способ оценки токсичности компонентов среды азовского и черного морей

Формула изобретения

Способ оценки токсичности компонентов среды Азовского и Черного морей включающий помещение флуоресцирующих тест-объектов в контрольные и анализируемые пробы, облучение возбуждающим светом, определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой среды, отличающийся тем, что в качестве тест-объектов используют микроводоросли вида Scenedesmus apiculatus, которые предварительно выделяют из экологически чистых районов исследуемых водоемов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экологии и токсикологии и может быть использовано для оценки токсичности воды и донных отложений Азовского и Черного морей как в условиях хозяйственной деятельности, так и в аварийных ситуациях.

Известно, что при действии различных экологических факторов и антропогенных загрязнений на водные экосистемы в первую очередь изменяется фотосинтетическая активность клеток фотосинтезирующих организмов. Эти изменения в дальнейшем приводят к изменениям во всех остальных звеньях экосистемы.

Для оценки токсичности вод Азово-Черноморского бассейна используются штамм люминесцирующих бактерий Ph. phosphoreum (Cohn) Ford (И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып. 64) (1), бактериальный тест «Эколюм», разработанный в России (ТУ 6-09-20-236-93, МГУ, Москва) (2), штаммы бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (Патент на изобретение РФ № 2346035. МКИ C12N 1/20 2007) (3) и Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 (Патент на изобретение РФ № 2342434 МКИ C12N 1/20) (4). Эти штаммы выделены из воды Черного моря. Биотестирование основано на чувствительности биолюминесцентных бактерий к действию токсикантов, присутствующих в воде и донных отложениях морских водоемов. В известных способах оценка токсичности основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Однако содержание бактериальных культур требовательно к условиям культивирования, необходимо их частое пересевание, что приводит к большим затратам труда и средств. Кроме того, известны случаи утраты штаммом биолюминесцентной активности (свойств) в процессе хранения.

Для контроля морских вод Азово-Черноморского бассейна, кроме бактериальных клеток, можно использовать другие организмы, например клетки водорослей. Водоросли, как и все автотрофы, играют жизненно важную роль в пищевой сети экосистемы. Нарушение токсинами их физиологической активности, равно как и самой структуры альгоценоза, имеют серьезные последствия для экосистем. Методы исследования фитопланктона, основанные на измерении флуоресценции, в настоящее время находят широкое применение как в лабораторных условиях на экспериментальных культурах водорослей, так на водоемах, в полевых условиях. Измеряя флуоресценцию фитопланктона, можно рассчитать концентрацию хлорофилла у микроводорослей (Гольд В.М., Гаевский Н.А., Шатров И.Ю., Попельницкий В.А., Рубцов С.А. Опыт использования флуоресценции для дифференциальной оценки содержания хлорофилла а у планктонных водорослей// Гидробиол. журн. 1986. Т. 22, № 3) (5).

Известен способ определения токсичности воды (АС СССР № 1405745 МКИ А01K 61/00, G01N 33/18) (6), в котором контролируют изменение интенсивности выхода пигментов в среду под действием токсических соединений, где в качестве пигментсодержащего тест-объекта используют морские красные водоросли рода Callithamnion. Стандартными международными методами биотестирования морской воды, разработанными под эгидой ISO (International Standard Organization), являются тест-системы с использованием микроводорослей Phaeodactylum tricornutum и Skeletonema costatum (Water quality - Algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum. Draft International Standard ISO/DIS 10253.2. 1994. 12 p.) (7).

Анализы на микроводорослях дают статистическое преимущество перед многими тест-объектами, так как можно легко использовать большее количество клеток, требуются намного меньшие объемы проб и время тестирования, содержание запасных культур, вследствие их редкого пересевания и низкой требовательности к условиям культивирования, не требует больших затрат труда и средств. Процесс тестирования легко автоматизировать.

Наиболее близким решением является выбранный в качестве прототипа способ оценки токсичности жидкости (авт.свид. СССР № 1515105 МКИ G01N 33/18) (8), предусматривающий культивирование фотосинтетического тест-объекта, возбуждение свечения тест-объекта и определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой жидкости.

При использовании водорослей для оценки токсичности морских вод в различных морях не всегда достигается адаптация тест-объекта к конкретным водам, что снижает достоверность полученных результатов. В частности, при оценке токсичности природных вод, не соответствующих естественному гидрохимическому составу воды, в которой выращивалась культура тест-объекта, реакция этого тест-объекта может расцениваться как токсическое воздействие исследуемой воды. Поэтому поиск тест-объектов в Азовском и Черном морях был направлен на подбор микроводорослей, которые могли бы служить в качестве тест-объекта загрязнителей вод Азовского и Черного морей.

Задача, решаемая изобретением, - расширение числа тест-объектов для оценки токсичности морских вод Азово-Черноморского бассейна, а также повышение достоверности информации при оценке токсичности среды. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем помещение флуоресцирующих тест-объектов в контрольные и анализируемые пробы, облучение возбуждающим светом, определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой среды, согласно изобретению, качестве тест-объектов используют микроводоросли вида Scenedesmus apiculatus, которые предварительно выделяют из экологически чистого района исследуемого водоема.

Использование в качестве тест-объекта микроводоросли Scenedesmus apiculatus расширяет число тест-объектов для оценки токсичности морских вод Азово-Черноморского бассейна и удешевляет тестирование.

При этом использование в качестве тест-объекта аборигенных водорослей Scenedesmus apiculatus, выделенных из экологически чистых районов Азовского и Черного морей как наиболее адаптированных к среде исследуемых водоемов, позволит снизить ошибки и значительно повысить чувствительность флуоресцентного биотестирования.

Совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение поставленной задачи.

Сравнение прототипа с заявляемым решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявляемый способ соответствует критерию "новизны".

Способ осуществляется следующим образом.

Из экологически чистых районов Азовского и Черного морей отбирают пробы воды. Методами многократных разведений и пересевов из отобранных проб выделяют зеленую водоросль вида Scenedesmus apiculatu, которую используют в качестве тест-объекта. Суспензии микроводорослей помещают в контрольные (без токсикантов) пробы и анализируемые пробы. Воздействуют на пробы возбуждающими импульсами света для возбуждения флуоресценции тест-объектов. Определяют флуоресцентные характеристики тест-объектов, по изменению которых судят о токсичности анализируемых проб.

Пример 1. Из экологически чистых районов Азовского и Черного морей в мае-июне 2008 г., т.е. в период активной вегетации основных видов микроводорослей, были отобраны пробы воды. В этот период в Азовском и Черном морях вегетируют водоросли 7 отделов: Cyanophyta, Chrysophyta, Bacillariophyta, Dinophyta, Cryptophyta, Chlorophyta, Euglenophyta. Методами многократных разведений и пересевов из отобранных проб было выделено 5 альгологически и бактериологически чистых культур отдельных видов зеленых и сине-зеленых водорослей. По таксономической принадлежности 3 выделенных штамма относились к сине-зеленым водорослям (Cyanophyta), и 2 штамма - к зеленым водорослям (Chlorophyta). Сине-зеленые водоросли определены как Oscillatoria laetevirens (Crouan) Gom. (=Phormidium laetevirens (Crouan et Gom.) Anagn. et. Kom.), Oscillatoria Agardhii Gom. (=Planktothrix Agardhii (Gom.) Anagn. et. Kom.) и Snowella rosea (Snow) Elenkin; зеленые - как Oocystis borgei Snow и Scenedesmus apiculatus (W. et W.) Chod. Выделенные штаммы водорослей были подготовлены к спектральному анализу. Суспензии микроводорослей поместили в контрольные (без токсикантов) пробы воды. Спектры флуоресценции растворов, содержащих микроводоросли, регистрировали на спектрофлуорофотометре RF-5301PC фирмы Shimadzu (Япония). С помощью программы Panorama fluorescence 1.1 в режиме сканирования (2D synchro measurement) был проведен анализ спектров возбуждения и люминесценции и по результатам их синхронизации для каждого штамма выбраны длины волн с характерными максимумами возбуждения.

На следующем этапе работы определяли чувствительность выделенных культур микроводорослей к действию стандартных токсикантов. Оценку чувствительности проводили по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб. Суспензию микроводорослей вносили в пробы с бихроматом калия K₂Cr₂O₇ (концентрации раствора от 0.001 до 100 мг/л), сульфатом меди CuSO₄ (концентрации от 0.0001 до 100 мг/л) и фенолом (5-1500 мг/л). Время экспозиции составляло от 10 до 30 мин. Отклик микроводорослей на воздействие выбранных токсикантов исследовали, возбуждая свечение в области максимумов, установленных для каждого штамма водоросли. При этом регистрировали спектры флуоресценции, фиксируя изменения интенсивности свечения при установленных максимумах эмиссии.

По результатам исследований чувствительности всех выделенных культур микроводорослей к действию стандартных токсикантов - бихромату калия (K₂Cr₂O₇), сульфату меди (CuSO₄) и фенолу были отобраны наиболее чувствительные (перспективные для биотестирования) виды микроводорослей Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea.

Изменение чувствительности выделенных видов микроводорослей при воздействии стандартных токсикантов и интенсивность флуоресценции (в условных единицах свечения, УЕС) микроводорослей Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea в опыте даны в табл.1, 2, 3.

Таблица 1
Интенсивность флуоресценции микроводорослей Scenedesmus apiculatus ( возб. 220 нм, эмисс. 366 нм) и Snowella rosea ( возб. 340 нм, 440 нм) в опыте с бихроматом калия (УЕС)
Контроль	Концентрация токсиканта K 2Cr2O7 (ПДК 0.05 мг/л) мг/л
	0,001	0,01	0,1	0,5	1,0	5,0	10,0	100,0
Интенсивность флуоресценции Scenedesmus apiculatus, УЕС
24,5	20,9	20,3	19,4	19,5	19,5	17,2	14,4	0,7
Интенсивность флуоресценции Snowella rosea, УЕС
11,3	11,4	11,5	12,5	15,3	18,4	16,5	15,0	2,4

Таблица 2
Интенсивность флуоресценции микроводорослей Scenedesmus apiculatus ( возб. 220 нм, эмисс. 366 нм) и Snowella rosea ( возб. 220 нм и эмисс. 370 нм) в опыте с сульфатом меди (УЕС)
Контроль	Концентрация токсиканта CuSO4 мг/л
	0,0001	0,001	0,01	0,1	1,0	10,0	100,0
Интенсивность флуоресценции Scenedesmus apiculatus, УЕС
24,5	21,8	20,5	19,3	17,5	15,9	12,2	1,2
Интенсивность биолюминесценции Snowella rosea, УЕС
11,3	11,4	11,9	12,8	13,4	14,1	8,5	7,9

Таблица 3
Интенсивность флуоресценции микроводорослей Scenedesmus apiculatus ( возб. 220 нм, эмисс. 366 нм) и Snowella rosea ( возб. 340 нм, эмисс. 440 нм) в опыте с фенолом (УЕС)
Контроль	Концентрация токсиканта фенол мг/л
	5,0	50,0	100,0	300	700	1000	1200	1500
Интенсивность флюресценции Scenedesmus apiculatus, УЕС
24,5	16,7	0,5	0,1	0	0	0	0	0
Интенсивность флуоресценции Snowella rosea, УЕС
11,3	12,9	14,3	15,1	11,0	9,2	7,5	6,7	6,0

Из таблицы 1 видно, что под влиянием K₂Cr₂O₇ (0.01-10 мг/л) (ПДК 0.05 мг/л) интенсивность флуоресценции ( _возб. 220 нм, _эмисс. 366 нм) культуры Scenedesmus apiculatus снижалась максимально до 45-50% от контрольного уровня (в зависимости от времени экспозиции и условий флуориметрии).

Для культуры Snowella rosea в присутствии таких же концентраций K₂Cr₂O₇ установлено максимальное увеличение интенсивности флуоресценции до 60% ( _возб. 340 нм, _эмисс. 440 нм).

Более высокие концентрации K₂Cr₂O₇ (на уровне 50-100 мг/л) на 45-99% подавляли флуоресценцию обеих культур водорослей.

Из таблицы 2 видно, что в растворах CuSO₄ (0.01-10 мг/л) Scenedesmus apiculatus проявлял аналогичную чувствительность, о чем свидетельствовало снижение интенсивности флуоресценции ( _возб. 220 нм, _эмисс.366 нм) максимально на 50% от контрольного уровня. В растворе с концентрацией CuSO₄ 100 мг/л наблюдалось практически полное тушение флуоресценции суспензии Scenedesmus apiculatus.

Под влиянием низких концентраций CuSO₄ (0.0001-1.0 мг/л) спектры флуоресценции Snowella rosea заметно не изменялись. Максимально высокая индукция свечения (до 25% от контроля, _возб. 340 нм, _эмисс. 440 нм) зарегистрирована в растворе CuSO ₄ с концентрацией 1.0 мг/л. Экспозиция водоросли в культуральной среде с CuSO₄ в концентрации 10 и 100 мг/л вызывает тушение свечения на 25 и 30%. Следовательно, чувствительность культуры Snowella rosea к CuSO₄ была приблизительно в 2 раза ниже, чем Scenedesmus apiculatus.

Из таблицы 3 видно, что фенол в концентрации 5 мг/л ингибировал флуоресценцию Scenedesmus apiculatus ( _возб. 220 нм, _эмисс. 366 нм) на 10-55%, а в растворе с содержанием фенола 50 мг/л тушение флуоресценции достигало почти 100%. В то же время, Snowella rosea проявляла низкую чувствительность к фенолу: интенсивность флуоресценции в 1.5 раза ингибировала лишь концентрация фенола 1000 мг/л.

Пример 2. Для сравнительной оценки чувствительности использовали характеристику ЕС₅₀ (effective concentration) - концентрацию вещества, вызывающую 50%-ное снижение биолюминесценции суспензии микроводорослей.

Использование показателя ЕС₅₀ (эффективная концентрация токсиканта, снижающая люминесценцию на 50%) позволило сравнить чувствительность выделенных водорослей Scenedesmus apiculatus и Snowella rosea с чувствительностью биолюминесцентных бактерий Е. coli РТ-5, Ph. phosphoreum (Cohn) Ford и штаммов аборигенных бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 и Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, выделенных из воды Азовского и Черного морей (таблица 4).

Таблица 4
Чувствительность выделенных водорослей и известных штаммов светящихся бактерий к действию различных токсикантов (ингибирование свечения), ЕС50, мг/л
Культуры водорослей и штаммы бактерий, используемые как тест-объекты	EC50, мг/л
	CuSO4	K2Cr2O7	Фенол
Scenedesmus apiculatus	10-40	10-50	5-30
Snowella rosea	20-50	20-50	-
Vibrio fischeri В 95791	1-1.5	10-50	125-150
Vibrio fischeri В 9580 2	2	10-50	125-150
Е.соИСбОО (pPLS-5)3	5-7.5	150	>300
P. phosphoreum (Cohn) Ford4		250	170
ПДКрх (мг/л)	0.005 - в пересчете на Си2+	0.05 - по веществу	0.001
1патент РФ № 2346035, 2007; 2патент РФ № 2342434, 2007; 3патент РФ № 79581,2001; 4Малыгина, Кацев, 2003.

Сравнение чувствительности аборигенных микроводорослей к исследованным токсическим веществам (табл.4) показало в 2 раза более высокую чувствительность микроводоросли Scenedesmus apiculatus по сранению с чувствительностью Snowella rosea. Поэтому для тестирования в качестве тест-объекта была выбрана микроводоросль Scenedesmus apiculatus.

Сравнение чувствительности аборигенной микроводоросли Scenedesmus apiculatus по средним значениям EC₅₀ к исследованным токсическим веществам показало, что Scenedesmus apiculatus более чувствителен, чем штамм Ph. phosphoreum (Cohn) Ford. В частности, в среднем он примерно на порядок более чувствителен к K₂ Cr₂O₇. Так, величина EC₅₀ у микроводоросли Scenedesmus apiculatus по бихромату калия находится в диапазоне концентраций от 10 до 50 мг/л, а для Ph. phosphoreum составляет 250 мг/л.

По фенолу величина EC ₅₀ для микроводоросли Scenedesmus apiculatus составила 5-30 мг/л, что также на порядок ниже, чем EC₅₀ для Ph. phosphoreum.

Сравнение чувствительности микроводоросли Scenedesmus apiculatus к токсическим веществам с чувствительностью lux-штамма E.coli РТ-5 показало аналогичные результаты, за исключением CuSO₄. Микроводоросль Scenedesmus apiculatus более чувствительна к K₂Cr₂O₇, (~ в 5 раз), а также к фенолу (примерно на порядок), но уступает по чувствительности к CuSO₄ (~ в 4 раза).

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования микроводоросли Scenedesmus apiculatus для определения токсичности водных сред.

Пример 3. Проводили проверку чувствительности используемой в качестве тест-объекта водоросли вида Scenedesmus apiculatus, выделенной из воды Черного и Азовского морей. Из экологически чистых районов Азовского и Черного морей были отобраны пробы воды. В них помещали микроводоросли Scenedesmus apiculatus, отобранные из разных морей.

Как показали исследования, культуры Scenedesmus apiculatus из разных морей, помещенные в «родные» и «неродные» среды, отличались интенсивностью флуоресценции ( _возб. 220 нм, _эмисс. 366 нм) в пределах 12-17% в зависимости от условий экспозиции (таблица 5).

Таблица 5
Отклонение от контроля интенсивности флуоресценции Scenedesmus apiculatus ( возб. 220 нм, эмисс. 366 нм) в воде Черного и Азовского морей (время экспозиции - 10 минут), %
№	Вариант воды	Scenedesmus apiculatus (из воды Азовского моря)	Scenedesmus apiculatus (из воды Черного моря)
1	Проба воды Черного моря	-17,15	4,45
2	Проба воды Азовского моря	3,30	-12,45

Таким образом, аборигенные водоросли, помещенные в «неродную» среду, показывали в 2-3 раза большие отклонение уровня флуоресценции от такового у микроводорослей, помещенных в «родную» среду. Такое отклонение может искажать результаты измерения токсичности проб в «неродной» среде, что указывает на необходимость использования аборигенных микроводорослей (как наиболее адаптированных к условиям данного водоема) в практике биотестирования воды и водных экстрактов донных отложений.

Пример 4. Были проведены эксперименты по определению токсичности компонентов среды (вода, донные отложения) Черного моря с использованием аборигенной микроводоросли Scenedesmus apiculatus в качестве тест-объекта. Были исследованы 3 пробы воды и 3 пробы донных отложений, отобранных в районе с высоким антропогенным загрязнением (акватория черноморского порта). Для подготовки экстрактов донных отложений в качестве растворителя использовали чистую морскую воду Черного моря, предварительно профильтрованную через бактериальный фильтр, в весовом соотношении 10:1 с высушенным при комнатной температуре грунтом. Пробы донных отложений встряхивали на орбитальном шейкере при 65 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа и затем отстаивали до оседания взвеси. Отстоявшиеся экстракты фильтровали через сифон (капроновая сеть № 76) и использовали в дальнейших исследованиях токсичности.

Токсичность воды и водных экстрактов донных отложений определяли по изменению интенсивности флуоресценции Scenedesmus apiculatus ( _возб. 220 нм, _эмисс. 366 нм) относительно контроля (чистая морская вода Черного моря). Время экспозиции - 10 мин. При этом отклонение интенсивности свечения в тестируемой пробе относительно контроля (как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения) менее 20% свидетельствует об отсутствии токсичности, от 20 до 30% - о слабой токсичности, от 30 до 50% - умеренной токсичности, свыше 50% - об острой токсичности.

Результаты исследований приведены в таблице 6.

Таблица 6
Результаты биотестирования проб воды и донных отложений из загрязненной акватории Черного моря на культуре аборигенной водоросли Scenedesmus apiculatus (отклонения от контроля интенсивности флуоресценции, %; в знаменателе - индекс токсичности, баллы)
Тестируемые пробы	возб. 220 НМ, эмисс. 366 нм
	Время экспозиции, мин
	10	30
Вода 1
Вода 2
Вода 3
Донные отложения 1
Донные отложения 2
Донные отложения 3

По результатам тестирования, снижение интенсивности флуоресценции относительно контроля в пробах воды № 1, 2 и 3 в зависимости от времени экспозиции, составило, соответственно, -4.27 - -8.85%; -21.77 - -10.67% и -8.52 - -13.42%, что в соответствии с представленной выше шкалой, характеризует пробы воды № 1 и 3 как не токсичные, пробу № 2, в зависимости от условий тестирования - как не токсичную - слабо токсичную.

Интенсивность флуоресценции в экстрактах донных отложений № 1,2 и 3 в зависимости от времени экспозиции снизилась относительно контроля соответственно на -34.49 - -34.86%, -40.95 - -41.92% и -52.09 - - 48.84%. По результатам флуориметрии донные отложения № 1 и 2 оцениваются, таким образом, как умеренно токсичные, проба № 3 - как остро токсичная. Полученные результаты тестирования свидетельствуют об умеренной токсичности проб донных отложений № 1 и 2 и острой токсичности - пробы № 3. В пробе донных отложений № 3, по аналитическим данным, отмечались максимально высокие для исследованной акватории порта содержания нефтепродуктов (32.6 г/кг сухого грунта), АПАВ (91 мг/кг), фенола (4.1 мг/кг) и полициклических ароматических углеводородов (1010 мкг/кг).

Испытание метода биотестирования воды и донных отложений, отобранных в районе с высоким антропогенным загрязнением (морской порт) с использованием Scenedesmus apiculatus в качестве тест-объекта, позволило по изменению интенсивности флуоресценции ( _эмисс. 366 нм) установить токсичность проб воды и донных отложений. При этом значения токсичности для проб воды были ниже, чем для экстрактов донных отложений и в ряде случаев коррелировали с содержанием в пробах поверхностно-активных веществ, нефтепродуктов и фенола.

В целом высокая чувствительность выделенных культур водорослей к испытанным токсикантам и апробация метода биотестирования на основе Scenedesmus apiculatus в акватории Черного моря свидетельствуют о перспективности использования выделенных культур микроводорослей в качестве тест-объектов для определения токсичности компонентов среды морских водоемов в условиях комплексного антропогенного загрязнения.

Разрабатываемый метод биотестирования может применяться как для экспресс-оценки содержания токсических веществ в жидкостях, например, при сбросах в окружающую среду сточных (сбросных) вод, так и для непрерывного контроля токсичности окружающей среды, в том числе при аварийных случаях и неблагоприятных экологических ситуациях.

Заявляемый способ определения токсичности выгодно отличается от подобных систем более высокой чувствительностью к токсикантам (возможна регистрация токсического эффекта токсиканта на уровне его ПДК для воды рыбохозяйственного водоема), экспресс-реакцией (результаты анализа регистрируются в течение часа), безинерционностью (свет, возбуждающий флуоресценцию, мало меняет физиологическое состояние тест-объекта), низкой стоимостью анализа.

Литература

1. И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып. 64.

2. ТУ 6-09-20-236-93

3. Патент на изобретение РФ № 2346035. МКИ C12N 1/20.

4. Патент на изобретение РФ № 2342434 МКИ C12N 1/20.

5. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Шатров И.Ю., Попельницкий В.А., Рубцов С.А. Опыт использования флуоресценции для дифференциальной оценки содержания хлорофилла у планктонных вддорослей//Гидробиол. журн. 1986. Т. 22, № 3.

6. Авторское свидетельство СССР № 1405745, МПК А01K 61/00, G01N 33/18.

7. Water quality - Algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum. Draft International Standard ISO/DIS 10253.2. 1994. 12p.

8. Авторское свидетельство СССР № 1515105 МКИ G01N 33/18 (прототип).