Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью

Классы МПК:C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12N9/22 рибонуклеазы
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-02-18
публикация патента:

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270. Штамм обладает высокой продукцией щелочной рибонуклеазы - 921,8 Е/мл и активностью против вирусов гриппа птиц A/H5N1 и человека А/Аichi/2/68 (H3N2). 2 ил., 7 табл., 8 пр.

Рисунки к патенту РФ 2520086

штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086

Изобретение относится к штамму бактерий Aeromonas bestiarum Bp-1010 для производства щелочной рибонуклеазы (РНКазы) и может быть использовано в микробиологии и биотехнологии.

В настоящее время при разработке средств профилактики и терапии вирусных инфекций все большее внимание уделяется изучению нуклеаз - ферментов, деполимеризующих нуклеиновые кислоты. Они находят широкое применение в практическом использовании: для изучения структуры и функции нуклеиновых кислот, в качестве лечебных препаратов, в косметологии, для изготовления бактериальных удобрений, для защиты пчел и т.д.

Обнаружение РНКаз с новыми свойствами позволит создать препараты, обладающие разными видами биологической активности.

Известно, что наиболее активными в отношении синтеза щелочной рибонуклеазы являются разные штаммы рода Bacillus [Ферменты микроорганизмов. / О.И. Юсупова // М.: Наука. - 1973. - 163 с.]. Штаммы рода Aeromonas также используются в качестве продуцентов биологически активных веществ (БАВ).

Известен штамм Aeromonas species КММ НФ 5-9, способный разрушать углеводороды нефти, который не является патогеном [Патент РФ № 2127310, МПК C12N 1/20, опубл. 10.03.1999 г.], входящий в консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Aeromonas species, Alcaligenes denitrificans, Artrobacter species, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.

Из штамма бактерий Aeromonas sobria ВГНКИ КРК 1-1983 ДЕП; выделен антиген, используемый в качестве высокоэффективного профилактического средства против различных форм заболеваний, вызываемых бактериальными агентами /аэромонадами, энтеробактериями/, обладающий высоким протективным действием, универсальностью и экологической чистотой [Патент РФ № 2080874, МПК A61K 39/02, опубл. 10.06.2012 г.].

Известен штамм грибов Penicillium brevi-compactum BKM.F-2464D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов, коллекционный номер BKM F 2464 D), являющийся продуцентом щелочной рибонуклеазы и обладающий противовирусной активностью. [Авторское свидетельство СССР № 1100309, МПК C12N 9/22, опубл. 30.06.1984 г.].

Известен штамм бактерий Bacillus intermedius 7p-продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы [Авторское свидетельство СССР № 587156, МПК C12K 1/00, опубл. 05.01.1978 г.]. Активность фермента РНКазы составляет не более 280 ед/мл.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по достигаемому техническому результату является штамм бактерий Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - стрептомицинустойчивый продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью [Патент РФ № 2384619, МПК C12N 9/22, опубл. 20.03.2010 г.].

Однако вышеприведенные аналоги имеют недостаточную ферментативную активность РНКазы, а противовирусная активность указанного фермента продекларирована, но не подтверждена экспериментально на конкретных вирусных агентах.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового продуцента - штамма бактерий, обладающего более высокой продукцией щелочной рибонуклеазы и противовирусной активностью.

Указанный технический результат достигается получением штамма бактерий Aeromonas bestiarum BP-1010, являющегося продуцентом щелочной рибонуклеазы, обладающего противовирусной активностью и депонированного в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270.

Заявляемый бактериальный штамм был получен из донных осадков озера Байкал при высеве образца на полную агаризованную среду со значением pH 7,2 и температуре инкубирования 28-30°C. Для выделения бактерий-продуцентов нуклеолитических ферментов была применена методика отбора колоний на селективных средах и метод электрофореза в агарозном геле. Использовали среду, содержащую нуклеиновые кислоты [Герхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии - М.: Мир, 1984. - Т.3. - 264 с.]. Из большого разнообразия штаммов было выделено несколько штаммов для последующего анализа на содержание ферментов нуклеолитического типа.

При лабораторной проверке выделенных штаммов оказалось, что наиболее высокой активностью щелочной рибонуклеазы в одинаковых условиях обладает штамм Bp-1010 (табл.1).

Таблица 1.
Данные анализа по РНКазной активности КЭ штаммов, выделенных из донных осадков.
образец штаммБелок, мг/мл РНКазная активность, ед/мл
11-11Bp 4703,8 261,8
11-13 Bp 8683,6 332.2
11-14 Bp 8789,1436,7
11-16Bp 1010 6,5721,0
11-17Bp 856 5,8134,2
11-20Bp 882 3,3200,0

Заявляемый штамм бактерий Aeromonas bestiarum Bp-1010 имеет следующие признаки.

Морфологические и физиологические признаки штамма

Клетки штамма представляют собой грамотрицательные, неспороносные, подвижные палочки, расположенные по 1-2, размером 0,5-0,6×0,8-3,5 мкм. На плотной среде рыбный питательный агар (РПА, Оболенск, Россия) штамм формирует округлые, гладкие, однородные, блестящие, прозрачные, бежеватые колонии с ровным краем. Штамм является факультативным анаэробом с диапазоном роста при температуре 10-41°C и оптимумом роста при температуре 30-37°C. Штамм способен к росту при значениях pH питательной среды от 5,5 и до 9,0, оптимальным является pH среды 7,0-7,2.

Биохимические признаки штамма Bp-1010. Штамм усваивает глюкозу, мальтозу, глицерин с образованием кислоты и газа, не гидролизует ксилозу, маннит, лактозу и сахарозу. Растет на минимальной среде с добавлением аспарагина, аргинина или глютаминовой кислоты в качестве источника углерода. Не растет при концентрации 7,5% NaCl в жидкой среде LB ("Difco", США). Реакция Фогес-Проскауера на индол, сероводород, оксидазу, каталазу и утилизацию цитрата положительная. Нитраты восстанавливает, пигменты не образует. Показано наличие липазной и слабой фосфатазной активности. Используя морфологические и биохимические свойства, а также данные, полученные по анализу 16S рибосомальной РНК, штамм был отнесен к роду Aeromonas виду bestiarum и назван Aeromonas bestiarum Bp-1010.

Устойчивость к антибиотикам Штамм Aeromonas bestiarum Bp-1010 содержит плазмидную ДНК; устойчив к ампициллину, клиндамицину, карбенициллину, чувствителен к левомицетину, канамицину, рифампицину. При культивировании применяли питательную среду "S" следующего состава в г/л: (Пептон Difco - 16,0; NaCl - 5,0; MgCl 2 - 0,1-, Трис - 6,05; pH 8.0) или "Lb" Difco (дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 5,0; NaCl - 5,0; pH 7,2).

Хранение штамма

Субкультуры штамма хранят периодическими пересевами на агаризованную среду РПА, в 15%-ном растворе глицерина при низкотемпературном замораживании при минус 65°C и в лиофильно высушенном состоянии. Штамм Aeromonas bestiarum Bp-1010 депонирован в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр биотехнологии и вирусологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под коллекционным номером B-1270. Справка о депонировании штамма прилагается.

Для получения образцов культуральной жидкости (КЖ) штаммы культивировали в среде "S" или "Lb" в течение 18 час при 37°C с последующим центрифугированием 20 мин при 8000 об/мин. Полученные образцы КЖ и биомассы хранили в замороженном состоянии при - 20°C.

Скрининг штаммов на наличие неспецифических нуклеаз (H). Для определения наличия H биомассу отдельных колоний вносили в 150-200 мкл дистиллированной воды или TEN буфера (0.1 M Трис, pH 7.5, 0.01 M ЕДТА, 0.05 M NaCl). Бактериальные клетки лизировали лизоцимом (0,5 мг/мл) с добавлением тритона X-100 (0,1%). Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге Eppendorf, а клеточные экстракты (КЭ) использовали для определения нуклеазной активности. Аликвоты КЭ в количестве 1-2 мкл вносили в реакционную смесь, содержащую 1 мкг субстратной ДНК (ДНК фага штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 , T7 или другой). Все субстраты производства фирмы СибЭнзим (Новосибирск). Анализ нуклеазной активности проводили при температуре 37°C в буфере W, [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - 480 с.]. Продукты реакции подвергали электрофорезу в 0.8-1.0%-ном агарозном геле ("Sigma", США). О наличии эндонуклеаз в штаммах микроорганизмов и их активности судили по исчезновению субстратной ДНК на картине электрофореграммы в УФ-свете по отношению к контролю. (Фиг.1, 2).

Для количественного определения ферментативной активности использовали метод превращения субстратных нуклеиновых кислот (дрожжевой РНК или ДНК из молок лосося) во фрагменты, которые растворимы в 4%-ной HClO4, с появлением кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм. Удельную активность измеряли в ед./ мг белка [Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Капранова М.Н., Голубенке И.А. Методы определения активности нуклеаз и родственных ферментов. // Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов - 1980, - С.53-60].

Анализ культуральной жидкости (КЖ) на содержание внеклеточных нуклеаз. Бактериальные клетки выращивали в колбах на среде "Lb" или "S" в объеме среды 50-200 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 18-20 часов. Температура культивирования 30-37°C. После выращивания бактериальных штаммов в жидкой питательной среде КЖ собирали центрифугированием на центрифуге J2-21 Beckman (США) и замораживали.

Анализ биомассы на содержание Н. Для получения клеточных экстрактов (КЭ) бактериальные клетки в количестве 0,5-1,0 г подвергали разрушению в 4,0 мл дистилированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C, контролируя на спектрофотометре падение величины D550 до уменьшения оптической плотности суспензии на 80-90% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Супернатант замораживали. Далее проводили анализ.

Таблица 2.
Анализ отдельных клонов штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010, полученных с "LA" и селективной среды.
№ образцаШтамм (клон) Вид образцаБелок, мг/мл РНКазная активность, ед/млУдельная активность ед/мг белкаГидролиз ДНК фага T7, лямбда.
12-137Bp-1010 с "LA"КЭ 8,0545,668,2 ±
12-139 Bp-1010 с сел. среды КЭ10,3671,0 67,1±
12-141Bp-1010 с "LA"КЭ 7,5421,356,2 ±
12-143 Bp-1010 с сел. среды КЭ5,4732,6 132,6±
12-145Bp-1010 с "LA"КЭ 5,8479,682,7 ±
12-147 Bp-1010 с сел. среды КЭ8,2572,0 69.8±
Примечание: обозначения: КЭ-клеточный экстракт, (±) - частичное разрушение ДНК T7 или лямбда.

В таблице 2 приведены данные по клонированию штамма с целью получения наиболее активных клонов. Методом рассева из микробной популяции был отобран клон по признаку максимальной РНКазной активности (12-143). При выращивании отобранного клона на среде "Lb" в течение 20 ч на качалке при 30°C активность его достигала 732,6 ед/мл. Максимальная РНКазная активность штамма в этих условиях составила 732,6 ед/г влажной биомассы.

Изобретение иллюстрировано следующими графическими материалами. На Фиг.1 приведена электрофореграмма, характеризующая сравнительный анализ отдельных клонов Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие нуклеаз. На фиг.2 приведена электрофореграмма, характеризующая степень гидролиза ДНК фага T7 (1-5) и РНК фага MS2 (6-10) нуклеазами образцов КЖ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010. Данное изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Получение образцов КЭ с использованием лизоцима. Клетки штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010 культивировали в 5,0 мл среды Lb pH 7,2 18 ч на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием и замораживали. После разрушения лизоцимом с тритоном X-100 полученный КЭ использовали для анализа на наличие ферментов.

Пример 2. Анализ биомассы (КЭ) на содержание РНКазной активности после разрушения ультразвуком. Клетки штамма (12-139) культивировали в 200 мл "Lb". Для получения клеточных экстрактов биомассу в количестве 0,45 г подвергали разрушению в 8,0 мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C. Падение величины D550 составило 90% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Далее проводили анализ КЭ на наличие РНКазной активности. Активность составила 833,8 ед/мл.

Пример 3. То же, что пример 2. Проводили анализ образцов КЖ на наличие РНКазной активности. Активность составила 178,2 ед/мл.

Пример 4. Определение РНКазной активности КЭ при разных pH. Клетки штамма 12-143 культивировали в 50 мл "Lb". Для получения клеточных экстрактов биомассу в количестве 0,40 г подвергали разрушению в 4-х мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C. Падение величины D550 составило 85% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Образцы КЭ использовали для определения РНКазной активности в реакционной среде при pH 6,0; 7,0 и 8,0. Наибольшая активность получена при pH 8,0. Активность составила 773,3 ед/мл(Табл.3).

Таблица 3.
Определение оптимальной pH для РНКазной активности КЭ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010
Образец рН реакционной смесиРНКазная активность, ед/мл
1 штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 6,0325,6
212-143 7,0631,9
3штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 8,0773.3

Пример 5. Клетки выращивали в колбах на среде "S" в объеме среды 100 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 20 часов. Температура культивирования 37°C. После выращивания бактериальных штаммов в жидкой питательной среде КЖ собирали центрифугированием и замораживали. Затем проводили анализ, как описано выше. Данные сравнительного анализа КЖ и КЭ представлены в таблице 4.

Таблица 4.
Анализ КЖ и КЭ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие РНКазной активности.
Образец Штамм Bp 1010Вид образца РНКазная активность, Е/мл
12-16412-143КЖ 163,9
12-165 штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 КЭ921,8
12-16612-139 КЖ178,2
12-167штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 КЭ833,8

Пример 6. Бактериальные клетки выращивали в колбах на среде "Lb" в объеме среды 100 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 20 часов. Температура культивирования 30°C. После выращивания КЖ собирали центрифугированием и замораживали. Далее проводили анализ, как описано выше. Данные сравнительного анализа КЖ и КЭ представлены на фиг.1 и 2.

На фиг.1 приведен сравнительный анализ отдельных клонов Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие нуклеаз: КЖ (1-6) и КЭ (8-13) соответственно; 7, 14 - контроль ДНК T7/W. Разведение КЖ и КЭ 1:10; лизис в 0,01 M трис-буфере pH 7,5 лизоцимом + тритон X-100. Время инкубации 30 мин.

На фиг.2. Представлена степень гидролиза ДНК фага T7 (1-5) и РНК фага MS2 (6-10) нуклеазами образцов КЖ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010. Разведение КЖ 1:10 дистилированной водой.

Таблица 5.
Сравнительные данные по РНКазной и ДНКазной активности штамма Aeromonas bestiarum BP-1010
Обра-

зец
штамм ДНКазная активность, Е/млУдельная активность, Е/мг белкаРНКазная активность, Е/мл Удельная активность, Е/мг белка
КЭBp 1010 53,98,3721,6 111,0

Сравнительные данные по РНКазной и ДНКазной активности штамма Aeromonas bestiarum BP-1010 представлены в таблице 5. Штамм обладает низкой ДНКазной активностью.

Определение противовирусной активности

Приготовление препаратов на основе водорастворимых метаболитов. Для приготовления препаратов использовали бактериальные клетки, наработанные в среде LB. Культуральную жидкость (КЖ) центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Осадки клеток использовали для приготовления экстрактов с помощью ультразвуковой дезинтеграции (УЗ). Далее надосадочную жидкость и клеточные экстракты стерилизовали ультрафильтрацией и использовали для приготовления препаратов.

Культуры клеток. Для тестирования цитотоксичности и противовирусной активности препарата использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл/лунку суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 1-2 сут до образования сплошного клеточного монослоя.

Вирус. В работе использовали штаммы вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанные в отделе профилактики и лечения ООИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Наработку производили на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).

Определение противовирусного действия препаратов

Исследование противовирусной активности образцов проводили по профилактической схеме: сначала на культуру клеток вносится образец и затем вирус.

Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СНУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха.

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640, фирмы ООО «Биолот», С-Петербург, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK (Sigma, США).

2. Контроль репродукции вирусов гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в разведениях с 1 до 8 с десятикратным шагом без внесения препаратов, но с предварительным внесением питательной среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK, в объеме 50 мкл/лунку.

3. Контроль цитотоксичности препаратов в выбранных дозах.

Пример 7. Исследование противовирусной активности проводили на образце 11-16 заявляемого штамма (табл.1). Для изучения противовирусной активности штамма клетки выращивали в 100 мл "Lb" 24 ч при температуре 36°C. КЖ слили, а биомассу (0,4 г) заморозили и хранили при температуре -20ºC. Через 24 ч клетки разморозили и разрушили ультразвуком на дезинтеграторе MSE (Англия) в 4 мл дистиллированной воды для получения КЭ, который использовали для изучения противовирусной активности на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro относительно вируса гриппа птиц A/H5NI, титр которого составил 2,5 lg. (профилактическая схема). Данные представлены в таблице 6.

Пример 8. Изучение противовирусной активности проводили на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro, как в примере 7, но образец использовали для изучения противовирусного действия на вирусе гриппа человека А/Аичи/2/68 (H3N2). Данные представлены в таблице 7.

Таблица 6.
Изучение противовирусной активности штаммов на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro относительно вируса гриппа птиц A/H5NI в -1 разведении
Образец Штамм Исходная концентрация препарата Разведение препарата 1:2
1 23 123
11-16Bp-1010 -- --- -
11-16 Bp-1010-- -- --
Среда "Lb"- +++ +++
Среда "S" -++ +++ +
Контроль -++ +++ +
Примечание: (-) - отсутствие вируса (наличие эффекта), (+) - наличие вируса (отсутствие эффекта).

Из таблиц 6 и 7 видно, что КЭ штамма, содержащий фермент РНКазу, нейтрализует вирусы гриппа птиц A/H5NI и человека А/Аичи/2/68 (H3N2) в профилактической схеме анализа на 100%.

Таблица 7.
Изучение противовирусной активности штаммов на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro с использованием вируса гриппа человека А/Аичи/2/68 (H3N2) в -1 разведении
№ образцаШтамм Титр вируса А/Аичи/2/68 (H3N2) (lg ТЦД50/МЛ) Индекс нейтрализации (lg ТЦД50)
11-16Bp 10100 2,5
11-16 Bp 10100 2,5
Контроль штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы,   обладающий противовирусной активностью, патент № 2520086 2,5 lg-
Примечание: Индекс нейтрализации составил 2.5 lg.

Таким образом, из выше приведенного описания заявки видно достижение технического результата - получение нового штамма бактерий Aeromonas bestiarum BP-1010, обладающего более высокой продукцией щелочной рибонуклеазы (согласно табл.4 - 921,8 Е/мл) и активностью против. вирусов гриппа птиц A/H5NI и человека А/Аичи/2/68 (H3N2).

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2520086

patent-2520086.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/20:
способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12N9/22 рибонуклеазы

Патенты РФ в классе C12N9/22:
штамм бактерий serratia species, являющийся продуцентом внеклеточной рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью -  патент 2528064 (10.09.2014)
конструкция на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения -  патент 2480524 (27.04.2013)
контролируемая деградация структурированных полирибонуклеотидов -  патент 2458986 (20.08.2012)
способ получения панкреатической рибонуклеазы -  патент 2388821 (10.05.2010)
стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы -  патент 2384619 (20.03.2010)
способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота -  патент 2311455 (27.11.2007)
олигонуклеотидпептидный конъюгат, обладающий способностью расщеплять фосфодиэфирные связи рнк в последовательностях 5'gpn3' -  патент 2305108 (27.08.2007)
способ разделения смеси человеческой днказы (варианты), очищенная дезамидированная человеческая днказа, очищенная недезамидированная человеческая днказа, фармацевтическая композиция для снижения вязкоупругости гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего скоплением гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего муковисцидозом, бронхитом, пневмонией -  патент 2238320 (20.10.2004)
способ получения инсерционных мутаций -  патент 2237715 (10.10.2004)
молекула каталитической днк, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью (варианты), композиция, расщепляющая нуклеиновую кислоту, способ расщепления фосфоэфирной связи в субстрате, способ селекции каталитической днк (варианты), молекула энзиматической днк (варианты) -  патент 2220204 (27.12.2003)


Наверх