штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью

Формула изобретения

Штамм бактерий Aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к штамму бактерий Aeromonas bestiarum Bp-1010 для производства щелочной рибонуклеазы (РНКазы) и может быть использовано в микробиологии и биотехнологии.

В настоящее время при разработке средств профилактики и терапии вирусных инфекций все большее внимание уделяется изучению нуклеаз - ферментов, деполимеризующих нуклеиновые кислоты. Они находят широкое применение в практическом использовании: для изучения структуры и функции нуклеиновых кислот, в качестве лечебных препаратов, в косметологии, для изготовления бактериальных удобрений, для защиты пчел и т.д.

Обнаружение РНКаз с новыми свойствами позволит создать препараты, обладающие разными видами биологической активности.

Известно, что наиболее активными в отношении синтеза щелочной рибонуклеазы являются разные штаммы рода Bacillus [Ферменты микроорганизмов. / О.И. Юсупова // М.: Наука. - 1973. - 163 с.]. Штаммы рода Aeromonas также используются в качестве продуцентов биологически активных веществ (БАВ).

Известен штамм Aeromonas species КММ НФ 5-9, способный разрушать углеводороды нефти, который не является патогеном [Патент РФ № 2127310, МПК C12N 1/20, опубл. 10.03.1999 г.], входящий в консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Aeromonas species, Alcaligenes denitrificans, Artrobacter species, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.

Из штамма бактерий Aeromonas sobria ВГНКИ КРК 1-1983 ДЕП; выделен антиген, используемый в качестве высокоэффективного профилактического средства против различных форм заболеваний, вызываемых бактериальными агентами /аэромонадами, энтеробактериями/, обладающий высоким протективным действием, универсальностью и экологической чистотой [Патент РФ № 2080874, МПК A61K 39/02, опубл. 10.06.2012 г.].

Известен штамм грибов Penicillium brevi-compactum BKM.F-2464D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов, коллекционный номер BKM F 2464 D), являющийся продуцентом щелочной рибонуклеазы и обладающий противовирусной активностью. [Авторское свидетельство СССР № 1100309, МПК C12N 9/22, опубл. 30.06.1984 г.].

Известен штамм бактерий Bacillus intermedius 7p-продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы [Авторское свидетельство СССР № 587156, МПК C12K 1/00, опубл. 05.01.1978 г.]. Активность фермента РНКазы составляет не более 280 ед/мл.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по достигаемому техническому результату является штамм бактерий Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - стрептомицинустойчивый продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью [Патент РФ № 2384619, МПК C12N 9/22, опубл. 20.03.2010 г.].

Однако вышеприведенные аналоги имеют недостаточную ферментативную активность РНКазы, а противовирусная активность указанного фермента продекларирована, но не подтверждена экспериментально на конкретных вирусных агентах.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового продуцента - штамма бактерий, обладающего более высокой продукцией щелочной рибонуклеазы и противовирусной активностью.

Указанный технический результат достигается получением штамма бактерий Aeromonas bestiarum BP-1010, являющегося продуцентом щелочной рибонуклеазы, обладающего противовирусной активностью и депонированного в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270.

Заявляемый бактериальный штамм был получен из донных осадков озера Байкал при высеве образца на полную агаризованную среду со значением pH 7,2 и температуре инкубирования 28-30°C. Для выделения бактерий-продуцентов нуклеолитических ферментов была применена методика отбора колоний на селективных средах и метод электрофореза в агарозном геле. Использовали среду, содержащую нуклеиновые кислоты [Герхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии - М.: Мир, 1984. - Т.3. - 264 с.]. Из большого разнообразия штаммов было выделено несколько штаммов для последующего анализа на содержание ферментов нуклеолитического типа.

При лабораторной проверке выделенных штаммов оказалось, что наиболее высокой активностью щелочной рибонуклеазы в одинаковых условиях обладает штамм Bp-1010 (табл.1).

Таблица 1.
Данные анализа по РНКазной активности КЭ штаммов, выделенных из донных осадков.
образец	штамм	Белок, мг/мл	РНКазная активность, ед/мл
11-11	Bp 470	3,8	261,8
11-13	Bp 868	3,6	332.2
11-14	Bp 878	9,1	436,7
11-16	Bp 1010	6,5	721,0
11-17	Bp 856	5,8	134,2
11-20	Bp 882	3,3	200,0

Заявляемый штамм бактерий Aeromonas bestiarum Bp-1010 имеет следующие признаки.

Морфологические и физиологические признаки штамма

Клетки штамма представляют собой грамотрицательные, неспороносные, подвижные палочки, расположенные по 1-2, размером 0,5-0,6×0,8-3,5 мкм. На плотной среде рыбный питательный агар (РПА, Оболенск, Россия) штамм формирует округлые, гладкие, однородные, блестящие, прозрачные, бежеватые колонии с ровным краем. Штамм является факультативным анаэробом с диапазоном роста при температуре 10-41°C и оптимумом роста при температуре 30-37°C. Штамм способен к росту при значениях pH питательной среды от 5,5 и до 9,0, оптимальным является pH среды 7,0-7,2.

Биохимические признаки штамма Bp-1010. Штамм усваивает глюкозу, мальтозу, глицерин с образованием кислоты и газа, не гидролизует ксилозу, маннит, лактозу и сахарозу. Растет на минимальной среде с добавлением аспарагина, аргинина или глютаминовой кислоты в качестве источника углерода. Не растет при концентрации 7,5% NaCl в жидкой среде LB ("Difco", США). Реакция Фогес-Проскауера на индол, сероводород, оксидазу, каталазу и утилизацию цитрата положительная. Нитраты восстанавливает, пигменты не образует. Показано наличие липазной и слабой фосфатазной активности. Используя морфологические и биохимические свойства, а также данные, полученные по анализу 16S рибосомальной РНК, штамм был отнесен к роду Aeromonas виду bestiarum и назван Aeromonas bestiarum Bp-1010.

Устойчивость к антибиотикам Штамм Aeromonas bestiarum Bp-1010 содержит плазмидную ДНК; устойчив к ампициллину, клиндамицину, карбенициллину, чувствителен к левомицетину, канамицину, рифампицину. При культивировании применяли питательную среду "S" следующего состава в г/л: (Пептон Difco - 16,0; NaCl - 5,0; MgCl ₂ - 0,1-, Трис - 6,05; pH 8.0) или "Lb" Difco (дрожжевой экстракт - 10,0; пептон - 5,0; NaCl - 5,0; pH 7,2).

Хранение штамма

Субкультуры штамма хранят периодическими пересевами на агаризованную среду РПА, в 15%-ном растворе глицерина при низкотемпературном замораживании при минус 65°C и в лиофильно высушенном состоянии. Штамм Aeromonas bestiarum Bp-1010 депонирован в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр биотехнологии и вирусологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под коллекционным номером B-1270. Справка о депонировании штамма прилагается.

Для получения образцов культуральной жидкости (КЖ) штаммы культивировали в среде "S" или "Lb" в течение 18 час при 37°C с последующим центрифугированием 20 мин при 8000 об/мин. Полученные образцы КЖ и биомассы хранили в замороженном состоянии при - 20°C.

Скрининг штаммов на наличие неспецифических нуклеаз (H). Для определения наличия H биомассу отдельных колоний вносили в 150-200 мкл дистиллированной воды или TEN буфера (0.1 M Трис, pH 7.5, 0.01 M ЕДТА, 0.05 M NaCl). Бактериальные клетки лизировали лизоцимом (0,5 мг/мл) с добавлением тритона X-100 (0,1%). Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге Eppendorf, а клеточные экстракты (КЭ) использовали для определения нуклеазной активности. Аликвоты КЭ в количестве 1-2 мкл вносили в реакционную смесь, содержащую 1 мкг субстратной ДНК (ДНК фага , T7 или другой). Все субстраты производства фирмы СибЭнзим (Новосибирск). Анализ нуклеазной активности проводили при температуре 37°C в буфере W, [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - 480 с.]. Продукты реакции подвергали электрофорезу в 0.8-1.0%-ном агарозном геле ("Sigma", США). О наличии эндонуклеаз в штаммах микроорганизмов и их активности судили по исчезновению субстратной ДНК на картине электрофореграммы в УФ-свете по отношению к контролю. (Фиг.1, 2).

Для количественного определения ферментативной активности использовали метод превращения субстратных нуклеиновых кислот (дрожжевой РНК или ДНК из молок лосося) во фрагменты, которые растворимы в 4%-ной HClO₄, с появлением кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм. Удельную активность измеряли в ед./ мг белка [Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Капранова М.Н., Голубенке И.А. Методы определения активности нуклеаз и родственных ферментов. // Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов - 1980, - С.53-60].

Анализ культуральной жидкости (КЖ) на содержание внеклеточных нуклеаз. Бактериальные клетки выращивали в колбах на среде "Lb" или "S" в объеме среды 50-200 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 18-20 часов. Температура культивирования 30-37°C. После выращивания бактериальных штаммов в жидкой питательной среде КЖ собирали центрифугированием на центрифуге J2-21 Beckman (США) и замораживали.

Анализ биомассы на содержание Н. Для получения клеточных экстрактов (КЭ) бактериальные клетки в количестве 0,5-1,0 г подвергали разрушению в 4,0 мл дистилированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C, контролируя на спектрофотометре падение величины D₅₅₀ до уменьшения оптической плотности суспензии на 80-90% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Супернатант замораживали. Далее проводили анализ.

Таблица 2.
Анализ отдельных клонов штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010, полученных с "LA" и селективной среды.
№ образца	Штамм (клон)	Вид образца	Белок, мг/мл	РНКазная активность, ед/мл	Удельная активность ед/мг белка	Гидролиз ДНК фага T7, лямбда.
12-137	Bp-1010 с "LA"	КЭ	8,0	545,6	68,2	±
12-139	Bp-1010 с сел. среды	КЭ	10,3	671,0	67,1	±
12-141	Bp-1010 с "LA"	КЭ	7,5	421,3	56,2	±
12-143	Bp-1010 с сел. среды	КЭ	5,4	732,6	132,6	±
12-145	Bp-1010 с "LA"	КЭ	5,8	479,6	82,7	±
12-147	Bp-1010 с сел. среды	КЭ	8,2	572,0	69.8	±
Примечание: обозначения: КЭ-клеточный экстракт, (±) - частичное разрушение ДНК T7 или лямбда.

В таблице 2 приведены данные по клонированию штамма с целью получения наиболее активных клонов. Методом рассева из микробной популяции был отобран клон по признаку максимальной РНКазной активности (12-143). При выращивании отобранного клона на среде "Lb" в течение 20 ч на качалке при 30°C активность его достигала 732,6 ед/мл. Максимальная РНКазная активность штамма в этих условиях составила 732,6 ед/г влажной биомассы.

Изобретение иллюстрировано следующими графическими материалами. На Фиг.1 приведена электрофореграмма, характеризующая сравнительный анализ отдельных клонов Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие нуклеаз. На фиг.2 приведена электрофореграмма, характеризующая степень гидролиза ДНК фага T7 (1-5) и РНК фага MS2 (6-10) нуклеазами образцов КЖ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010. Данное изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Получение образцов КЭ с использованием лизоцима. Клетки штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010 культивировали в 5,0 мл среды Lb pH 7,2 18 ч на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием и замораживали. После разрушения лизоцимом с тритоном X-100 полученный КЭ использовали для анализа на наличие ферментов.

Пример 2. Анализ биомассы (КЭ) на содержание РНКазной активности после разрушения ультразвуком. Клетки штамма (12-139) культивировали в 200 мл "Lb". Для получения клеточных экстрактов биомассу в количестве 0,45 г подвергали разрушению в 8,0 мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C. Падение величины D₅₅₀ составило 90% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Далее проводили анализ КЭ на наличие РНКазной активности. Активность составила 833,8 ед/мл.

Пример 3. То же, что пример 2. Проводили анализ образцов КЖ на наличие РНКазной активности. Активность составила 178,2 ед/мл.

Пример 4. Определение РНКазной активности КЭ при разных pH. Клетки штамма 12-143 культивировали в 50 мл "Lb". Для получения клеточных экстрактов биомассу в количестве 0,40 г подвергали разрушению в 4-х мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5°C. Падение величины D₅₅₀ составило 85% от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин), при 4°C. Образцы КЭ использовали для определения РНКазной активности в реакционной среде при pH 6,0; 7,0 и 8,0. Наибольшая активность получена при pH 8,0. Активность составила 773,3 ед/мл(Табл.3).

Таблица 3.
Определение оптимальной pH для РНКазной активности КЭ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010
№	Образец	рН реакционной смеси	РНКазная активность, ед/мл
1		6,0	325,6
2	12-143	7,0	631,9
3		8,0	773.3

Пример 5. Клетки выращивали в колбах на среде "S" в объеме среды 100 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 20 часов. Температура культивирования 37°C. После выращивания бактериальных штаммов в жидкой питательной среде КЖ собирали центрифугированием и замораживали. Затем проводили анализ, как описано выше. Данные сравнительного анализа КЖ и КЭ представлены в таблице 4.

Таблица 4.
Анализ КЖ и КЭ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие РНКазной активности.
Образец	Штамм Bp 1010	Вид образца	РНКазная активность, Е/мл
12-164	12-143	КЖ	163,9
12-165		КЭ	921,8
12-166	12-139	КЖ	178,2
12-167		КЭ	833,8

Пример 6. Бактериальные клетки выращивали в колбах на среде "Lb" в объеме среды 100 мл на качалке со скоростью перемешивания 150 об/мин. Время культивирования - 20 часов. Температура культивирования 30°C. После выращивания КЖ собирали центрифугированием и замораживали. Далее проводили анализ, как описано выше. Данные сравнительного анализа КЖ и КЭ представлены на фиг.1 и 2.

На фиг.1 приведен сравнительный анализ отдельных клонов Aeromonas bestiarum Bp-1010 на наличие нуклеаз: КЖ (1-6) и КЭ (8-13) соответственно; 7, 14 - контроль ДНК T7/W. Разведение КЖ и КЭ 1:10; лизис в 0,01 M трис-буфере pH 7,5 лизоцимом + тритон X-100. Время инкубации 30 мин.

На фиг.2. Представлена степень гидролиза ДНК фага T7 (1-5) и РНК фага MS2 (6-10) нуклеазами образцов КЖ штамма Aeromonas bestiarum Bp-1010. Разведение КЖ 1:10 дистилированной водой.

Таблица 5.
Сравнительные данные по РНКазной и ДНКазной активности штамма Aeromonas bestiarum BP-1010
Обра- зец	штамм	ДНКазная активность, Е/мл	Удельная активность, Е/мг белка	РНКазная активность, Е/мл	Удельная активность, Е/мг белка
КЭ	Bp 1010	53,9	8,3	721,6	111,0

Сравнительные данные по РНКазной и ДНКазной активности штамма Aeromonas bestiarum BP-1010 представлены в таблице 5. Штамм обладает низкой ДНКазной активностью.

Определение противовирусной активности

Приготовление препаратов на основе водорастворимых метаболитов. Для приготовления препаратов использовали бактериальные клетки, наработанные в среде LB. Культуральную жидкость (КЖ) центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Осадки клеток использовали для приготовления экстрактов с помощью ультразвуковой дезинтеграции (УЗ). Далее надосадочную жидкость и клеточные экстракты стерилизовали ультрафильтрацией и использовали для приготовления препаратов.

Культуры клеток. Для тестирования цитотоксичности и противовирусной активности препарата использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл/лунку суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°C, 5% СО₂ и 100% влажности на 1-2 сут до образования сплошного клеточного монослоя.

Вирус. В работе использовали штаммы вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанные в отделе профилактики и лечения ООИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Наработку производили на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).

Определение противовирусного действия препаратов

Исследование противовирусной активности образцов проводили по профилактической схеме: сначала на культуру клеток вносится образец и затем вирус.

Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СНУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха.

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640, фирмы ООО «Биолот», С-Петербург, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK (Sigma, США).

2. Контроль репродукции вирусов гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в разведениях с 1 до 8 с десятикратным шагом без внесения препаратов, но с предварительным внесением питательной среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK, в объеме 50 мкл/лунку.

3. Контроль цитотоксичности препаратов в выбранных дозах.

Пример 7. Исследование противовирусной активности проводили на образце 11-16 заявляемого штамма (табл.1). Для изучения противовирусной активности штамма клетки выращивали в 100 мл "Lb" 24 ч при температуре 36°C. КЖ слили, а биомассу (0,4 г) заморозили и хранили при температуре -20ºC. Через 24 ч клетки разморозили и разрушили ультразвуком на дезинтеграторе MSE (Англия) в 4 мл дистиллированной воды для получения КЭ, который использовали для изучения противовирусной активности на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro относительно вируса гриппа птиц A/H5NI, титр которого составил 2,5 lg. (профилактическая схема). Данные представлены в таблице 6.

Пример 8. Изучение противовирусной активности проводили на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro, как в примере 7, но образец использовали для изучения противовирусного действия на вирусе гриппа человека А/Аичи/2/68 (H3N2). Данные представлены в таблице 7.

Таблица 6.
Изучение противовирусной активности штаммов на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro относительно вируса гриппа птиц A/H5NI в -1 разведении
Образец	Штамм	Исходная концентрация препарата			Разведение препарата 1:2
		1	2	3	1	2	3
11-16	Bp-1010	-	-	-	-	-	-
11-16	Bp-1010	-	-	-	-	-	-
Среда "Lb"	-	+	+	+	+	+	+
Среда "S"	-	+	+	+	+	+	+
Контроль	-	+	+	+	+	+	+
Примечание: (-) - отсутствие вируса (наличие эффекта), (+) - наличие вируса (отсутствие эффекта).

Из таблиц 6 и 7 видно, что КЭ штамма, содержащий фермент РНКазу, нейтрализует вирусы гриппа птиц A/H5NI и человека А/Аичи/2/68 (H3N2) в профилактической схеме анализа на 100%.

Таблица 7.
Изучение противовирусной активности штаммов на перевиваемой клеточной культуре MDCK in vitro с использованием вируса гриппа человека А/Аичи/2/68 (H3N2) в -1 разведении
№ образца	Штамм	Титр вируса А/Аичи/2/68 (H3N2) (lg ТЦД50/МЛ)	Индекс нейтрализации (lg ТЦД50)
11-16	Bp 1010	0	2,5
11-16	Bp 1010	0	2,5
Контроль		2,5 lg	-
Примечание: Индекс нейтрализации составил 2.5 lg.

Таким образом, из выше приведенного описания заявки видно достижение технического результата - получение нового штамма бактерий Aeromonas bestiarum BP-1010, обладающего более высокой продукцией щелочной рибонуклеазы (согласно табл.4 - 921,8 Е/мл) и активностью против. вирусов гриппа птиц A/H5NI и человека А/Аичи/2/68 (H3N2).