способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после выделения ДНК проводят анализ полиморфизма гена лимфотоксина (+250G/A Lt ) и прогнозируют повышенный риск формирования сахарного диабета на фоне гипертонической болезни в случае выявления аллеля +250G Lt , а при обнаружении генотипа +250АА Lt - низкий риск развития сахарного диабета второго типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов цитокинов

- это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции цитокинов, что может влиять на развитие патологического процесса в организме.

В Российской Федерации, как и во всем мире, гипертоническая болезнь остается одной из наиболее значимых проблем, что обусловлено как широким распространением данного заболевания (около 40% взрослого населения имеет повышенный уровень артериального давления), так и тем, что более 3 млн ежегодно умирает от осложнений гипертонической болезни, что выводит данную патологию за рамки чисто кардиологической проблемы, придавая ей многодисциплинарный и социально значимый характер [Диагностика и лечение артериальной гипертензии. Рекомендации Российского медицинского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, прил. 2. - 2008. - № 6. - С.32]. Одним из определяющих факторов риска развития осложнений у больных гипертонической болезнью является наличие сахарного диабета. Гипертоническая болезнь и сахарный диабет - две патогенетически взаимосвязанные патологии, которые обладают мощным взаимоусиливающим повреждающим действием. Их сочетание повышает риск развития ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, церебральных осложнений и заболеваний периферических сосудов [Sowers, J.R. Treatment of hypertension in patients with diabetes / J.R. Sowers // Arch. Intern. Med. - 2004. - Vol.164 (17). - P.1850-1857].

Гипертоническая болезнь представляет собой мультифакториальное заболевание с выраженным генетическим компонентом. Согласно экспериментальным и клиническим данным существенный вклад в развитие данного заболевания вносят цитокины, участвующие в воспалительном процессе и механизмах апоптоза. Одним из мощных провоспалительных цитокинов является лимфотоксин альфа.

Согласно данным литературы лимфотоксин альфа (Lt ) представляет собой гликопротеид массой около 33 кД, который продуцируется стимулированными митогенами Т-лимфоцитами и лейкоцитами, а также секретируется фибробластами, астроцитами, миеломными клетками, эпителио- и эндотелиоцитами [Кетлинский, С.С. Цитокины / С.С. Кетлинский, А.С. Симбирцев.- М.: Фолиант, 2008.-552 с.]. Lt является хемоаттрактантом для нейтрофилов, стимулирует в них образование пероксид-ионов, усиливает фагоцитоз и адгезию к эндотелию, стимулирует активность фибробластов, играет роль в процессе заживления ран, а также провоцирует выработку стресс-гормонов, влияет на метаболизм глюкозы [Mentula P. Markers of Inflammation and Immunosupression as Predictors of Organ Failure in Human Acute Pancreatitis / P. Mentula // Academic dissertation.-Helsinki.-2005].

Известен способ диагностики предрасположенности к сахарному диабету второго типа по патенту на изобретение RU № 2373835 (публикация: 27.11.2009), при котором сканируют целиком открытые ладони совместно с пальцами вначале левой, а затем и правой руки. По полученным изображениям производят оценку дерматоглифических признаков, характеризующих папиллярные узоры дистальных фаланг пальцев и топографию ладонных узоров. Учитывают тип узора; гребневой счет; величину угла atd; направление главных ладонных линий A, B, C и D в ладонные поля; характер рисунков на тенаре, гипотенаре, на пальцах и в межпальцевых полях; количество, ширину и тип расположения ладонных линий; расположение ладонных и осевых трирадиусов. По результатам оценки делают вывод о степени риска заболевания сахарным диабетом второго типа.

Недостаток метода заключается в том, что в приведенных примерах нет подтверждения соответствия полученного согласно изобретению выводу предварительному заключению, полученному стандартными методами диагностики.

Известен способ лабораторной диагностики гипертонической болезни и сахарного диабета по заявка на изобретение RU № 2008147645 (публикация:10.06.2010), основанный на изучении состава и структурных свойств ротовой жидкости, отличающийся тем, что определяют содержание натрия, калия и кальция и отношение концентрации натрия к содержанию калия в слюне обследуемого и при значении содержания кальция 0,05-0,06 г/л и отношении Na/K 0,2-0,3 диагностируют гипертоническую болезнь, а при содержании кальция более 0,07 г/л и значениях отношения Na/K 0,12 и менее - диагностируют сахарный диабет.

Недостаток метода заключается в том, что он не дает возможность спрогнозировать склонность больного к развитию сахарного диабета.

Известен способ «Genetic variants in the TCF7L2 gene as diagnostic markers for risk of type 2 diabetes mellitus» по патенту на изобретение EA № 016397 В1 (публикация: 30.04.2012), включающий забор венозной крови, анализ образца нуклеиновой кислоты, полученного у индивидуума, на маркер или гаплотип в LD блоке экзона 4 TCF7L2, между маркерами rs4074720 и rs7087006 или с сильным нарушением равновесия сцепления с LD блоком экзона 4 TCF7L2, характеризующимся численным значением r2 более чем 0,2, где присутствие маркера или гаплотипа является индикатором восприимчивости к сахарному диабету II типа.

В данном изобретении выявлена связь склонности к диабету второго типа для исландской популяции и популяции мексиканских американцев, основанная на различных хромосомах, что подтверждает невозможность использования этого способа для российской популяции.

Задачей настоящего исследования является разработка способа прогнозирования развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью российской популяции, конкретнее - уроженцев Центрального Черноземья.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска формирования сахарного диабета второго типа на фоне гипертонической болезни уроженцев Центрального Черноземья по данным о генетическом полиморфизме +250G/A Lt .

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки риска развития сахарного диабета второго типа при гипертонической болезни уроженцев Центрального Черноземья, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена лимфотоксина ;

- прогнозирование повышенного риска формирования сахарного диабета в случае выявления аллеля +250G Lt и пониженного риска развития этого заболевания у больных гипертонической болезнью при выявлении генотипа +250АА Lt .

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза высокого или низкого риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью уроженцев Центрального Черноземья по наличию аллеля +250G и генотипа +250АА гена лимфотоксина (полиморфизм +250G/A Lt ).

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных гипертонической болезнью в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCL:, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Изучение полиморфного локуса лимфотоксина (+250G/A Lt ) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (таблица 1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgC12, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации в течение 4 мин при 95°C выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 59°C; денатурация - 15 с при 95°C.

Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемого ДНК-маркера
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
Lt	+250A/G (1 интрон)	F:5'-CAGTCTCATTGTCTCTGTCACACATT-3'	[Polymorphisms of tumor necrosis factor (TNF) a and (3 genes in Korean patients with psoriasis / T. Kim [et al.] // Arch. Dermatol. Res.-2003.-V.295.-P.8-13]
		R:5'-ACAGAGAGAGACAGGAAGGGAACA-3'
		5'-FAM:CCATGGTTCCTCTC-RTQ1-3'
		5'-ROX:CTGCCATGATTCC-RTQ1-3'

Изобретение характеризуют следующие фигуры:

Фигура 1. Дискриминация аллелей по локусу +25GG/A Lt (где -гомозиготы +250GG, - гомозиготы +250АА, - гетерозиготы +250AG).

Фигура 2. Частота генотипа +250АА Lt среди больных гипертонической болезнью в зависимости от наличия сахарного диабета второго типа и в контрольной группе, %.

Фигура 3. Частота аллеля +250G Lt среди больных гипертонической болезнью в зависимости от наличия сахарного диабета второго типа и в контрольной группе, %.

Фигура 4. Таблица «Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера +250G/A Lt у больных гипертонической болезнью, в зависимости от наличия сахарного диабета второго типа и в контрольной группе».

При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G. Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора на оси x относительно RFU для другого флуорофора на оси у на диаграмме дискриминации аллелей (фиг.1).

Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (AG).

Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A, RFU аллеля А отложены по оси у.

Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G, RFU аллеля G отложены по оси х.

Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно, в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученного ДНК-маркера с развитием сахарного диабета у больных гипертонической болезнью оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI).

Возможность использования предложенного способа для определения риска возникновения сахарного диабета подтверждает анализ результатов наблюдений 97 больных гипертонической болезнью и 489 человек популяционного контроля. Больные были разделены на две группы: первая - с изолированной гипертонической болезнью (n=58), вторая - с гипертонической болезнью и сахарным диабетом второго типа (n=39). Группы были сопоставимы по возрасту, полу, длительности гипертонической болезни, проводимому лечению и сопутствующим заболеваниям. В выборки больных и популяционного контроля включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья и не имеющие родства между собой. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

Установлена низкая концентрация генотипа +250АА (25,64%) в группе больных гипертонической болезнью с сахарным диабетом второго типа в сравнении как с контрольной группой (54,81%, ²=11,18, p=0,01, OR=0,28, 95%CI 0,13-0,63), так и с группой пациентов без сахарного диабета второго типа (50,00%, ²=4,79, p=0,03) (фиг.2, фиг.4).

Также, выявлена высокая концентрация аллеля +250G у больных гипертонической болезнью с сахарным диабетом второго типа (46,15%) в сравнении как с контрольной группой (24,95%, ²=15,60, p=0,01, OR=2,58, 95%CI 1,57-4,22), так и с группой пациентов без сахарного диабета второго типа (29,31%, ²=5,03, p=0,03) (фиг.3, фиг.4).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель +250G гена Lt является фактором риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью (OR=2,58), а генотип +250АА Lt - протективным фактором формирования данной патологии (OR=0,39).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие сахарного диабета второго типа у больных с гипертонической болезнью, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике сахарного диабета у больных гипертонической болезнью из группы риска: диспансерное наблюдение с регулярным контролем уровня глюкозы крови натощак, соблюдение гипокалорийной диеты (необходимо исключить легко усваиваемые углеводы, животные жиры), снижение избыточной массы тела.