ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека с использованием субстанции, полученной указанным способом

Классы МПК:C07K14/505 эритропоэтин (ЭПО)
C12N15/16 гормоны
B82B1/00 Наноструктуры
A61K9/51 нанокапсулы
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-12-07
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина и ее нанокапсулированной форме, и может быть использовано в медицине. Способ включает последовательное культивирование в ростовой и накопительных средах, где ростовая среда содержит 5,0 мас.% сыворотки крови крупного рогатого скота и питательную среду Игла МЕМ, а накопительная содержит 49,0-80,0 мг/л пролина, 40,0-60,0 мг/л глицина и смесь равных долей сред DMEM и F-12. На основе полученной указанным образом субстанции рекомбинантного эритропоэтина получают ее нанокапсулированную форму. Изобретение позволяет получить субстанцию ЭПО с увеличенной специфической активностью и свободную от посторонних белковых примесей и пригодную для нанокапсулирования, а также упростить технологию ее получения. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 12 пр. способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329

Рисунки к патенту РФ 2518329

способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329 способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329 способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329 способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329 способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329

Изобретение относится к технологии получения субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина и нанокапсулированной его формы и может быть использовано в медицине и биотехнологии.

Эритропоэтин (ЭПО) - гормон, продуцируемый интерстициальными клетками почек и регулирующий эритропоэз у млекопитающих. ЭПО применяется при лечении анемий, возникающих вследствие трансплантации органов и тканей, терапии ВИЧ-инфекции, в пред- и послеоперационном периоде, а также анемий, возникающих при беременности, системных заболеваниях (ревматоидный артрит) и хронической почечной недостаточности (диализные и преддиализные пациенты). Особое место рчЭПО занимает в профилактике и лечении анемий, возникающих в результате интенсивной химио- и радиотерапии опухолевых заболеваний, улучшая качество жизни людей и ее продолжительность. Кроме того, ЭПО улучшает сердечную функцию и может выступать в роли кардио- и нейропротектора при инфарктах миокарда и инсультах.

Размеры нанокапсул обычно не превышают 100 нм, которые обладают высокой проникающей способностью и могут проходить даже в такие «закрытые» зоны организма, как головной мозг. Малый размер делает их невидимыми для клеток иммунной системы, что позволяет нанокапсулам длительное время циркулировать в кровотоке. Использование нанокапсул исключает наработку аутоантител организмом, что повышает безопасность использования лекарственных препаратов.

Известен способ получения инъекционной формы рчЭПО [Патент СССР № 1801118, МПК C12N 15/26, опубл. 07.03.1993 г.]. Способ состоит в том, что осуществляют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например, cos I), выделением и очисткой целевого продукта. Терапевтический эффект рчЭПО для парентерального применения широко известен и описан во многих работах.

Однако известно побочное действие этого препарата, приводящее к различным осложнениям [Синюхин В.Н. и др. Фармакокинетика рекомбинантного человеческого эритропоэтина. Терапевтический архив, 1994, т.66, № 8, с.60-62].

Известен способ получения липосомальной формы ЭПО [Патент РФ № 2218914, МПК А61 9/127, опубл. 20.12.2003] путем разбрызгивания под давлением липидной фазы в спиртовом растворителе в водный буферный раствор, находящийся в высокоскоростном гомогенизаторе. Липидная фаза содержит заряженное липидное соединение и холестерин.

Недостатками этого способа является сложность технологии получения частиц и использование органических растворителей, способных инактивировать ЭПО. Кроме того, заявлена липосомальная форма препарата только для инъекционного применения.

Известен способ получения таблетированной формы рчЭПО для перорального применения [Патент РФ № 2152206, МПК А61К 9/20, опубл. 10.07.2000 г.]. Указанную форму получают путем смешивания ЭПО со стабилизирующими добавками и лиофилизации, лиофильно высушенный ЭПО смешивают с лактозой, стеаратом кальция и ванилином и прессуют в таблетки, которые затем покрывают кислотоустойчивой оболочкой.

Недостатком способа является использование в процессе получения кислотоустойчивой оболочки пожароопасного вещества - ацетона, падение активности рчЭПО в процессе нанесения кислотоустойчивой оболочки, а также возможность разрушения оболочки в процессе хранения и, как следствие, падение активности рчЭПО.

Известен способ получения рчЭПО на основе штамма продуцента СНОрЕ [Патент РФ № 2070931, МПК C12N 15/12, опубл. 27.12.1996 г.]. Штамм СНОрЕ обеспечивает синтез и секрецию в культуральную жидкость рчЭПО с выходом до 4 мг/л при стационарном культивировании на смеси питательных сред Игла MEM (45%) и 199 (45%) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Недостатком этого способа является использование сыворотки крупного рогатого скота в составе среды культивирования. В процессе получения рчЭПО, собранную ЭПО-содержащую жидкость, необходимо очищать от балластных белков, что значительно усложняет процесс и влияет на конечную цену. Кроме того, сыворотка крупного рогатого скота - дорогостоящий компонент. Еще одним недостатком сыворотки является ее качественная изменчивость от партии к партии, возможность контаминации вирусами, прионами, микоплазмами, что также влияет на качество и количество целевого продукта.

Наиболее близким способом получения субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина является способ получения рчЭПО [Патент РФ № 2125093, МПК С12Р 21/02, опубл. 20.01.2012 г.], включающий получение субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека путем культивирования штамма клеток СНО-ЭПО-SPM в ростовой питательной среде, содержащей в 1 л смесь равных долей сред RPMI-1640 и DMEM, 200 мг глутамина, 0,04 мг гентамицина и 80-120 мл сыворотки крови плодов коровы, а затем в накопительной среде, содержащей в 1 л глутамина 200 мг, Hepes 3,75 г, 10 мл Fetalclone II и смесь равных долей сред RPMI-1640 и DMEM с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии.

Недостатком данного способа является использование в составе ростовой питательной среды дорогостоящей сыворотки крови плодов коровы, а также использование в составе накопительной питательной среды Fetalclone II. Fetalclone II создан на основе сыворотки крупного рогатого скота путем удаления из нее иммуноглобулинов и других нежелательных компонентов, а также добавления химически очищенных витаминов, аминокислот микроэлементов и других низкомолекулярных факторов. Стоимость Fetalclone II превышает стоимость сыворотки в 1,5-2 раза и к тому же при получении целевого продукта собранную ЭПО-содержащую жидкость необходимо очищать от посторонних белков, что значительно усложняет получение целевого продукта и влияет на конечную цену. Кроме того, при недостаточной очистке субстанции ЭПО от посторонних белков и использовании ее для нанокапсулирования, часть нанокапсул будет содержать в ядре только посторонние молекулы белков, которые не будут обладать активностью эритропоэтина.

Наиболее близким аналогом нанокасулированной формы эритропоэтина является микрокапсулированная (в виде микросфер) форма эритропоэтина (патент Китая № CN 102233129, МПК А61К 9/16, опубл. 09.11.2011 г.), включающая эритропоэтин, как активный компонент, декстран - защитный (стабилизирующий) агент для активного компонента, и производная полигликолиевой или молочной кислоты или поликапролактон, являющийся материалом оболочки микрокапсул (компонент покрытия). В экспериментах на животных показана пролонгированность действия эритропоэтина.

Однако заявленная микрокапсулированная форма эритропоэтина имеет сложную технологию получения микрокапсул. Кроме того, размер частиц микрокапсул составляет 5-10 микрон, а технология получения микрокапсул и компонентный состав препарата не позволяют изготавливать указанные микрокапсулы меньшего размера, что может вызвать наработку антител к эритропоэтину организмом, что приведет к усилению анемии.

Нанокапсулы обладают высокой проникающей способностью и могут проходить даже в такие «закрытые» зоны организма, как головной мозг. Малый размер делает их невидимыми для клеток иммунной системы, что позволяет нанокапсулам длительное время циркулировать в кровотоке.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение технологии получения субстанции ЭПО, свободной от посторонних белковых примесей и пригодной для нанокапсулирования, а также упрощения технологии получения нанокапсулированной формы с размером частиц от 15 до 500 нм.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, включающем культивирование в роллерных флаконах штамма клеток яичника китайского хомячка, трансформированного предварительным введением плазмиды, содержащей ген человеческого эритропоэтина, последовательно в ростовой и в накопительной питательных средах с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии, согласно изобретения в качестве ростовой питательной среды используют ростовую среду, содержащую, масс.%:

сыворотка крови крупного рогатого скота 5,0
питательная среда Игла MEMостальное до 100%,

а в качестве накопительной питательной среды используют бессывороточную среду, содержащую следующие ингредиенты в 1 л:

пролин, мг/л49-80
глицин, мг/л 40-60
смесь равных долей сред DMEM и F-12до 1 л,

а целевой продукт - субстанция рекомбинантного эритропоэтина человека имеет активность от 1000 до 10000 МЕ/мл.

В качестве культивируемого штамма используют рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомяка № ВСКК (П) N 626Д.

Полные прописи питательных сред Игла MEM, DMEM, RPMI-1640, и F-12 приведены в книге: «Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988. - 313 с.».

Указанный технический результат достигается также нанокапсулированной формой рекомбинантного эритропоэтина человека, включающей полиэлектролит, в качестве которого выбран альгинат натрия, или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол, стабилизатор - сахарозу, отвердитель - желатозу, жидкую субстанцию рекомбинантного эритропоэтина человека (ЭПО) и мочевину при следующем исходном составе компонентов до нанокапсулирования, масс.%: сахароза 2,5-6,0; желатоза 2,5-5,5; мочевина 0,1-3,0; альгинат натрия или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол 0,001-1,0 и жидкая субстанция ЭПО с концентрацией эритропоэтина 1000-10000 МЕ/мл, полученная по п.1 формулы изобретения - остальное до 100%.

Следует отметить, что все соотношения между исходными компонентами полимеров выбраны, исходя из оптимального выхода коацервата с размером частиц в диапазоне 15-500 нм.

Мочевина в концентрации 0,1-3,0 масс.% способствует дезагрегации ЭПО в процессе образования нанокапсул, вследствие чего нанокапсулы формируются более однородными и с более равномерным количеством молекул рчЭПО в них.

Ниже приведена характеристика полимеров (полиэлектролитов), используемых для получения нанокапсулированной формы эритропоэтина:

- альгинат натрия фармакопейного качества производства фирмы Pronova Biomedical (Норвегия),

- карбопол 934 (карбомер) - высокомолекулярный полимер акриловой кислоты, поперечно сшитый полиалкильными эфирами сахаров и полиспиртов, является слабой кислотой, выпускается фирмой Sigma (США),

- коллидон 90F (повидон, поливинилпирролидон) - растворимый поливинилпирролидон, образует комплексные химические соединения с фармацевтическими субстанциями, выпускается фирмой BASF AG,

- пектин AU 701, AU 202 фирмы Sigma (США) - очищенный полисахарид, образованный остатками галактуроновой кислоты, получаемый экстракцией цитрусового, свекловичного или яблочного жома,

- хитозан (PROTASAN) фармакопейного качества производства фирмы Pronova Biomedical (Норвегия).

Создание нанокапсулированной формы рчЭПО для перорального применения позволяет исключить возможность заражения пациентов вирусами гепатитов, ВИЧ и др. инфекций, что возможно при парентеральном способе введения. Специально подобранный состав стабилизаторов, полимеров и наполнителей позволяет исключить побочные эффекты, вызываемые добавками, и исключить наработку аутоантител в макроорганизме.

Предложенные способ получения субстанции рчЭПО и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека не известны из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

На фиг.1 приведена атомно-силовая микроскопия препарата не капсулированного рчЭПО, pH 2, размер поля 10×10 мкм. На фиг.2 приведена атомно-силовая микроскопия препарата рчЭПО с полиэлектролитом Carbopol 934, pH 2, размер поля 50×50 мкм. На фиг.3 приведена атомно-силовая микроскопия препарата рчЭПО с полиэлектролитом Carbopol 934, pH 5, размер поля 50×50 мкм. На фиг.4 приведена атомно-силовая микроскопия препарата рчЭПО с полиэлектролитом Kollidon 90F pH 2, размер поля 50×50 мкм. На фиг.5 приведена атомно-силовая микроскопия препарата рчЭПО с альгинатом натрия pH 5, размер поля 50×50 мкм.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения нанокапсулированной формы рчЭПО.

Пример 1. Способ получения жидкой субстанции рчЭПО

Клетки СНОрЕ - продуцент ЭПО культивируют в ростовой питательной среде, состоящей из 95% питательной среды Игла MEM и 5% сыворотки крови крупного рогатого скота. Клетки высевают в роллерные бутыли, которые помещают в роллерную установку и вращают со скоростью 1,5 об/мин. Посевная концентрация составляет (1,5-2,0)×10 6 клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3-1:4, частота пассирования 3-4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяют 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена в соотношении 1:2. Культуры клеток инкубируют при температуре 37°C в течение 2-х суток до получения клеточного монослоя. После образования монослоя его освобождают от балластных белков, отмывая раствором Хенкса, и заливают накопительной средой. В качестве накопительной среды используют бессывороточную среду, содержащую в своем составе 50% питательной среды DMEM, 50% питательной среды F-12 и аминокислоты пролин и глицин. Каждые 2-3 суток проводят сбор ЭПО-содержащей жидкости и замену на свежую порцию накопительной среды, цикл накопления повторяют 5-6 раз. ЭПО-содержащую жидкость сливают, полученные сливы объединяют и хранят при температуре 4°C. Затем ЭПО-содержащую жидкость очищают, фильтруя через ацетат-целлюлозные мембраны с размерами пор 0,45 и 0,22 мкм, концентрируют, используя метод ультрафильтрации, определяют специфическую активность ЭПО в полученном концентрате методом ИФА.

В таблице 1 представлены данные специфической активности рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости на различных накопительных средах, полученные методом ИФА. В качестве опытной накопительной среды использована бессывороточная среда, состоящая из 50% питательной среды DMEM, 50% питательной среды F-12 с добавлением 5 мг/л, или 49 мг/л, или 80 мг/л пролина и 10 мг/л, или 40 мг/л, или 60 мг/л глицина. Контрольная накопительная среда содержит в своем составе 98% питательной среды Игла MEM и 2% Fetalclone II.

Таким образом, в предложенном способе получения субстанции рчЭПО экспериментально установлена возможность использования в ростовой питательной среде сыворотка крови крупного рогатого скота в количестве 5,0 масс.%, что позволяет снизить количество балластных белков, за счет чего упрощается процесс удаления последних.

Кроме того, использование бессывороточной питательной среды в составе накопительной среды с добавлением от 49 мг/л до 80 мг/л пролина и от 40 мг/л до 60 мг/л глицина, значительно увеличивает продукцию рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости.

Таблица 1
Специфическая активность рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости на различных накопительных средах
№ п/пКонтроль, МЕ/мл Опыт, МЕ/мл (5 мг/л пролина и 10 мг/л глицина) Опыт, МЕ/мл (49 мг/л пролина и 40 мг/л глицина) Опыт, МЕ/мл (80 мг/л пролина и 60 мг/л глицина)
1439,14 933,50981,901370,50
2443,35 1259,241274,15 1426,10
3 510,82921,28 933,501297,17
4658,35910,87 1345,551477,69
5606,90 1002,601212,39 1511,51
6 596,03964,32 1259,241457,31
среднее542,43 998,631167,79 1423,38

Отсутствие сыворотки и ее компонентов при получении рчЭПО значительно упрощает процесс очистки препарата и делает технологию более экономичной.

Пример 2. Исходные компонентные составы 1-5 препарата до нанокапсулирования, масс.%.

Состав 1.

сахароза2,5
желатоза2,5
мочевина0,1
альгинат натрия0,001
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 1000 МЕ/мл остальное до 100%

Состав 2.

сахароза3,0
желатоза3,0
мочевина0,5
хитозан0,01
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 3000 МЕ/мл остальное до 100%

Состав 3.

сахароза3,5
желатоза3,5
мочевина1,0
пектин0,1
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 5000 МЕ/мл остальное до 100%

Состав 4.

сахароза5,0
желатоза4,5
мочевина2,0
коллидон1,0
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 8000 МЕ/мл остальное до 100%

Состав 5.

сахароза6,0
желатоза5,5
Мочевина3,0
Карбопол0,005
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 10000 МЕ/мл остальное до 100%

Пример 3. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе альгината натрия во флаконах (состав 1).

Стерильную ЭПО-содержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 1000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 10%-ной мочевины до 0,1% (по массе), 2%-ного альгината натрия до конечной концентрации 0,001%, 50%-ной сахарозы до 2,5% (по массе) и 25%-ной желатозы до 2,5% (по массе).

Полученную смесь разливают во флаконы по 0,5-2 мл и замораживают при температуре минус (50-60)°С в течение 18 часов. Нанокапсулы получают в результате коацервации заряженного полиэлектролита и отвердителя с образованием комплекса путем замораживания раствора со скоростью (0,1-3,0)°С в минуту до температуры, ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда.

При коацервации водорастворимого полимера, способного диссоциировать на ионы при pH, близких к физиологической, обеспечивается сохранность рчЭПО в процессе получения нанокапсул. Коацервация обусловлена понижением растворимости полимера при понижении температуры и первичной кристаллизации льда, вследствие чего концентрация полимера в маточном растворе (жидкой фазе, оставшейся после первичной кристаллизации льда) увеличивается. Полученный коацерват вместе с равновесной жидкостью подвергается дальнейшему замораживанию и лиофильному высушиванию. Концентрирование (понижение растворимости) полимера проводится за счет первичной кристаллизации льда, что не вызывает инактивации белкового препарата или его существенного разбавления (не более 1-50%). Весь процесс нанокапсулирования заключается в сведении растворов полимеров с ЭПО-содержащей жидкостью (гормон-содержащая жидкость, стабилизированная частично гидролизованным желатином - желатозой и сахарозой), замораживании полученного раствора с определенной скоростью и лиофилизации. Мочевина способствует дезагрегации ЭПО в процессе образования микрокапсул, вследствие чего нанокапсулы формируются более однородными и более равномерном количеством ЭПО в них.

Необратимость процесса коацервации обусловлена взаимодействием между положительными и отрицательными зарядами различных молекул реакционной смеси и, возможно, усилением воздействия между ними, происходящем при кристаллизации льда.

Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки флаконы заполняют инертным газом (аргоном), укупоривают резиновыми крышками, завальцовывают колпачками. ЭПО в сухом виде при хранении в течение года при температуре (2-8)°С не теряет свою активность.

Пример 4. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе хитозана в таблетках (состав 2).

Стерильную ЭПО-содержащую жидкость жидкость получают как в примере 1.

К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 3000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50%-ной сахарозы до 3% (по массе), 25%-ной желатозы до 3% (по массе), 10% мочевины до 0,5% (по массе) и хитозана до конечной концентрации 0,01%. Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50-60)°С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО смешивают с лактозой (до 25-37% по массе), добавляют стеарат кальция до 2%, из полученной массы прессуют таблетки двояковыпуклой формы. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8)°С не теряет свою активность.

Пример 5. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе пектина во флаконах (состав 3)

Стерильную ЭПО-содержащую жидкость получают как в примере 1.

К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 5000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50%-ной сахарозы до 3,5% (по массе), 25%-ной желатозы до 3,5% (по массе), 10% мочевины до 1% (по массе) и 2%-ного пектина до конечной концентрации 0,1%. Полученную субстанцию рчЭПО разливают во флаконы по 0,5-2 мл и замораживают при температуре минус (50-60)°С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки флаконы заполняют инертным газом (аргоном), укупоривают резиновыми крышками, завальцовывают колпачками. ЭПО в сухом виде при хранении в течение года при температуре (2-8)°С не теряет свою активность.

Пример 6. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе коллидона в желатиновых капсулах (состав 4).

Стерильную ЭПО-содержащую жидкость жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 8000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50%-ной сахарозы до 5% (по массе), 25%-ной желатозы до 4,5% (по массе), 10% мочевины до 2% (по массе) и коллидона до конечной концентрации 1,0%. Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50-60)°С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО фасуют в желатиновые капсулы в дозе 1 000-10000 ME. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8)°С не теряет свою активность.

Пример 7. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе сополимера карбопола в таблетках (состав 5).

Стерильную ЭПО-содержащую жидкость жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 10000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50%-ной сахарозы до 6% (по массе), 25%-ной желатозы до 5,5% (по массе), 10% мочевины до 3% (по массе) и 0,3%-ный водный раствор карбопола до конечной концентрации 0,005%. Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50-60)°С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО смешивают с лактозой (до 25-37% по массе), добавляют стеарат кальция до 2%, из полученной массы прессуют таблетки двояковыпуклой формы. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8)°С не теряет свою активность.

Пример 8. Определение специфической активности нанокапсулированной формы рчЭПО in vitro. Специфическую активность рчЭПО в нанокапсулированных препаратах определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода ИФА лежит твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноанализа, основанный на принципе «сэндвича». В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные стрипированные планшеты с иммобилизованными на их поверхности моноклональными антителами (МКАТ) к ЭПО. Анализ проводят в две стадии. На первой стадии калибровочные образцы с известной концентрацией, стандартный образец рчЭПО (соЭПО) и исследуемые образцы рчЭПО, восстановленные в фосфатно-солевом буфере, наносят на планшет. Планшет помещают в термошейкер и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и 700 об/мин. В ходе инкубации иммуносорбента с анализируемыми образцами происходит образование иммунных комплексов «МКАТ-ЭПО». На второй стадии, после удаления несвязавшегося материала, следует инкубация полученных комплексов с мечеными пероксидазой хрена МКАТ к ЭПО (конъюгатом) в течение 1 часа при 37°С и 700 об/мин. В результате на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам «МКАТ-ЭПО» антител, меченых пероксидазой хрена. После удаления избытка конъюгата образовавшиеся иммунные комплексы «иммобилизованные МКАТ-ЭПО-конъюгат» выявляют цветной реакцией фермента с раствором перекиси водорода и тетраметилбензидина. Реакцию останавливают через 30 минут добавлением раствора серной кислоты. Результаты анализа регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в лунках в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации ЭПО в анализируемом образце. По результатам измерения строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации ЭПО в калибровочных образцах. Содержание ЭПО в анализируемых пробах определяют по калибровочному графику.

Активность рчЭПО в образцах составляет 1000-10000 ME, считая на одну дозу препарата без потери активности (составы 1-5).

Пример 9. Определение стабильности нанокапсулированной формы рчЭПО in vitro. Исследование стабильности нанокапсулированных препаратов рчЭПО в условиях желудочно-кишечного тракта проводят в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопеи XI издания [ГФ XI, т.2, М., Медицина, 1989, с.154-160]. Эксперимент состоит из двух этапов. На первом этапе для создания условий прохождения капсулами кислой среды желудка препараты ЭПО выдерживают 1 час в 0,1 N соляной кислоте (pH=2). После чего, имитируя среду кишечника, pH раствора доводят 0,1 N гидроксидом натрия до 7,5-8,0 и выдерживают в течение 30 минут.

Определение содержания ЭПО в препаратах до и после имитации условий желудочно-кишечного тракта проводят методом ИФА (см. пример № 7). Потери при прохождении кислой и щелочной среды составляют 1,2-25,5% в зависимости от полимера, использованного для образования капсул, и его концентрации. Наибольшей устойчивостью обладают препараты ЭПО, содержащие в своем составе альгинат натрия, карбопол 934 и пектин AU202.

Пример 10. Изучение специфической активности нанокапсулированной формы рчЭПО in vivo

Специфическую активность нанокапсулированной формы ЭПО проверяют на белых мышах популяции ICR по изменению содержания ретикулоцитов, предшественников эритроцитов, в периферической крови. Самок мышей разделяют на группы по 6 животных и перорально вводят один из препаратов в дозе 40 МЕ/мышь в сутки в течение 4 дней (суммарная доза на мышь - 160 ME), на 5 день забирают кровь для исследования. В качестве отрицательного контроля используют группу мышей, получавших физиологический раствор, в качестве положительного контроля - мыши, получавшие не капсулированный препарат ЭПО. Пробы крови берут из орбитальной вены и делают мазки на предметном стекле, после чего окрашивают их по методу Паппенгейма-Крюкова. Подсчет количества ретикулоцитов осуществляют под микроскопом, используя иммерсионный объектив. Количество ретикулоцитов обозначают в процентах по отношению к общему числу эритроцитов. Для вычисления этого процента в мазке крови подсчитывают подряд 1000 эритроцитов, отмечая среди них число ретикулоцитов, и найденное количество делили на 10.

Проверка специфической активности нанокапсулированной формы рчЭПО на мышах указывает увеличение содержания ретикулоцитов (на 1000 эритроцитов) в крови животных после перорального введения препаратов: исходное - 4,56%, на 5-й день для не капсулированного препарата ЭПО - 5,34%, а для капсулированных препаратов от 6,19% до 8,78%, в зависимости от полимера и его концентрации.

Пример 11. Исследование нанокапсулированных препаратов рчЭПО методом атомно-силовой микроскопии

Структуру нанокапсулированных препаратов рчЭПО исследуют с помощью силовой атомной микроскопии. Сухой препарат из ампулы растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:100 по массе, после чего 10 мкл этого раствора смешивают с 90 мкл дистиллированной воды (pH=5) или с 90 мкл дистиллированной воды, подкисленной HCl (pH=2). Каплю полученного раствора наносят на чистый свежий скол слюды площадью примерно 25 мм, высушивают при комнатной температуре, после чего снимают поверхность на атомно-силовом микроскопе Solver P47 Bio в полуконтактном режиме.

В препарате некапсулированного рчЭПО как при pH 2 (фиг.1), так и при pH 5 не наблюдается крупных частиц. Средний размер обнаруживаемых структур равен 10-15 нм, что сравнимо с размерами молекулы ЭПО. В препаратах рчЭПО с Carbopol 934 (0,005%) средний размер частиц препарата в кислой среде (pH 2) составляет 20-25 нм (фиг.2). Распределение по размеру было неравномерным, некоторые частицы достигали 70 нм. При снижении кислотности среды (pH 5) препарат образовывает на подложке фрактальные узоры, напоминающие лист папоротника (фиг.3). Средний размер капсул составляет 40-50 нм, более крупные образования достигают 70-80 нм. В препаратах рчЭПО с Kollidon 90F (0,05%) образуются крупные круглые частицы размером порядка 100 нм, выстраивающиеся в цепочки и образующие фрактальные узоры (фиг.4). В препаратах рчЭПО с альгинатом натрия (0,005%) образуются равномерные овальные капсулы со средним размером частиц в кислой среде (pH 2, pH 5) 15-20 нм (фиг.5).

Пример 12. Определение стабильности нанокапсулированной формы рчЭПО методом режимного хранения

Стабильность нанокапсулированных препаратов рчЭПО определяют методом ИФА (см. пример № 7) до и после 1 года хранения при температуре (2-8)°C. Изменение содержания рчЭПО в полимерных капсулах после хранения варьирует в пределах от 0,06% до 10,34% в зависимости от полимера. Поскольку для иммунобиологических препаратов допускается падение активности до 10% можно утверждать, что нанокапсулированные препараты ЭПО стабильны в течение 1 года хранения при температуре плюс (2-8)°C.

Таким образом, из вышеизложенного видно, что в предлагаемом изобретении достигается заявленный технический результат: упрощение технологии получения субстанции ЭПО, свободной от посторонних белковых примесей и пригодной для нанокапсулирования, а также упрощения технологии получения нанокапсулированной формы с размером частиц от 15 до 500 нм.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, включающий культивирование в роллерных флаконах штамма клеток яичника китайского хомячка, трансформированного предварительным введением плазмиды, содержащей ген человеческого эритропоэтина, последовательно в ростовой и в накопительной питательных средах с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии, отличающийся тем, что в качестве ростовой питательной среды используют ростовую среду, содержащую, мас.%:

сыворотка крови крупного рогатого скота 5,0
питательная среда Игла MEMостальное до 100%,


а в качестве накопительной питательной среды используют бессывороточную среду, содержащую следующие ингредиенты в 1 л:

пролин, мг/л49,0-80,0
глицин, мг/л 40,0-60,0
смесь равных долей сред DMEM и F-12до 1 л,


а целевой продукт - субстанция рекомбинантного эритропоэтина человека имеет активность от 1000 до 10000 МЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культивируемого штамма используют рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомяка № ВСКК (П) N 626Д.

3. Нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека, включающая полиэлектролит, в качестве которого выбран альгинат натрия, или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол, стабилизатор - сахарозу, отвердитель - желатозу, жидкую субстанцию рекомбинантного эритропоэтина человека (ЭПО) и мочевину при следующем исходном составе компонентов до нанокапсулирования, мас.%:

сахароза2,5-6,0
желатоза2,5-5,5
мочевина0,1-3,0
альгинат натрия или хитозан, способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
или пектин, или коллидон, или карбопол0,001-1,0
жидкая субстанция ЭПО с концентрациейспособ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
эритропоэтина 1000-10000 МЕ/мл,способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека   и нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека   с использованием субстанции, полученной указанным способом, патент № 2518329
полученная по п.1 формулы изобретенияостальное до 100%.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2518329

patent-2518329.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/505 эритропоэтин (ЭПО)

Патенты РФ в классе C07K14/505:
гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения -  патент 2515914 (20.05.2014)
пептидное производное - миметик эритропоэтина и его фармацевтические соли, их получение и применение -  патент 2493168 (20.09.2013)
очистка пегилированных полипептидов -  патент 2476439 (27.02.2013)
штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) -  патент 2451071 (20.05.2012)
рекомбинантный слитый человеческий белок epo-fc с продленным временем полужизни и повышенной эритропоэтической активностью in vivo (варианты), димерная белковая конструкция, димерный белок, фармацевтическая композиция, последовательность нуклеиновой кислоты (варианты), вектор экспрессии, клетка, способ получения белка и способ стимуляции эритропоэза у млекопитающего -  патент 2433181 (10.11.2011)
эритропоэтин, конъюгированный с полиэтиленгликолем -  патент 2433134 (10.11.2011)
fc-эритропоэтин слитый белок с улучшенной фармакокинетикой -  патент 2370276 (20.10.2009)
полипептиды, обработанные has, особенно эритропоэтин, обработанный has -  патент 2328505 (10.07.2008)
конструкция днк для осуществления гомологичной рекомбинации (варианты), транскрипционная единица (варианты), способ получения гомологично рекомбинированной клетки и способ изменения экспрессии гена-мишени в клетке (варианты) -  патент 2267533 (10.01.2006)
выделенная молекула днк, кодирующая эритропоэтин человека, (варианты), экспрессирующий плазмидный или вирусный днк-вектор, гликопротеид эритропоэтин (варианты) и способ его получения, фармацевтическая композиция (варианты), линия клеток млекопитающего (варианты) -  патент 2261276 (27.09.2005)

Класс C12N15/16 гормоны

Патенты РФ в классе C12N15/16:
антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) -  патент 2514148 (27.04.2014)
способы скрининга с применением g-белок сопряженных рецепторов и родственных композиций -  патент 2506274 (10.02.2014)
варианты эритропоэтина -  патент 2430162 (27.09.2011)
композиции, реагенты, наборы и способы для диагностики, мониторинга и лечения ожирения и/или диабета -  патент 2420583 (10.06.2011)
гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез -  патент 2349601 (20.03.2009)
плазмидная днк pbsh2egf, кодирующая синтез эпидермального фактора роста человека, и способ его получения с помощью данной днк -  патент 2289623 (20.12.2006)
агонисты рецептора-3(r3) пептида-активатора гипофизарной аденилатциклазы(расар) и способы их фармакологического применения -  патент 2269354 (10.02.2006)
рецептор протеина из класса vip3, кодирующая его последовательность днк и способ выявления или выделения гомологов указанного рецептора протеина или кодирующей его последовательности днк -  патент 2222597 (27.01.2004)
последовательность днк, кодирующая препронейропептид y (препроnpy), последовательность рнк, способ обследования субъекта, сигнальный пептид, препроnpy, способ определения пептида, способ диагностирования предрасположенности к повышенному уровню общего холестерина или холестерина ldl -  патент 2219186 (20.12.2003)
одноцепочечный белок, модулятор гормонов лютеинизирующего, фолликулостимулирующего, тиреостимулирующего и хорионического гонадотропина (варианты), молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор (варианты), линия трансформированных клеток сно (варианты), способ продуцирования одноцепочечного белка (варианты) -  патент 2213099 (27.09.2003)

Класс B82B1/00 Наноструктуры

Патенты РФ в классе B82B1/00:
многослойный нетканый материал с полиамидными нановолокнами -  патент 2529829 (27.09.2014)
материал заменителя костной ткани -  патент 2529802 (27.09.2014)
нанокомпозитный материал с сегнетоэлектрическими характеристиками -  патент 2529682 (27.09.2014)
катализатор циклизации нормальных углеводородов и способ его получения (варианты) -  патент 2529680 (27.09.2014)
способ определения направления перемещения движущихся объектов от взаимодействия поверхностно-активного вещества со слоем жидкости над дисперсным материалом -  патент 2529657 (27.09.2014)
способ формирования наноразмерных структур -  патент 2529458 (27.09.2014)
способ бесконтактного определения усиления локального электростатического поля и работы выхода в нано или микроструктурных эмиттерах -  патент 2529452 (27.09.2014)
способ изготовления стекловидной композиции -  патент 2529443 (27.09.2014)
комбинированный регенеративный теплообменник -  патент 2529285 (27.09.2014)
способ изготовления тонкопленочного органического покрытия -  патент 2529216 (27.09.2014)

Класс A61K9/51 нанокапсулы

Патенты РФ в классе A61K9/51:
способ получения магниточувствительного липидного композита -  патент 2502505 (27.12.2013)
вододиспергируемые пероральные, парентеральные и местные композиции для плохо растворимых в воде лекарственных препаратов, включающие улучшающие их свойства полимерные наночастицы -  патент 2492872 (20.09.2013)
никотиновые иммунонанотерапевтические лекарственные средства -  патент 2487712 (20.07.2013)
наночастица, содержащая рапамицин и альбумин, в качестве противоракового агента -  патент 2483714 (10.06.2013)
применение l-карнозина для приготовления нанопрепарата, обладающего антигипоксической и антиоксидантной активностью -  патент 2482867 (27.05.2013)
фармакологическая композиция, предназначенная для интраназального введения с целью доставки в мозг фармакологически активного компонента, и способ ее получения -  патент 2475233 (20.02.2013)
состав активированных наночастиц plga, загруженных активным средством, для целенаправленной нанотерапии рака -  патент 2473331 (27.01.2013)
липосомальная нанокапсула -  патент 2462236 (27.09.2012)
наночастицы, включающие циклодекстрин и биологически активную молекулу, и их применение -  патент 2460518 (10.09.2012)
фармацевтическая композиция пролонгированного действия на основе глицина и способ ее получения -  патент 2457835 (10.08.2012)


Наверх