ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой

Классы МПК:A61K31/192  имеющие ароматические группы, например сулиндак, 2-арилпропионовые кислоты, этакриновая кислота
A61P21/00 Лекарственные средства для лечения заболеваний мышечной или нервно-мышечной систем
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации-Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ-ИМБП РАН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-03-06
публикация патента:

Предложено применение блокатора кальпаинов PD150606 в качестве средства для профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой. Показано, что PD150606 при функциональной разгрузке мышц блокировал кальпаиновую протеолитическую систему, приводящую к распаду белков, что ведет к предотвращению в них атрофических процессов. Изобретение отличает возможность осуществлять это предупреждение в течение длительного времени, поскольку PD150606 не снижал выработку собственной NO мышщами. Изобретение может найти применение в космической медицине при устранении негативного последствия гипокинезии или гравитационной разгрузки. 6 ил .

Рисунки к патенту РФ 2517576

средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576

Изобретение относится к медицине, более точно к фармакологии, может найти применение в космической медицине при устранении негативного последствия гипокинезии или гравитационной разгрузки.

Проблема поиска таких средств чрезвычайно актуальна. Известно, что сократительные и цитоскелетные белки скелетных мышц при гипокинезии и гравитационной разгрузке подвергаются деструкции. В то время как начальные физиологические события, сопровождающие атрофию, были хорошо исследованы (снижение мышечной силы, напряжения), немного известно о триггерах, или молекулярных сигнальных событиях, лежащих в основе этого процесса. Атрофия мышц обусловлена снижением в ней белкового синтеза и резким увеличением белкового распада (S.Kandarian и др., 2004). Известны 4 протеолитические системы, включенные в распад мышечных белков: лизосомальная (аутофаги/лизосомы), каспазная, кальпаиновая, убиквитин-протеасомная. Степень вовлечения каждой из этих систем в развитие атрофии при различных ее моделях (кахексия, сепсис, денервация, иммобилизация, вывешивание) разная. В последнее время считается, что при функциональной разгрузке мышц каспазная система практически не задействована. Около 70% от объема мышечного волокна занимают сократительные белки, и эта фракция при атрофии снижается быстрее, чем многие другие (Baldwin КМ и др., 1990). Какая из протеолитических систем задействована в распаде сократительных белков - до недавнего времени оставалось неизвестным. S. Cohen с соавторами в 2009 г. обнаружили, что Е3 лигаза MuRF-1 участвует в убиквитинировании толстых филаментов при атрофии. Остается неизвестным, как может приступить к работе убиквитин-протеасомная система, если толстые филаменты защищены от убиквитирования в миофибриллах связанными белками? На этот вопрос ответа до сих пор не получено. Мы полагаем, что доступность толстых филаментов для убиквитирования может обеспечить кальпаиновая система. Работа кальпаиновой системы при мышечной разгрузке исследована недостаточно. Можно предположить, что кальпаины могут служить начальным звеном, запускающим дальнейшее убиквитинирование белков при функциональной разгрузке мышц. Известны работы, где применяли блокирование кальпаинов на культуре мышечных клеток (Nozaki К.И. др., 2010), при сепсисе мыши (Callahan LA, Supinski GS, 2009) и в некоторых других случаях, в которых сигнальные пути, задействованные в белковой деградации, отличны от процессов, вызывающих атрофию при функциональной разгрузке мышц. Блокирование кальпаинов при функциональной разгрузке мышц у животных применяли в нескольких работах, где исследовали изменение функциональных характеристик мышц и изменение мышечной массы. Однако во всех этих работах использовали трансгенных животных, с повышенной экспрессией кальпастатина (естественного ингибитора кальпаинов) (1, 2, 3). Другие авторы использовали ингибитор кальпаина calpeptin для исследования эффектов предотвращения, или снижения разрушения некоторых белков мышц от повреждений, вызванных экспериментальной аллергией (4), различными другими заболеваниями, а также эксцентрической нагрузкой (5). Введение ингибиторов кальпаинов животным неоднократно использовали для исследований, проводимых на сетчатке глаза, сердце (6, 7) и других органах. Наиболее близким средством (прототипом), направленным на предотвращение атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке, является L-аргинин (Патент РФ № 2444354).

Недостатком этого известного средства является то, что L-аргинин нельзя вводить в течение длительного времени, т.к. в этом случае активность собственной мышечной NO-синтазы снижается, что уменьшает выработку собственной NO мышцами.

Техническим результатом заявленного средства является повышение его эффективности за счет более высокой степени предупреждения атрофии мышц, а так же возможность в течение более длительного времени осуществлять это предупреждение.

Этот технический результат обеспечивается следующим техническим эффектом: средство обеспечивает блокирование кальпаиновой протеолитической системы, приводящей к распаду белка при функциональной разгрузке мышц, что ведет к предотвращению в них атрофических процессов.

Указанный технический результат достигается тем, что блокатор кальпаинов PD150606 применяют в качестве средства для профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой.

Применение средства осуществляют следующим образом

Для выполнения поставленной задачи нами была проведена предварительная работа по подбору специфического ингибитора кальпаинов мыши, его концентрации и метода введения препарата in vivo. Эта работа была необходима, т.к. специфический ингибитор кальпаинов PD150606 применялся ранее только в экспериментах с культурами ткани, и известна единичная работа, в которой этот препарат вводился крысам за 30 минут до забоя. Оригинальность нашего подхода заключалась в том, что до нас длительного введения ингибитора кальпаинов in vivo в мышцы не применяли. На подготовительном этапе мы использовали 23 самца крыс Wistar и определили концентрацию PD150606, и частоту внутримышечного введения препарата для блокирования синтеза µ-кальпаина и тестирования некоторых маркеров сигнальных путей мышц. При этом мы также убедились, что после 3-х дней эксперимента животные, которым препарат вводился внутримышечно, по основным физиологическим показателям не отличались от крыс без введения препарата. Для проведения эксперимента 21 самец крыс Wistar были случайным образом распределены в 3 группы (по 7 крыс в каждой): интактный контроль (гр. К, вес крыс 226±13 г); вторую группу крыс вывешивали 3 дня таким образом, чтобы их передние конечности опирались на пол, а задние конечности его не касались (гр. В, вес крыс 207±7 г); третью группу вывешивали с введением ингибитора кальпаинов PD150606 (гр. PD, вес крыс 215±9 г, введение препарата внутримышечно в 10% DMSO дважды в день (в концентрации 3 мг/кг в день). Крыс забивали сверхдозой нембутала (75 мг/кг веса), m.soleus немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -85°С. Определяли методом ПЦР в реальном времени уровень мРНК µ-кальпаина, белков теплового шока (Hsp90 и 70), nNOS, Е3 лигаз (атрогена-1 и ), элонгационного фактора eEF2k (ингибирующего функцию белкового синтеза). Методом фореза в полиакриламидном геле и иммуноблота определяли маркеры сигнальных путей протеинового синтеза Akt-mTOR-S6K и MAPK/Erk: pAkt, pFOX03, рР90, а также уровень конъюгированного убиквитина.

Электрофорез в ПААГ.

С каждой пробы m.soleus были сделаны срезы толщиной 20 мкм (10-15 мг) и немедленно прогомогенизированы в течение 25 мин в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (рН=8), 150 мМ NaCl, 0,1% ДДС-Na, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ бета-глицерофосфат, 0,5 мМ DTT, 5 мМ ЭГТА, 10 мкг/мл апротинин, 10 мкг/мл леупептин, 1 мМ PMSF. 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4. 10 мкг/мл пепстатин; 0,1% Тритон Х-100. Затем образцы центрифугировали при 20000xg в течение 15 мин. Часть супернатанта отбирали для определения концентрации общего белка с помощью RC DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, США). Электрофорез проводили в 10% разделяющем и 5% концентрирующем акриламидном геле. Образцы загружались из расчета 40 мкг общего белка в каждой пробе на дорожку и нормировались относительно уровня GAPDH, содержащегося в той же пробе.

Вестернблоттинг.

Электроперенос белков производился в буфере (25 мМ Трис pH=8,3, 192 мМ глицин, 20% метанола. 0,04% ДДС-Na) на нитроцеллюлозную мембрану при 100 мД при температуре +4°С в системе mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, США) в течение 2 часов. Мембраны блокировали в растворе 5% сухого молока (Bio-Rad Laboratories, США) в TBST. Для выявления были использованы первичные моноклональные антитела: анти-pAkt (Abeam, 1:1000), анти-Р-р90 (Abeam, 1:800), анти-pFOXCe (Santa Cruz, 1:1000), анти-убиквитин (Abeam, 1:1000). Были использованы вторичные антитела: GAM Bio-Rad Laboratories, США 1:50000 и GAR Santa Cruz, 1:1000). Вестернблоттинг был повторен не менее 3 раз. Анализ белковых полос производился с помощью денситометра GS-800 (Quantity-Oneсредство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 software, BioRad). Для каждой группы были подсчитаны как Mm (средняя±стандартная ошибка).

Анализ экспрессии генов.

Обратная транскрипция. Тотальная РНК была экстрагирована из 10 мг замороженной m.soleus при помощи RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany). Все образцы РНК были обработаны протеиназой К и ДНКазой I. Концентрация РНК была определена при длине волны 260 нм. Затем водный раствор выделенной РНК был заморожен при -84°С для последующего проведения обратной транскрипции. Для обратной транскрипции использовали водный раствор 1 мкг РНК, олиго(dT)15, случайные гексануклеотиды d(N)6, обратную транкскриптазу MMLV. Обратную транскрипцию проводили при 37°C в течение 60 мин согласно стандартному протоколу. Все образцы были проанализированы не менее 3-х раз и все реакции измерены с помощью детектирующего амплификатора iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США), средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -актин и GAPDH использовали в качестве реферепеных генов. Праймеры, использованные для проведения ПЦР-РВ: 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GAGGCAGAGGAAGAGAAAGG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -

ATGGGCTTCGTCTTATTCAG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для HSP90средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 ; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CCTCCGATTTCAGCTCAG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CGAAGGCGTAGAGATTCCAG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для HSP70; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CTACGATGTTGCAGCCAAGA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GGCAGTCGAGAAGTCCAGTC-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для MAFbx; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GCCAATTTGGTGCTTTTTGT-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -AAATTCAGTCCTCTCCCCGT-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для MuRF-1; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CATGGCTAAGAGCAGGAAGG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CGAAGTCTGCAGGTCTAGGG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для calpain1; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -AGAAGCTGGTGACAGGCAGT-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GGGTTCTTGTCCAGTCCAAA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для eLFk; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -AGTCCCCTGCTTCGTGAGAG-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CACCCGAAGACCAGAACCAT-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для nNOS; 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -CACCAAGAAGGTCAAACAGGA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GCAAGAACTTTATTCAAAGTGCAA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для убиквитина, 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -ACCGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GCTTTCCAGAGGGGC-CATCCACA-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для GAPDH: 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCC-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 и 5средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -GTAAAA-CGCAGCTCAGTAACAGTC-3средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 для средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 -actin. Для опенки относительных изменений в уровне экспрессии специфического гена в пробе мы использовали следующую формулу: средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 Ct=Ct (реф)-Ct (тест), где Ct (реф) - точка пересечения базовой линии и графика амплификации референсного гена в пробе, а Ct(тест) - точка пересечения базовой линии и графика амплификации изучаемого гена в той же пробе. Далее определяли в каждой группе среднее значение средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 Ct и его стандартную ошибку. Изменение уровня экспрессии анализируемого гена в экспериментальных группах оценивали относительно контрольного уровня по формуле: средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 Ct=средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 Ct (группа)-средство для профилактики и снижения деструкции белков скелетных   мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной   разгрузкой, патент № 2517576 Ct (контроль).

Статистическая обработка данных.

Все данные приводились как М±m, где М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднего значения. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы Origin Pro v.8.0 SR5. Все выборки были проверены на принадлежность к нормально распределенной совокупности. Достоверность отличий между группами определялась с помощью двуфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим вычислением значения критерия Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений. Достоверность различий между группами также определялась по непарному t-критерию Стьюдента при вероятности нулевой гипотезы p<0.05.

Мы обнаружили, что после введения вывешенной группе крыс ингибитора кальпаинов (гр.PD) у нее не наблюдалось снижения веса m.soleus, как и индекса сухого веса мышцы к весу крысы (г) после 3-х дней эксперимента (в отличие от группы, вывешенной без препарата), Фиг.1. Вес m.soleus составлял 106±8 и 114±7 в группах К и PD против 86±5 (p<0,05) в группе В соответственно. Что свидетельствует об адекватном действии препарата на мышцу.

В группе PD, вывешенной с введением препарата, мы не отметили повышения уровня экспрессии мРНК µ-кальпаина (в отличие от группы, вывешенной без введения ингибитора), Фиг.2.

Мы тестировали работу звеньев системы протеасомной деградации (Е3 лигаз atrogin-1/MAFbx и MuRF-1) и обнаружили отсутствие увеличения уровня экспрессии мРНК Е3-лигазы атрогена-1 (MAFbx) в группе с введением блокатора кальпаина (в отличие от soleus крыс, вывешенных без препарата , Фиг.2). В то же время уровень экспрессии мРНК Е3-лигазы MURF-1 в группе PD повысился так же, как и в группе вывешивания без введения препарата (Фиг.2).

Содержание убиквитинированных белков (как и экспрессия мРНК убиквитина) в soleus крыс, которым вводили ингибитор кальпаинов, не отличалось от группы контроля (в отличие от группы вывешивания, где оно было существенно повышено (p<0,05). Фиг.2, 3.

Для того чтобы оценить состояние белкового метаболита мышцы, мы тестировали не только экспрессию кальпаина, систему ее протеасомной деградации (Е3 лигазы -atrogin-1 и MuRF-1) и уровень конъюгированного убиквитина, но и протеинового синтеза (маркеры сигнальных путей Akt-mTOR-S6K - pAkt и pFOX03), а также уровень экспрессии элонгационного фактора eEF2k, и P-p90S6k, связанные с работой сигнального пути МАРКУЕгк. Мы обнаружили снижение содержания фосфорилированных белков pAkt и pFOXOS в m.soleus крыс, вывешенных без введения препарата (p<0.05). В то время как в группе PD снижение уровня этих белков было полностью предотвращено (Фиг.4, 5).

Мы обнаружили, что содержание рибосомальной P-p90S6k после 3-х дней вывешивания снижено в m.soleus обеих групп (Фиг.6). Следовательно, эта рибосомальная киназа, работающая ассоциированно с МАРК/Erk сигнальным путем, вряд ли напрямую регулируется кальпаинами. Уровень экспрессии мРНК элонгационного фактора eEF2k (ингибирующего функцию белкового синтеза) был заметно понижен в мышце животных, которым при вывешивании вводили препарат (Фиг.2). В то же время как у вывешенных без препарата животных он существенно превышал уровень контрольной группы (Фиг.2).

В наших предыдущих исследованиях, выполненных в рамках программы РФФИ, мы показали, что работа таких регуляторных белков, как nNOS и белков теплового шока Hsp90 и 70, которые выполняют защитную функцию для цитоскелетных белков, может регулироваться кальпаинами. Поэтому мы определили их экспрессию при ингибировании кальпаинов во время функциональной разгрузки мышц. Мы обнаружили снижение уровня мРНК Hsp70 в группе вывешивания (гр.B, p<0,05, Фиг.2) там, где концентрация кальпаинов была также существенно повышена (Фиг.2). В то же время в мышце, в которую вводился ингибитор кальпаинов, мы обнаружили существенное снижение как экспрессии Hsp70, так и nNOS (Фиг.2), что может быть связано с отсутствием необходимости в увеличении защитной реакции клетки от разрушения белка.

Такая же тенденция прослеживается при определении экспрессии мРНК Hsp90 (Фиг.2)

Для исследования роли кальпаинов в запуске убиквитин-протеасомной системы и регулировании анаболических сигнальных путей мы блокировали работу кальпаинов в мышце при вывешивании крыс. Тестировали систему протеасомной деградации (Е3 лигазы) и регуляторный белок pFOX03, а также маркеры системы протеинового синтеза (Akt-mTOR-S6K и МАРК/Erk сигнальных путей). Если наша гипотеза верна, то блокирование кальпаинов может предотвратить, или снизить содержание убиквитинированных белков, экспрессию Е3-лигаз, а также может предотвратить снижение анаболических процессов в мышце, затормозив тем самым развитие в ней атрофических процессов. При введении ингибитора кальпаинов мы обнаружили у этих крыс как отсутствие снижения веса m.soleus, так и отсутствие снижения индекса сухого веса мышцы по сравнению с группой контроля (в отличие от мышц крыс, вывешенных без ингибитора), фиг.1. Это свидетельствует о предотвращении развития атрофических процессов. Экспрессия мю-кальпаина в m.soleus этой группы также не отличалась от контроля (Фиг.2), в то время как в группе вывешивания (B) она была существенно повышена. Можно заключить, что блокирование работы кальпаинов достигло своей цели и привело к изменению его экспрессии при вывешивании животных. Наша гипотеза о взаимосвязи работы кальпаиновой и убиквитин-протеасомной систем распада белка оправдалась, т.к. как количество убиквитинированных белков, так и экспрессия их мРНК в группе PD не отличалась от уровня контроля, в то время как в группе «вывешивание» они были существенно повышены (Фиг.2, 3). Одновременно в группе B было повышено и содержание Е3-лигаз atrogin-1/muscle atrophy F-box (MAFbx), и мышечно-специфичного RING finger 1 (MuRFl) (Фиг.2). Ранее показано, что такие Е3-лигазы, как атрогин-1 и MuRF1, которые задействованы в процессах протеасомной деградации белков начинают особенно интенсивно активироваться при функциональной разгрузке мышц (Jackman, R.W., and Kandarian, S.C., 2004, Dupont-Versteegden, E.E. et all, 2006). Именно поэтому они были выбраны маркерами протеасомной деградации в нашей работе. Однако мы видим, что в группе PD предотвращено увеличение экспрессии мРНК в m.soleus только атрогена-1 (Фиг.2), тогда как экспрессия MuRFl в этой группе повышена так же, как и в группе, вывешенной без введения ингибитора кальпаина (Фиг.2). Экспрессия atrogin-1/MAFbx может регулироваться транскрипционным фактором forkhead box О (Foxo), который в норме фосфорилируется и (таким образом) инактивируется Akt. Если фосфорилирования не происходит - Foxo транслоцируется в ядро и индуцирует транскрипцию обоих Е3 лигаз - atrogin-1 и MuRF1 (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). В нашем эксперименте уровни как pFOX03 и pAkt были существенно снижены в группе вывешивания без препарата (В), фиг.4, 5, в то время как группы контроля и PD существенно не различались между собой по этим показателям. Можно предположить, что FOX03 фосфорилировался Akt и не поступал в ядро для индуцирования транскрипции атрогена-1. В то же время экспрессия MuRF1 регулируется не только FOXO3, но и nF-kapaB. И его повышенный в группе PD уровень мог обеспечиваться этим фактором. Изменения в экспрессии Е3-лигазы атрогина-1 и содержании фосфорилированных белков pAkt и рЕОХО3 свидетельствуют о взаимосвязи между работой кальпаиновой и убиквитин-протеасомной систем, а также о взаимной регуляции работы кальпаинового и Akt-mTOR-S6K сигнальных путей. Akt-mTOR-S6K хорошо известен как главный путь регуляции синтеза белка на уровне инициации трансляции [Bodine SC и др., 2001]. Содержание рибосомальной P-p90S6k (маркера МАРК/Erk анаболического сигнального пути) было достоверно снижено в обеих вывешенных группах (Фиг.6), по-сравнению с группой контроля, что свидетельствует об отсутствии согласования в работе анаболического MAPK/Erk сигнального пути и кальпаиновой протеолитической системы. В то же время экспрессия мРНК элонгационного фактора eEF2k имела явную тенденцию к снижению в мышце вывешенных животных с введением ингибитора кальпаинов по сравнению с группой контрольных животных, тогда как у вывешенных крыс (В) его содержание было достоверно повышено (p<0,05, Фиг.2). eEF2k занимается фосфорилированием фактора eEf2, что приводит к ингибированию процессов элонгации и тормозит процессы синтеза белка. То, что повышения мРНК eEF2k в группе PD (по сравнению с контрольными животными) не обнаружено, свидетельствует о том, что в условиях блокирования активности кальпаинов мышц при функциональной разгрузке снимаются препятствия для синтеза белка.

Мы определяли также содержание мРНК белков теплового шока 90/70 и nNOS в нашем эксперименте. Недавно на культуре клеток С2С12 показано, что nNOS и Hsp90 являются субстратами кальпаинов, и резкое снижение уровня этих белков при разгрузке мышц может быть связано с активированием кальпаинов. Ранее мы показали, что кальпаины могут регулировать in vivo содержание белков теплового шока 90/70 в мышце и активность nNOS при ее функциональной разгрузке (Ломоносова и др., 2011, 2012; Lomonosova et all, 2012). Мы также обнаружили, что nNOS имеет отношение к поддержанию белкового метаболизма мышц. Белки теплового шока синтезируются в скелетной мышце в большом количестве, их уровень быстро увеличивается при различных стрессах, что обеспечивает защиту клеток (Soti С. et all, 2005). Однако при функциональной разгрузке мышц уровень Hsp90/70 падает на 70-75% (параллельно атрофии мышцы) (Takashi Sakurai и др., 2005, Lomonosova et all, 2012). После 3-х дней вывешивания содержание Hsp70 (в группе В) в нашем эксперименте было также снижено (Фиг.2). Однако для нас было неожиданным то, что уровень экспрессии мРНК Hsp70 и nNOS в группе с введением ингибитора кальпаинов был существенно ниже, чем у контрольных животных (Фиг.2), а уровень Hsp90 имел тенденцию к снижению. Мы полагаем, что такое снижение может быть связано с отсутствием необходимости в увеличении защитной реакции клетки от разрушения белка при блокировании кальпаинов. Итак, мы показали, что имеется взаимодействие между работой кальпаиновой и убиквитин-протеасомной системами при разгрузке мышц, увеличение концентрации кальпаинов при разгрузке мышц ведет к повышению убиквитинирования белков, увеличению экспрессии Е3-лигазы атрогина-1. Мы обнаружили, что кальпаин связан с регуляцией белкового синтеза, контролируемого не только анаболическим Akt-mTOR-S6K сигнальным путем, но и другими факторами, регулирующими белковый синтез на уровне элонгации. Концентрация кальпаина имеет также отношение к регуляции экспрессии nNOS и Hsp70 в мышце. Блокирование кальпаинов при функциональной разгрузке мышцы ведет к снижению защитной реакции клетки от разрушения белка, что выражается в уменьшении экспрессии мРНК белков теплового шока и nNOS.

Вывод: Введение блокатора кальпаинов PD150606 при функциональной разгрузке мышц предотвращает развитие их атрофии.

Краткое описание рисунков

Фиг.1. Индекс сухого веса мышцы к весу крысы (в граммах). Отношение сухого веса m.soleus к массе тела животного у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05.

Фиг.2. Уровень мРНК µ-кальпаинов в m.soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.

Фиг.3. Содержание убиквитированных белков у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.

Фиг.4. Содержание фосфорилированного белка pAkt у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0,05, # - достоверные отличия от PD, p<0,05.

Фиг.5. Содержание фосфорилированного белка pFOXO3 у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде М±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от К, p<0,05.

Фиг.6. Содержание фосфорилированного белка рибосомальной киназы P-p90S6k у вывешенных (В) и вывешенных с введением PD150606 (PD) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде M±m (n=7 для каждой группы). * - достоверные отличия от K, p<0.05.

Источники информации

1. Salazar JJ, Michele DE, Brooks SV. Inhibition of calpain prevents muscle weakness and disruption of sarcomere structure during hindlimb suspension. J. Appl Physiol. 2010. Jan; 108 (1): 120-7.

2. Tidball JG, Spencer MJ.. Expression of a calpastatin transgene slows muscle wasting and obviates changes in myosin isoform expression during murine muscle disuse. J Physiol 545: 819-828, 2002.

3. Otam K, Han DH, Ford EL, Garcia-Roves PM, Ye H, Horikawa Y, Bell GI, Holloszy JO, Polonsky KS. Calpain system regulates muscle mass and glucose transporter GLUT4 turnover. J Biol Chem. 2004 May 14; 279 (20): 20915-20.

4. Park S, Nozaki K, Guyton MK, Smith JA, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibition attenuated morphological and molecular changes in skeletal muscle of experimental allergic encephalomyelitis rats. J. Neurosci Res. 2012 Nov; 90 (11): 2134-45

5. Zhang ВТ, Yeung SS, Allen DG, Qin L, Yeung EW. Role of the calcium-calpain pathway in cytoskeletal damage after eccentric contractions. J. Appl Physiol. 2008 Jul; 105 (1): 352-7

6. Das A, Guyton MK, Smith A, Wallace G 4th, McDowell ML, Matzelle DD, Ray SK, Banik NL. Calpain inhibitor attenuated optic nerve damage in acute optic neuritis in rats. J Neurochem. 2013 Jan; 124 (1): 133-46.

7. Zhang CM, Gao L, Zheng YJ, Yang HT. Berbamine protects the heart from ischemia/reperfusion injury by maintaining cytosolic Ca(2+) homeostasis and preventing calpain activation. Circ J. 2012; 76 (8): 1993-2002

8. Ma XW, Li Q, Xu PT, Zhang L, Li H, Yu ZB. Tetanic contractions impair sarcomeric Z-disk of atrophic soleus muscle via calpain pathway. Mol Cell Biochem. 2011 Aug; 354(1-2): 171-80.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применение блокатора кальпаинов PD150606 в качестве средства для профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2517576

patent-2517576.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K31/192  имеющие ароматические группы, например сулиндак, 2-арилпропионовые кислоты, этакриновая кислота

Патенты РФ в классе A61K31/192:
соединение сальвианоловой кислоты л, способ его приготовления и применения -  патент 2529491 (27.09.2014)
четырехзамещенные бензолы -  патент 2527177 (27.08.2014)
композиции, включающие по меньшей мере одно производное нафтойной кислоты, бензоилпероксид и по меньшей мере один пленкообразующий компонент, способы их получения и их применения -  патент 2526905 (27.08.2014)
применение бензофенонового производного или его соли и ингибитора tnf- в комбинации, и фармацевтическая композиция, содержащая данное производное или его соль и ингибитор -  патент 2522272 (10.07.2014)
сокристаллическая форма фенбуфена -  патент 2521572 (27.06.2014)
соединение для лечения метаболических расстройств -  патент 2521284 (27.06.2014)
средство, обладающее анксиолитической активностью -  патент 2519191 (10.06.2014)
способ профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой -  патент 2517259 (27.05.2014)
содержащее конденсированную кольцевую структуру производное и его применение в медицине -  патент 2512547 (10.04.2014)
производное бензохинона е3330 в комбинации с химиотерапевтическими агентами для лечения рака и ангиогенеза -  патент 2510270 (27.03.2014)

Класс A61P21/00 Лекарственные средства для лечения заболеваний мышечной или нервно-мышечной систем

Патенты РФ в классе A61P21/00:
соединения и способы лечения боли и других заболеваний -  патент 2528333 (10.09.2014)
модуляторы рецептора сфингозин-1-фосфата (s1p) и их применение для лечения воспаления мышечной ткани -  патент 2521286 (27.06.2014)
применение ангиогенина или агонистов ангиогенина для лечения заболеваний и нарушений -  патент 2519645 (20.06.2014)
способ приготовления полифенольных экстрактов из листьев шпината -  патент 2519640 (20.06.2014)
способ профилактики и снижения деструкции белков скелетных мышц при их атрофии, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой -  патент 2517259 (27.05.2014)
способ повышения трансдермальной проницаемости лечебных или косметических препаратов для наружного применения, способ введения в кожу газообразного ксенона -  патент 2506944 (20.02.2014)
способ лечения спастичности, сопровождающийся улучшением сознания у больных в вегетативном состоянии -  патент 2502503 (27.12.2013)
комбинированное анальгезирующее и спазмолитическое средство -  патент 2500399 (10.12.2013)
лечение кахексии -  патент 2485950 (27.06.2013)
способ предотвращения атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке -  патент 2481105 (10.05.2013)


Наверх