценки эффективности восстановления двигательной функции использовали поведенческий тест в открытом поле «ВВВ» (Basso, D. М., М. S. Beattie, J. С. Bresnahan. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Journal ofNeurotrauma 12. - 1995. - P.1-21).

Ha 30 сутки после нанесения контузионной травмы выделяли спинной мозг. На криостатных поперечных срезах спинного мозга на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы проводили иммунофлуоресцентную реакцию. Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антителами против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, Santa Cruz, 1:200) в течение суток при 4°С, промывали в фосфатно-солевом буфере и затем инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре 4способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 ,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатном буфере, Sigma). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss).

1. Тестирование двигательной функции при помощи поведенческого теста «ВВВ»

Показатель восстановления двигательной функции (ВВВ) при трансплантации в область повреждения спинного мозга мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с терапевтическим геном gdnf возрастает на 58% (Р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем у животных контрольной группы с введением тех же клеток, трансфицированных геном зеленого флуоресцентного белка (egfp). На сроке 9, 11 и 13 суток показатель ВВВ в опытной группе по сравнению с контрольной соответственно возрастает на 62,7%, 59,5% и 53,5%.

2. Иммуногистохимическое исследование спинного мозга

К 30 суткам после контузионной травмы спинного мозга крысы и введения в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с генами gdnf (опытная группа) и egfp (контрольная группа), в белом и сером веществе обнаружены GFAP+-клетки. В опытной группе в белом веществе (вентро-медиальная часть переднего канатика и латеральная часть бокового канатика) на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении популяция GFAP+-клеток в 2 раза превышает аналогичную в контрольной группе.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ локальной доставки терапевтического гена глиального нейротрофического фактора (gdnf) в область травмы спинного мозга позволяет эффективно стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в виде улучшения показателей восстановления функции и увеличения количества реактивных астроцитов, существенно необходимых для протекания процесса нейрорегенерации. Выявленное нами в результате проведения генно-клеточной терапии увеличение количества GFAP +-астроцитов следует рассматривать как позитивный фактор стимулирования нейрорегенерации. Этот вывод основан на известном представлении о роли реактивных астроцитов, которые оказывают антиоксидантное и цитопротекторное действие на нейроны и мелинобразующие олигодендроциты, в том числе путем увеличения экспрессии мембранного транспортера глутамата и снижения содержания этого возбуждающего нейромедиатора во внеклеточном пространстве (Lepore, А. С, J. Oспособ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Donnell, et al. способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Reduction in expression of the astrocyte glutamate transporter, GLT1, worsens functional and histological outcomes following traumatic spinal cord injury.способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью генетически   модифицированных клеток крови пуповины человека, патент № 2521225 Glia. -2011).

Заявителем впервые:

- применен способ локальной доставки в область травматического повреждения спинного мозга терапевтического гена глиального нейротрофического фактора (gdnf) при помощи мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцировванных рекомбинантным аденовирусом с упомянутым клонированным геном;

- показано стимулирующее влияние генно-клеточной терапии, сочетающей доставку в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека, обладающих собственным терапевтическим действием, и клонированного гена gdnf на посттравматическое восстановление структуры и функции спинного мозга.

Использование заявляемого способа стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга методом трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом с клонированным геном глиального нейротрофического фактора (gdnf), позволяет:

- улучшить результаты посттравматической регенерации спинного мозга в виде более полного восстановления структуры и функции органа;

- сократить сроки пребывания больных с травмой спинного мозга в стационаре и повысить качество жизни больных данного контингента.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2521225

patent-2521225.pdf

Класс A61K48/00 Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии

композиция для лечения рака легких, прежде всего, немелкоклеточного рака легких (нмкрл) -  патент 2526510 (20.08.2014)
средство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения -  патент 2522778 (20.07.2014)
способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы -  патент 2521506 (27.06.2014)
способ фотодинамической терапии опухолей -  патент 2519936 (20.06.2014)
средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток -  патент 2519714 (20.06.2014)
биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения -  патент 2519326 (10.06.2014)
двойное нацеливание нп mir-208 и mir 499 в лечении заболеваний сердца -  патент 2515926 (20.05.2014)
поксвирусные онколитические векторы -  патент 2508401 (27.02.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
поксвирусные онколитические векторы -  патент 2503717 (10.01.2014)

Класс A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах  1/00

улучшение памяти у пациентов с оценкой 24-26 баллов по краткой шкале оценки психического статуса -  патент 2529815 (27.09.2014)
способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
способ лечения ран мягких тканей различной этиологии -  патент 2528905 (20.09.2014)
хиназолиноны как ингибиторы пролилгидроксилазы -  патент 2528412 (20.09.2014)
новый агонист бета рецептора тиреоидного гормона -  патент 2527948 (10.09.2014)
стабильная жидкая фармацевтическая композиция комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината, обладающая антигипоксическим, антиоксидантным и адаптогенным действием -  патент 2527347 (27.08.2014)
четырехзамещенные бензолы -  патент 2527177 (27.08.2014)
способ коррекции негативных эффектов низких температур на предстательную железу крыс -  патент 2527172 (27.08.2014)
способ модулирования биологических функций, ассоциированных с процессом старения пожилого или старого животного-компаньона. -  патент 2525617 (20.08.2014)
гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты), способ получения гомографта, среда для воздействия на ткани гомографта (варианты) -  патент 2525197 (10.08.2014)
Наверх