способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в условиях хлоридного засоления

Классы МПК:A01H1/06 способы изменения наследственных признаков, например путем обработки химикалиями или облучением
A01G7/00 Ботаника, общие вопросы
C12N15/10 способы выделения, получения или очистки ДНК или РНК
C12N15/11 фрагменты ДНК или РНК; их модифицированные формы
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-11-21
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. В способе растения обрабатывают раствором биологически активного вещества, в качестве которого используют 24-эпибрассинолид. При этом через 3 недели культивирования растений рапса на жидкой питательной среде последующие две недели растения подвергают хлоридному засолению 125 мМ с однократным внесением в раствор 24-эпибрассинолида в концентрации 10-8 М в начале засоления. Способ позволяет повысить устойчивость растений рапса к повреждающему действию интенсивного хлоридного засоления и экологическую безопасность производимой продукции. 4 ил., 1 табл., 1 пр. способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641

Рисунки к патенту РФ 2514641

способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве при химической защите растений рапса на открытом грунте или в сооружениях защищенного грунта.

Рапс (Brassica napus L.) является важным источником для получения растительного масла и кормового белка, в последнее время растение активно используют для получения биотоплива. По пищевым и кормовым достоинствам рапс превосходит многие сельскохозяйственные культуры. Рапс является одной из перспективных масличных культур, которую можно возделывать практически во всем мире. Значительные экономические потери могут вызывать абиотические стрессоры, особое место среди них занимает засоление. Общая площадь засоленных территорий в мире, по данным Всемирной организации продовольствия и сельского хозяйства OOH, превышает 800 миллионов гектаров (2005 г.). Засоление почв приводит к снижению продуктивности агро- и биоценозов, падению биоразнообразия и, как следствие, к значительным экономическим потерям.

С целью сохранения продуктивности агроценозов в аридных регионах важное значение имеет повышение устойчивости растений к повреждающему действию интенсивного засоления, что является одной из фундаментальных проблем современной биологии. Решение этой проблемы необходимо для разработки технологии защиты растений от повреждающего действия неблагоприятных факторов среды (Kuznetsov V1.V., Shevyakova N.I., 2011).

Известно, что тяжелые металлы (кадмий, медь и никель) вызывают дифференциальную регуляцию скорости транскрипции пластидных генов проростков ячменя (Зарипова Н.Р., Зубо Я.О., Кравцов Я.К. и др. Доклады АН. Общая биология. 2008. Т.423. № 1. С.124-128). Показано, что скорость транскрипции генов рибосомных белков (rp216 и rpl23-rpl2) и гена, кодирующего субъединицу 1 пластохинонредуктазы (ndhA) увеличивалась в присутствии анализируемых тяжелых металлов. Транскрипционная активность ряда других генов (psaB, atpH и rrn16) снижалась. Длительное воздействие тяжелых металлов снижало накопление хлорофилла в проростках ячменя, что могло быть косвенной причиной повреждающего стрессорного воздействия металлов на фотосинтез.

Недостатком способа-аналога является невозможность предотвращения негативного влияния тяжелых металлов на пластидный геном растений.

Известны способы повышения солеустойчивости растений окисленным крахмалсодержащим продуктом. Семена свеклы, рапса, сафлоры и сорго замачивали в водном растворе пероксида водорода в концентрации 5·10 -4-1·10-3 М (1,7·10-2-3,4·10 -1 г/л) с последующим подсушиванием, затем семена обрабатывали полусухим методом 10-20%-ным водным раствором окисленного крахмалсодержащего продукта (ОКР), полученного окислением крахмалсодержащего сырья в щелочном растворе в присутствии медного катализатора, и подсушивали до сыпучего состояния (Пат. RU 2445759. Способ повышения солеустойчивости растений (варианты), 2012, принято за прототип).

Среди недостатков способа-прототипа можно отметить то, что используемая концентрация действующего вещества - окисленного крахмалсодержащего продукта - очень высока - 10-20%, что экономически не выгодно. Анализируемая концентрация NaCl мала (от 85 мМ до 120 мМ). В случае с семенами рапса хлоридное засоление составляло 100 мМ, данная концентрация обычно не вызывает выраженного повреждения и, соответственно, не может вызывать значительные экономические потери. Кроме того, способ-прототип учитывает только процент выживших растений, не принимая в расчет физиологическое состояние растений.

Задачей изобретения является разработка экономичного способа повышения устойчивости растений рапса к повреждающему действию интенсивного хлоридного засоления.

Поставленная задача решается тем, что растения рапса культивируют на жидкой питательной среде в течение трех недель, последующие две недели растения подвергают хлоридному засолению 125 мМ с однократным внесением в раствор в начале засоления 24-эпибрассинолида в концентрации 10-8 М.

Сущность изобретения состоит в стабилизации транскрипции хлоропластных генов у растений рапса в условиях хлоридного засоления экологически чистым фитогормоном - 24-эпибрассинолидом. После трехнедельного культивирования растений рапса на жидкой питательной среде Хогланда-Снайдер в раствор вносят хлоридную соль и последующие две недели выращивают растения в условиях хлоридного засолении, причем в начале хлоридного засоления растения подвергают обработке 24-эпибрассинолидом (10-8 М). Протекторное действие гормона выражается в снижении отрицательного воздействия засоления на фотосинтетический аппарат растений.

Способ по изобретению допускает более высокую засоленность на растениях рапса. Использованная в опытах концентрация NaCl на 25% выше концентрации по способу-прототипу, в то время как концентрация вещества с выраженным протекторным действием (эпибрассинолида) мала и составляет 10-8 М, что отражает преимущества и экономическую выгоду предложенного способа.

Эпибрассинолид является одним из брассиностероидов, обладающих высокой биологической активностью. Активное использование брассиностероидов в качестве принципиально новых препаратов сельскохозяйственного назначения обусловлено их экологической безопасностью и способностью снижать накопление нитратов, тяжелых металлов и радионуклидов. Как показано нашими предварительными исследованиями, на уровне целого растения брассиностероиды способствуют повышению фотосинтетического потенциала, усилению роста и урожайности сельскохозяйственных культур (Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A., 2004; Efimova M.V. et al., 2012a; Efimova M.V. et al., 2012b). В отличие от абсцизовой кислоты и этилена механизмы стресс-протекторного действия стероидных фитогормонов остаются в настоящее время практически неисследованными (Gomes М.М.А., 2011).

Активность транскрипции пластидных генов в растениях рапса иллюстрируется рисунками.

На фиг.1 показана радиограмма радиоавтографа эксперимента с хлоропластами растений рапса и схема нанесения ДНК-зондов исследованных генов на мембрану.

На фиг.2-4 показаны гистограммы, полученные при обработке данных радиоавтографов.

Реализация способа показана на примере, иллюстрирующем способность фитогормона эпибрассинолида (ЭБЛ) снимать негативное воздействие засоления на физиологические показатели рапса и транскрипцию ключевых генов фотосинтеза.

Пример. Опыты проведены на листьях 3-5 яруса Brassica napus L. сорта Вестар. Растения рапса в возрасте 20 дней подвергали 2-недельному хлоридному засолению (125 мМ NaCl). Как показал анализ результатов (опыт и контроль), обработка растений рапса раствором ЭБЛ (10-8 М) способствовала стабилизации транскрипций некоторых пластидных генов. Данные изменения на молекулярном уровне способствуют снижению отрицательного влияния засоления на фотосинтетический аппарат растений и в конечном итоге повышению продуктивности растений.

С помощью run-on анализа была изучена скорость транскрипции ключевых фотосинтетических генов рапса при хлоридном засолении и под действием экзогенного эпибрассинолида (на фиг.2-4 обозначены как NaCl и ЭБЛ соответственно). Основой транскрипционной системы служили лизированные хлоропласты, выделенные из листьев 3-5 ярусов растений рапса. В ходе реакции транскрипции во вновь синтезированные молекулы РНК включали радиоактивно-меченый уридин-5'-монофосфат (способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 32Р-уридин-5'-трифосфат использовали в ходе реакции синтеза РНК), что позволило в дальнейшем анализировать только вновь синтезированные транскрипты. Синтез меченных транскриптов в хлоропластном лизате, ДНК-РНК гибридизацию и экспозицию нейлоновой мембраны с рентгеновской пленкой проводили согласно методике, предложенной Зубо и Кузнецовым (Зубо Я.О., Кузнецов В.В., 2008). После гибридизации радиоактивные сигналы сканировали и оцифровывали, используя Phosphorimager Typhoon Trio (сканер Typhoon TRIO+Variable Mode Imager с пакетом Typhoon Scaner Control) и ImagerQuant TL Control Centre («GE Healthcare)), США).

Типичные радиоавтографы опыта, полученные в ходе run-on эксперимента с хлоропластами листьев рапса, и схема нанесения фрагментов выбранных генов на мембрану показаны на фиг.1.

В ходе исследования была проанализирована транскрипция 12 хлоропластных генов, относящихся к функционально-различным группам генов пластома (см. таблицу). Прежде всего - это гены белков фотосинтетического аппарата, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза - гены фотосистемы I - psa (psaA и psaB), фотосистемы II - psb (psbA, psbD и psbK), ген большой субъединицы РБФК (rbcL), АТФ синтетазного комплекса - atp (atpB) и субъединица F НАДФН пластохиноноксидоредуктазы - ndhF. Среди генов т.н. «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомной РНК (rrn16 и rrn23) и гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y).

На фиг.2 показано отношение интенсивности транскрипции пластидных генов листьев рапса, обработанных NaCl, к интенсивности транскрипции генов контрольных листьев. Засоление изменяло экспрессию функционально-различных групп пластидных генов. Активность транскрипции ряда фотосинтетических (psaA и psbD) и рибосомных генов (rrn16, rrn23 и trnEY) увеличивалась. Транскрипция других генов (psaB, psbA, psbK и atpB), выполняющих первостепенную роль для реализации фотосинтеза, снижалась.

Инкубация на растворе с ЭБЛ вызывала достоверное (в 2-4 раза) увеличение транскрипции 10 исследуемых пластидных генов (см. фиг.3). Среди них гены белков фотосинтетического аппарата - А1 и А2 апопротеины фотосистемы I (psaA и psaB), полипептид реакционного центра (psbD) и К апопротеин (psbK) фотосистемы II, ген, кодирующий большую субъединицу РБФК (rbcL), F субъединицу НАДН-пластохинон оксидоредуктазы (ndhF) и способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 -субъединицу АТФ синтазы (atpB). Транскрипция рибосомных генов, кодирующих 16S рРНК, 23S рРНК и тРНК-Глу/тРНК-Тир - rrn16, rrn23 и trnE/trnY соответственно, также увеличивалась под влиянием экзогенного эпибрассинолида.

На фиг.4 показана интенсивность транскрипции генов при одновременном воздействии на растения рапса хлоридного засоления и эпибрассинолида. Отмечена способность гормона снижать негативный эффект хлоридного засоления на транскрипцию пластидного генома. Влияние выражается в стабилизации транскрипции шести генов (2/3 от общего числа дестабилизированных хлоридным засолением генов) - psaA, psbB, psbD, psbK, atpB и trnEY.

Таким образом, экспериментально показано, что экзогенный эпибрассинолид не только повышает активность транскрипции некоторых хлоропластных генов, но и способствует стабилизации транскрипции пластидных генов при засолении. На основе этих результатов предложен способ стабилизации транскрипции генов рапса при хлоридном засолении согласно заявленной формуле изобретения.

Техническим результатом изобретения является повышение устойчивости растений рапса к повреждающему действию интенсивного хлоридного засоления.

Использованные источники

1. Kuznetsov V1.V., Shevyakova N.I. Polyamines and plant adaptation to saline environments / Desert Plants. 2010. Heidelberg, Dordrecht, London, New York: Springer-Verlag. - P.261-298.

2. Зарипова H.P., Зубо Я.О., Кравцов Я.К., Холодова В.П., Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В. Тяжелые металлы вызывают дифференциальную регуляцию транскрипции пластидных генов и блокирование сплайсинга мРНК. Доклады АН. Общая биология. 2008. Т.423. № 1. С.124-128.

3. Пат. RU 2445759, Способ повышения солеустойчивости растений (варианты), Апашева Л.М., Комиссаров Г.Г., Сахаров A.M., Сахаров П.А. Опубликовано: 27.03.2012.

4. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. 2004. M.P.Schneider. Ed. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. - Vol.129. - P.153-167.- NATO Science Series. 391 p.

5. Efimova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov A.K., Bartashevich D.A., Karnachuk R.A., Kovtun I.S., Kuznetsov V.V. Expression of plastid genome and development of Arabidopsis thaliana with disturbed synthesis of brassinosteroids // Russian Journal of Plant Physiology. - 2012a. - Vol.59 (1). P.28-34.

6. Efimova M.V., Kusnetsov V.V., Kravtsov A.K., Karnachuk R.A., Khripach V.A., Kuznetsov V.V. Regulation of the transcription of plastid genes in plants by brassinosteroids // Doklady Biological Sciences. - 2012b. - Vol.445 (1). P.272-275.

7. Gomes M.M.A. Physiological effects related to brassinosteroid application in plants / Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone. 2011. S. Hayat, A. Ahmad. Eds. Springer Science+Business Media B.V. - P.193-242. p.462.

8. Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома // Физиология растений. - 2008. - Т.55. С.114-122.

9. Bock R. Structure, function, and inheritance of plastid genomes / Cell and Molecular Biology of Plastids. 2007. Bock R. Ed. Springer. - P.29-64.

Способ стабилизации транскрипции пластидных геновспособ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641

Характеристика генов (9. Bock R., 2007).
Ген Продукт генаФункции
Гены белков фотосинтетического аппарата
psaAА1 апопротеин ФСI Реакционный центр фотосистемы I
psaBА2 апопротеин ФСI
psbAПолипептид реакционного центра D1 Реакционный центр фотосистемы II
psbD Полипептид реакционного центра D2
psbKК апопротеин ФСII Малый апопротеин, ассоциированный с СР43, участвует в сборке и стабилизации фотосистемы
rbcL Большая субъединица РБФК Фиксация CO2
atpB способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 -субъединица АТФ синтазыCF1, каталитический сайт
ndhF F-субъединица НАДН-пластохинон оксидоредуктазы Циклический перенос электронов
Гены «домашнего хозяйства»
rrn1616S pPHK Трансляция, малая рибосомная субъединица
rrn2323S рРНК Трансляция, большая рибосомная субъединица
trnE/trnYтРНК-Глу и тРНК-Тир Трансляция, биосинтез тетрапирролов
rpoBспособ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в   условиях хлоридного засоления, патент № 2514641 -субъединица РНК-полимеразыТранскрипция, пластидная РНК-полимераза (PEP)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в условиях хлоридного засоления, включающий обработку растений раствором биологически активного вещества, отличающийся тем, что через 3 недели культивирования растений рапса на жидкой питательной среде последующие две недели растения подвергают хлоридному засолению 125 мМ с однократным внесением в раствор 24-эпибрассинолида в концентрации 10-8 М в начале засоления.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2514641

patent-2514641.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A01H1/06 способы изменения наследственных признаков, например путем обработки химикалиями или облучением

Патенты РФ в классе A01H1/06:
масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина -  патент 2502793 (27.12.2013)
гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение -  патент 2497830 (10.11.2013)
растения томата, обладающие повышенными уровнями устойчивости к botrytis -  патент 2469094 (10.12.2012)
способ мутагенной обработки семян ячменя -  патент 2464779 (27.10.2012)
способ мутагенной обработки растений ячменя -  патент 2456796 (27.07.2012)
способ мутагенной обработки семян ячменя -  патент 2425485 (10.08.2011)
способ индуцирования мутаций у растений рода луков -  патент 2388215 (10.05.2010)
способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы -  патент 2379882 (27.01.2010)
способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности brassica napus, имеющих хорошее агрономическое качество -  патент 2373698 (27.11.2009)
масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина -  патент 2337530 (10.11.2008)

Класс A01G7/00 Ботаника, общие вопросы

Патенты РФ в классе A01G7/00:
способ подкормки растений, выращиваемых в защищенном грунте -  патент 2527065 (27.08.2014)
способ выращивания эхинацеи пурпурной в защищенном грунте -  патент 2524085 (27.07.2014)
устройство для магнитно-импульсной обработки растений -  патент 2523162 (20.07.2014)
способ обработки садовых деревьев и винограда для защиты от низких температур и весенних заморозков -  патент 2522522 (20.07.2014)
способ повышения продуктивности яровых одно- и многокомпонентных фитоценозов -  патент 2520683 (27.06.2014)
способ определения потерь массы корнеплодов от механических повреждений -  патент 2520129 (20.06.2014)
способ определения поражения селями горной долины -  патент 2519807 (20.06.2014)
способ фитоиндикации с обеспечением благоприятной обстановки на склоновых землях -  патент 2519716 (20.06.2014)
способ обогащения йодом плодов и ягод -  патент 2519231 (10.06.2014)
способ определения поражения горной долины лавинообразным потоком -  патент 2518447 (10.06.2014)

Класс C12N15/10 способы выделения, получения или очистки ДНК или РНК

Патенты РФ в классе C12N15/10:
дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона -  патент 2528858 (20.09.2014)
способ получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов -  патент 2525136 (10.08.2014)
одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения -  патент 2523596 (20.07.2014)
простой способ экстракции из дрожжей высокополимерной рнк -  патент 2522900 (20.07.2014)
способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин ccl2 (мср-1) человека и набор для его осуществления -  патент 2522801 (20.07.2014)
способ идентификации улучшенных вариантов белка -  патент 2520808 (27.06.2014)
элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах -  патент 2518340 (10.06.2014)
способ мультиплексной детекции представителей родов aeromonas и flavobacterium -  патент 2514668 (27.04.2014)
способ получения неприродных искусственных олигонуклеотидов, потенциально способных образовывать несовершенные g-квадруплексы -  патент 2509802 (20.03.2014)
профилактическая вакцина против вич, основанная на вич-специфических антителах -  патент 2505604 (27.01.2014)

Класс C12N15/11 фрагменты ДНК или РНК; их модифицированные формы

Патенты РФ в классе C12N15/11:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
набор синтетических олигонуклеитидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (rhodiola quadrifida (pall.) fisch. et mey.) -  патент 2526499 (20.08.2014)
способ определения генотипов золотистого стафилококка -  патент 2526497 (20.08.2014)
набор для выявления возбудителя ку-лихорадки в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (пцр-рв) -  патент 2525059 (10.08.2014)
набор последовательностей олигонуклеотидов для диагностики герминальных мутаций в гене ret, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к раку щитовидной железы -  патент 2524433 (27.07.2014)
синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии -  патент 2524431 (27.07.2014)
одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения -  патент 2523596 (20.07.2014)


Наверх