способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых продуктов

Классы МПК:G01N33/02 пищевых продуктов 
G01N1/18 устройства, обеспечивающие возможность разделения проб на части
C07K7/08 содержащие от 12 до 20 аминокислот
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-12-24
публикация патента:

Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве. Изобретение направлено на ускорение процесса выделения аминокислот из пищевого продукта и повышение точности определения за счет сокращения потерь и применения высокочувствительного материала, что достигается применением способа, предусматривающего кислый гидролиз образца, фильтрацию и хроматографическое разделение гидролизата с последующей автоматической идентификацией и количественной оценкой содержания аминокислот на автоматическом анализаторе. Изобретение позволяет определить аминокислоты в составе белков пищевого продукта при их содержании порядка 0,1-3,5 г/100 г продукта (1,5-17 г/100 г белка) с применением последовательного элюирования аминокислот смесью буферных растворов и одновременным детектированием компонентов при двух длинах волн 440 и 570 нм. 2 табл.

Формула изобретения

Способ определения состава и содержания аминокислот в белках пищевых продуктов, включающий кислотный гидролиз образца, фильтрацию, хроматографическое разделение с последующей идентификацией и количественной оценкой аминокислот, отличающийся тем, что хроматографическое разделение с последующей идентификацией и количественной оценкой аминокислот в концентрации 0,5 мкмоль/мл в растворе смеси первоначально осуществляют в системе буферных растворов переменного состава с повышающейся нормальностью от 0,1 до 0,3 на хроматографической колонке с катионитом с карбоксильными ионогенными группами в Na+-форме в интервале повышающихся температур от 47 до 70°C, затем в буфере с нормальностью 0,1 в интервале понижающихся температур 70-55°C с одновременным детектированием разделенных на выходе аминокислот в виде цветного комплекса с нингидрином при двух длинах волн 440 и 570 нм в автоматическом режиме.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве.

Известны разные методы определения состава аминокислот в белках. Наиболее часто используют метод классической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который дает возможность осуществлять разделение и идентификацию большинства аминокислот в смеси, однако недостаточная специфичность метода не позволяет проводить полное дифференцирование всех 20-ти природных аминокислот, в частности не происходит полное разделение и соответствующая идентификация серина от валина, фенилаланина от пролина и некоторых др. пар аминокислот, имеющих близкую хроматографическую подвижность в условиях ВЭЖХ [Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Коллаген: получение, свойства и применение: монография. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007].

Известен также способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимеров по данным масс-спектрометрического анализа с использованием вычислительной системы [Патент RU № 2408011 C2]. Метод отличается точностью, но является сложным по техническому осуществлению и требует применения дорогостоящего масс-спектрометрического детектирования.

Известен способ идентификации 11-16 аминокислот методом капиллярного электрофореза [Патент RU № 2346931 C1], однако указанный способ не позволяет определять весь спектр природных аминокислот.

Наиболее близким к заявленному является способ разделения основных аминокислот, который заключается в том, что аминокислоты разделяют двумерной тонкослойной хроматографией и последовательным использованием двух новых хроматографических систем растворителей: изопропиловый спирт - ацетон - 24-25% раствор аммиака - вода в соотношении (19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0) (по объему) и хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(1,3-3,5) (по объему). Для детектирования аминокислот используют нингидриновый реактив и дополнительно реактивы Эрлиха или Несслера [Заявка RU № 94028253 A1, кл. G01N 30/02]. Способ является трудоемким и не позволяет осуществлять быструю идентификацию в автоматической режиме.

Технической задачей заявленного изобретения является ускорение процесса выделения аминокислот из пищевого продукта и повышение точности определения за счет сокращения потерь и применения высокочувствительного материала.

Поставленная задача решается в способе, предусматривающем кислый гидролиз образца, фильтрацию и хроматографическое разделение гидролизата с последующей автоматической идентификацией и количественной оценкой содержания аминокислот на автоматическом анализаторе.

Технический результат заключается в определении аминокислот в составе белков пищевого продукта при их содержании порядка 0,1-3,5 г/100 г продукта (1,5-17 г/100 г белка) с применением последовательного элюирования аминокислот смесью буферных растворов и одновременным детектированием компонентов при двух длинах волн 440 и 570 нм.

Заявляемый способ определения осуществляют по следующей методике.

Анализ содержания аминокислот выполняют на аминокислотном анализаторе, в который вводят гидролизат пищевого продукта. Для разделения аминокислот используют буферную систему компонентов A-F, состав буферных растворов указан в табл.1. pH буферных растворов предварительно устанавливают с помощью ортофосфорной кислоты и гидрооксида натрия, растворы перед введением в анализатор подвергают фильтрованию через фторопластовый фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Таблица 1
Состав буферных растворов
Наименование AB CDF
pH3,3 3,64,511,0 11,0
Нормальность 0,100,10 0,100,250,3
Ацетат натрия, г 8,28,28,2 8,20
Метанол, мл75 000 0
Муравьиная кислота, мл 3,03,02,0 1,20
Уксусная кислота, мл 15,020,01,5 5,00
Борная кислота, г0 00 2,00
Этилендиаминтетраацетата динатриевая соль, г0 000,5 0
Гидроксид натрия, г 000 6,012,0
Каприловая кислота, мкл100 100100100 100
Вода деионизированная для ВЭЖХ, лдо 1 до 1до 1до 1 до 1

Принцип определения аминокислот заключается в следующем. 20 мкл анализируемой пробы помещают в пластиковый сосуд, который устанавливают в поворачивающийся штатив автоматического термостатированного инжектора. Закол пробы осуществляется в соответствии с программой после промывки и регенерации хроматографической колонки, имеющей температуру 47°C и заполненной ионообменником - катионитом с карбоксильными ионогенными группами в Na+-форме. Подача элюента осуществляется по капиллярным шлангам высокого давления с внутренним диаметром 0,2 мм. Разделение аминокислот осуществляется автоматически в соответствии с заданной программой (табл.2). После разделительной колонки раствор поступает в термостатированный реактор для проведения цветной реакции. Подача в реактор нингидринового раствора, содержащего: 15 г/л нингидрина, 0,55 г/л гидридантингидрата, 1% метилцеллозольва, 10% метанола в 0,1 M ацетатном буфере pH 4,8, позволяет при температуре реактора 125°C осуществлять цветную реакцию анализируемых и прошедших аминокислот с нингидрином. Далее окрашенный раствор с комплексом аминокислот с нингидрином подается насосом в УФ детектор. Регистрацию аминокислот, связанных в комплексе с нингидрином, осуществляют автоматически одновременно при 570 нм, пролин анализируют при 440 нм, т.к. это является максимальной абсорбцией для данных определяемых аминокислот.

Работа анализатора выполняется по программе, предусматривающей одновременное ступенчатое изменение вида буфера и температуры хроматографической колонки на каждой стадии. Стандартное время анализа от момента ввода пробы до завершения выхода последнего пика, соответствующего аргинину, составляет 50 минут при скорости подачи элюента 0,2 мл/мин.

Таблица 2
Программа анализа аминокислот (P в колонке 50 атм, поток 0,2 мл/мин)
способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 12 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 45 67 8910 111213
Время, мин12,0 5,57,5 9,03,011,0 9,08,0 0,18,04,0 6,10,4
Ввод образцаспособ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 Xспособ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Нингидриновый буфер XX XXX XXX способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Буфер A XXспособ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Буфер B способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 Xспособ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Буфер C способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 XX способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Буфер D способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 XX Xспособ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628
Буфер F способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых   продуктов, патент № 2517628 XX XX X
Температура колонки, °C 4747 484849 525660 607070 5555

Используемый метод позволяет определять с точностью ±(5-10)% наличие всех природных аминокислот с минимальным уровнем их содержания в растворе (0,500±0,006) мкмоль/мл. Минимальный интервал надежного определения сигнала аминокислот, составляющий >200 мВ, получают для концентрации >0,3 мкг/мл взятого на анализ белка в пробе.

Пример. 0,1 г образца (пищевого продукта или белка неизвестного состава с содержанием белкового компонента более 20%) обрабатывают 6 M раствором HCl в количестве 1 мл при температуре 120°C в течение 24 ч в атмосфере Ar, полученный гидролизат смешивают с 5 мл буфера с pH 2,2, содержащим: цитрата натрия 9,8 г, концентрированной HCl 8,3 мл, тиодигликоля 1 мл и каприловой кислоты 50 мкл на литр, фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм и вводят в анализатор аминокислот.

По завершении автоматического анализа получают хроматограмму, содержание аминокислоты (X) в мкМ/мл (или в мг/мл, %, условных машинных единицах или мм по высоте или площади пиков в соответствии с заданной автоматической градуировкой обсчета хроматограмм) осуществляют автоматически по формуле: X=S1/S 2·C, где S1 - площадь пика определяемой аминокислоты на аминограмме; S2 - площадь пика той же аминокислоты в стандартной смеси; C - концентрация аминокислоты в стандартной смеси, мкМ/мл. В качестве градуировки используют стандартный раствор, содержащий по 2,5 мкМоль/мл ASP, THR, GLU, PRO, GLY, ALA, CYS, VAL, MET, ILEY, LEY, TYR, PHE, HIS, LYS, TRP и ARG. Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака после запятой.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2517628

patent-2517628.pdf

Класс G01N33/02 пищевых продуктов 

реагентная индикаторная трубка на основе хромогенных дисперсных кремнеземов -  патент 2521368 (27.06.2014)
способ определения полифенолов чая -  патент 2519767 (20.06.2014)
способ определения "картофельной" болезни хлеба -  патент 2519107 (10.06.2014)
способ определения массовой доли яблочного пюре в мармеладе или желейном корпусе конфет -  патент 2517056 (27.05.2014)
способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения -  патент 2514828 (10.05.2014)
способ экологической проверки продуктов питания под названием "система "органик-контроль" -  патент 2514108 (27.04.2014)
способ определения массовой доли амидированного пектина в мармеладе -  патент 2514104 (27.04.2014)
способ специфического отбора высокоаффинных молекул днк (днк-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени -  патент 2513700 (20.04.2014)
способ получения водного раствора меда и способ проверки его подлинности -  патент 2506813 (20.02.2014)
способ определения уровня токсикантов в воде, продуктах питания или физиологических жидкостях и тест-система -  патент 2506586 (10.02.2014)

Класс G01N1/18 устройства, обеспечивающие возможность разделения проб на части

Класс C07K7/08 содержащие от 12 до 20 аминокислот

Наверх