способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro
Классы МПК: | A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур A01G7/00 Ботаника, общие вопросы A01G23/00 Лесное хозяйство |
Автор(ы): | Сиволапов Владимир Алексеевич (RU), Сиволапов Алексей Иванович (RU), Табацкая Татьяна Михайловна (RU), Благодарова Татьяна Александровна (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежская государственная лесотехническая академия" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-12-07 публикация патента:
10.05.2014 |
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков. Используют базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, -нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л. Далее проводят адаптацию при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице с получением посадочного материала для лесных культур. Способ позволяет получать посадочный материал с высокими наследственными свойствами. 2 табл.
Формула изобретения
Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro, включающий культивирование каллусных культур из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков, используя базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, -нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л, и дальнейшей адаптацией при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице, и получением посадочного материала для лесных культур.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии растений.
Ольха черная (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) перспективна для лесного хозяйства страны, она способна выдерживать длительное затопление и произрастать на переувлажненных экотопах там, где другие древесные породы расти не могут, способна произрастать на бедных и бесплодных сухих почвах (гравий, песок) с близко залегающими грунтовыми водами, способна обогащать почву азотом через опад и корневые выделения (до 780 кг/га за 5 лет). Благодаря этому качеству черная ольха при совместных посадках с более ценными породами оказывает на них положительное влияние. Уникальна биосферная роль ольхи черной в болотной экосистеме, что делает ее привлекательной для экологов, лесоводов, селекционеров. Незаменима она при разработке моделей устойчивого и ускоренного повышения продуктивности насаждений, при плантационном лесоводстве для ускоренного получения древесины.
В связи с важностью выращивания селекционных форм и сортов ольхи черной существует необходимость получения посадочного материала с высокими наследственными свойствами. В уровне техники не выявлен способ решения поставленной задачи.
Предлагаемое изобретение решает задачу создания наиболее эффективного способа размножения ольхи черной - микроклональное размножение in vitro.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro включает культивирование каллусных культур из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков, используя базовые питательные среды Мурасиге-Скуга (MS), Вуди Плант Медиум (WPM) с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,2÷1,5 мг/л, -нафтилуксусная кислота (НУК) - 0,2÷0,5 мг/л, индолилмасляная кислота (ИМК) - 2 мг/л, и дальнейшей адаптацией при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице, и получением посадочного материала для лесных культур.
Осуществляют способ следующим образом.
Для каллусных культур эксплантами служат стеблевые сегменты без почек, листья, листовые черешки.
В качестве базовых сред используют MS или WPM и их модификации с различным содержанием и соотношением регуляторов роста (6-БАП, ИУК, НУК, ИМК). При прямой регенерации используют 6-БАП (0,2-1,5 мг/л), индукции множества почек и побегов - 6-БАП в сочетании с НУК (0,2-0,5 мг/л). Каллусные культуры получают с помощью ИМК (2 мг/л) в сочетании с 6-БАП (0,2-0,5 мг/л). Исключение ИМК в дальнейшем и увеличение концентрации 6-БАП до 1 мг/л используют для получения морфогенных каллусных культур. Для пролиферации каллуса ольхи черной в питательную среду вносят ИМК (2 мг/л) в сочетании с 6-БАП (0,2-0,5 мг/л). Развитие, удлинение побегов достигается согласно следующим приемам: солевой состав питательной среды разбавляют в 2-3 раза, дополняют ее активированным углем (10-20 г/л), обрабатывают базальные концы побегов раствором ИМК (25 мг/л в течение 10-15 минут).
Адаптационный этап развития регенерированного материала предусматривает следующие варианты:
1 - лабораторный (открытые пробирки в течение 3-5 дней, затем высаживают в грунт стаканчики, доращивают в микротеплице с последующей высадкой в открытый грунт).
2 - прямая высадка в открытый грунт с использованием временного укрытия (пленочные микротеплицы).
В первом варианте экологические условия контролируемые (t 25-26°C, освещенность 2000 люкс при 16-часовом фотопериоде); во втором - естественные условия освещения и температуры. Повышенная влажность достигается поливом и пленочным укрытием.
Эффективность каллусогенеза разных органов ольхи на питательной среде MS+ИМК (2 мг/л) отражена в таблице 1.
Таблица 1 | ||||
Экспланты | Эффективность каллусогенеза | |||
Количество культур | Темп каллусогенеза (сутки) | Объем ткани (см3) | ||
общее | С каллусом, % | |||
Ольха черная | ||||
стеблевые сегменты | 15 | 100 | 21 | 1,5-2 |
черешки | 10 | 40,0 | 30 | следы |
листья | 11 | 9,9 | 30 | следы |
В таблице 2 отражена эффективность морфогенеза у культур различного происхождения (каллусные, стеблевые сегменты) на среде WPM в зависимости от содержания БАП мг/мм:
Таблица 2 | ||||
БАП мг/мм | Ольха черная | |||
каллусная культура | почки | |||
общее количество | общее количество | |||
0,1 | 5 | - | 10 | - |
0,2 | 5 | - | 10 | - |
0,5 | 6 | 1/16,6 | 10 | 4/40,0 |
0,6 | 5 | 2/40,0 | 10 | 7/70,0 |
1,0 | 5 | - | 10 | 2/20,0 |
1,5 | 5 | - | 10 | - |
2,0 | - | - | 10 | - |
Продолжительность жизни морфогенных культур ольхи по сравнению с другими лиственными (береза) значительно ниже и ограничена 2-3 неделями.
Для их сохранения необходимо повторное рекультивирование. В противном случае независимо от происхождения в культурах отмечен интенсивный рост каллусной ткани, как правило, подавляющий развитие побега.
Класс A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур
Класс A01G7/00 Ботаника, общие вопросы
Класс A01G23/00 Лесное хозяйство