Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы

Классы МПК:C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев
C12N9/30 грибковое происхождение
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-01-30
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 продуцирует мальтогенную штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазу и депонирован в ВКМ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером F-4476D. Штамм создан на основе штамма Aspergillus oryzae ВКМ F-3927D с использованием методов генной инженерии. Изобретение обеспечивает высокий уровень активности мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы. Активность штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы при 120 ч роста штамма составляет 600-640 ед/мл. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве кислой штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы, применяемой в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощных продуктов, изделий из фруктов (соков, сиропов, экстрактов, варений, пектина), детского питания, в текстильной, бумажной промышленности, при производстве моющих средств, а также в медицине.

Изобретение касается создания высокоактивного рекомбинантного штамма гриба Aspergillus oryzae - продуцента мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы.

Штамм создан на основе запатентованного промышленного продуцента кислой штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы - штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D, с использованием методов генной инженерии (1).

Изобретение обеспечивает получение высокоактивных ферментных препаратов штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы в результате глубинного культивирования нового рекомбинантного штамма на мучных ферментационных средах.

штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -Амилаза (штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.1) является ферментом амилолитического действия, относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз, гидролизует внутренние штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -1,4-глюкозидные связи в крахмале, гликогене и родственных им поли- и олигосахаридах, приводя к образованию мальтодекстринов различной молекулярной массы, мальтотриозы, изомальтозы и глюкозы.

Мальтогенная штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилаза А.oryzae (Така-амилаза) эффективно гидролизует амилозу и амилопектин с образованием, главным образом, мальтозы. Роль мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы в процессах биоконверсии крахмалосодержащего сырья в настоящее время значительно возросла в связи с разработкой и реализацией технологии производства топливного этанола из крахмалосодержащего сырья, предусматривающей использование низкотемпературной водно-тепловой обработки с применением высокоактивных и кислотоустойчивых ферментных препаратов штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы и глюкоамилазы. Совместное использование ферментов способствует увеличению скорости и глубины деструкции крахмала, в результате степень гидролиза крахмала достигает 98-99%, при этом эффективность процесса ферментативной обработки может быть значительно повышена за счет применения высокоактивных ферментных препаратов.

В мировой практике для промышленного получения продуктов гидролиза крахмала используют, главным образом, амилазы, образуемые грибами, относящимися к роду Aspergilllus, с желто-зеленым пигментообразованием: Asp.flavus Asp.oryzae, Asp.glauscus, Asp.ochraceusi, Asp.fumigatm.

Известны такие продуценты кислой штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы, как штаммы Asp.oryzae 740-А2 (2), Asp.oryzae НРВ-169 (коллекция Центрального Музея промышленных микроорганизмов «ВНИИГенетика», коллекционный номер ЦМПМ F-257) (3). Также известны штаммы Asp.oryzae 387 (ВКПМ F-683) (4), Asp.oryzae ВКПМ F-369 (5), Asp.awamori М-2002 (ВКМ F-3771D) (6, 7), синтезирующие комплекс гидролитических ферментов, включающий кислую штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазу.

Недостатками всех вышеперечисленных продуцентов являются низкая продуктивность штаммов применительно к кислой штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазе. Высокоактивные продуценты недоступны для организации отечественного производства, поскольку являются собственностью зарубежных фирм-производителей.

Наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Asp.oryzae ВКМ F-3927 D (1), который при культивировании в глубинных условиях в колбах в течение 120 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника муку злаковых культур, кукурузный экстракт и соли, синтезирует штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазу с активностью 400-500 ед/мл.

Однако для повышения рентабельности производства ферментных препаратов штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы требуется создание более продуктивных штаммов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - получение нового штамма-продуцента мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы, способного при культивировании на дешевых технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности целевого фермента.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового рекомбинантного штамма Asp.oryzae Ату Т-52-3-21, содержащего дополнительную копию гена мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы, заключается в получении высокоактивных ферментных препаратов кислой мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы для использования в различных отраслях АПК.

В целях повышения уровня биосинтеза целевых ферментов грибными штаммами в настоящее время успешно применяются технологии рекомбинантных ДНК. Увеличения экспрессии секретируемых ферментов достигают за счет получения штаммов с увеличенным числом копий генов целевых ферментов (т.н. мультикопийных штаммов) или направленного изменения в механизме регуляции синтеза этих ферментов.

Сущность объекта изобретения - новый рекомбинантный штамм Aspergillus oryzae Amy Т-52-3-21 - продуцент мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы.

Создание рекомбинантного штамма на основе мутантного штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D проводили в несколько этапов. На первом этапе с использованием индуцированного мутагенеза был получен ауксотрофный реципиентный штамм Aspergillus oryzae 52-3 niaD-, дефектный по нитратредуктазе, для отбора трансформантов по способности расти на минимальной среде с нитратом натрия в качестве единственного источника азота. На втором этапе реципиентный штамм Aspergillus oryzae 52-3 niaD - котрансформировали плазмидой рАmу-Аmу, несущей ген гомологичной амилазы под амилазным промотором, с плазмидой pSTA10, несущей селективный маркер - ген нитратредуктазы (8). В результате последующей селекции был получен трансформант с уровнем активности на 20-30% выше исходного штамма.

Проводили сравнительную характеристику уровня активности штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы заявляемого рекомбинантного штамма и исходного штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D. Активность штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы определяли согласно ГОСТ 20264.4-89 (9). В таблице 1 представлены данные по биосинтезу штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы исходным мутантным штаммом (прототипом) и рекомбинантным штаммом Asp.oryzae.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 при культивировании на питательной среде на основе пшеничной и соевой муки, обеспечивает высокую активность мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы в культуральной жидкости, что позволяет в значительной степени повысить выход целевого фермента с единицы субстрата и соответственно удешевить процесс производства ферментных препаратов, получаемых на его основе.

Штамм Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-4476D.

Кулыпурально-морфологические признаки штамма Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21

Макроскопические характеристики: Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 25°С имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность пушистая до хлопьевидной, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 37°C имеют диаметр 60-65 мм/7 сут, оливково-желтоватые, поверхность пушистая, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S) при 25°C имеют диаметр колонии 67-71 мм/7 сут, оливково-желтые, поверхность пушистая до клочковатой, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на Мальц-агаре (MEA) при 25°C имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность клочковатая, край ровный; мицелий не очень плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Микроскопические характеристики: Конидиальные головки шаровидные до рыхло колонковидных. Конидиеносцы не окрашены, гладкостенные до слабо шероховатых, 500-1000×10-25 мкм. Везикулы (апикальные расширения) полушаровидные до грушевидных, 22-50 мкм шириной; стеригмы одноярусные и двухъярусные в пределах одной колонии, покрывают от 1/2 до 2/3 поверхности везикулы, метулы - 8-12×4-6 мкм, фиалиды - 8-12×3-5 мкм. Конидии шаровидные, 4,0-8,5 мкм в диаметре, гладкостенные до слабо шероховатых при старении.

Физиолого-биохимические свойства штамма:

Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу. Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: крахмале, штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -глюкане, пектине и галактоманнане.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты.

Температурный оптимум роста 34-35°C, рН 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерии, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Полученный рекомбинантный штамм отличается от исходного наличием в геноме дополнительной копии гена Аmу, кодирующего мальтогенную штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазу (Така-амилазу), что обеспечивает повышенную способность продуцента к биосинтезу штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы при глубинном культивировании на жидких средах и стабильность при пересевах.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Сабуро или Мальц-агаре при +4°C с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца.

Культивирование рекомбинантного штамма Aspergillus oryzae Amy Т-52-3-21 осуществляют в аэробных условиях при температуре 30°C в течение 120 ч, рН среды 5,8-6,2. Для роста культуры и биосинтеза кислой штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, соевая, кукурузная или другая зерновая мука, либо их экстракты, аммонийный азот, кукурузный экстракт.

При культивировании штамма Aspergillus oryzae Amy 7-52-3-21 в течение 120 ч в колбах на среде, содержащей пшеничную и соевую муку, кукурузный экстракт и неорганические соли, активность штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы в культуральной жидкости составляет от 580 до 640 ед/мл.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов (Амилоризин Г10х, Г20х), получаемых осаждением этанолом или другими органическими растворителями из ультрафильтрата культуральной жидкости, а также высушиванием или гранулированием.

штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -Амилаза Asp.oryzae активна при температуре от 30° до 70°C с оптимумом действия при 58-60°; стабильна в широком интервале значений рН - от 3.5 до 8.0, с оптимумом действия при рН 5,0-6,0; в более кислой зоне, характерной для мучных замесов (рН 4,5), проявляет активность на 85-95%; является мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазой, предельная степень гидролиза растворимого и нерастворимого крахмала составляет 38 и 34% соответственно.

Таблица 1
Биосинтез штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы исходным и рекомбинантньп штаммом A.oryzae на ферментационной среде на основе пшеничной муки
ШтаммАС на 120 ч роста, ед/мл
1 Asp.oryzae ВКМ F-3927 D (исходный штамм, прототип) 480
2Asp.oryzae Аmу Т-52-3-21 (рекомбинантный штамм)620

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава: пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН4NO3 - 0,3%, КН2 РO4 - 0,02%, СаСO3 - 1,2%, вода дистиллированная, рН среды 5,8-6,2, в колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 30°C в течение 48 ч.

Полученный посевной материал в количестве 2% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащей 50 мл среды следующего состава (мас.%): пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН4NO3 - 0,3%, КН2 РO4 - 0,02%, СаСO3 - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Среду предварительно обрабатывают ферментным препаратом бактериальной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы из расчета 2 ед/г крахмала при 70°C в течение 20 мин.

Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 30°C.

Максимальная ферментативная активность штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы (120 ч роста) составляет 640 ед/мл.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава (масс.%): кукурузный крахмал - 10%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН4NO3 - 0,3%, КН2РO4 - 0,02%, СаСO3 - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Максимальные ферментативная активность термостабильной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы (120 ч роста) составляет 600 ед/мл.

Источники литературы

1. Патент РФ № 2245364 от 27.01.2005.

2. Калунянц К.А. и Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. М., Пищевая промышленность, 1979, с.8-9.

3. Авторское свидетельство SU № 1158579.

4. Патент РФ № 2070921 от 27.12.1996.

5. Авторское свидетельство SU № 1440922.

6. Патент РФ 2196821 от 20.01.2003.

7. Семенова М.В. и др. Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК/ - М.: ВНИИПБТ, 2006. 304 с.

8. Gomi et al. Molecular cloning and characterization of a transcriptional activator gene, amyR, involved in the amylolytic gene expression in Aspergillus oryzae. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64(4). P. 816-827.

9. Препараты ферментные. ГОСТ 20264-4.89.-М.:Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. С.70.

Аналогичные патенты РФ

1. Патент РФ № 2196821 от 20.01.2003.

2. Патент РФ № 2245364 от 27.01.2005.

3. Патент РФ № 2354697 от 10.05.2009.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmy Т-52-3-21 - продуцент мальтогенной штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной   альфа-амилазы, патент № 2514224 -амилазы, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под № ВКМ F-4476D.


Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/14:
ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля -  патент 2527899 (10.09.2014)
питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала -  патент 2527074 (27.08.2014)
способ восстановления чувствительного слоя биосенсора -  патент 2524438 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы -  патент 2511427 (10.04.2014)
способ получения грибной белковой биомассы -  патент 2511041 (10.04.2014)
мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение -  патент 2507252 (20.02.2014)
способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 -  патент 2503715 (10.01.2014)
способ получения кератиназы из penicillium citrinum -  патент 2499833 (27.11.2013)

Класс C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев

Патенты РФ в классе C12N15/00:
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
рекомбинантная днк, кодирующая гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (g-csf) и рекомбинантная плазмида рas017, обеспечивающая синтез g-csf в клетках escherichia coli -  патент 2529363 (27.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона -  патент 2528858 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)

Класс C12N9/30 грибковое происхождение


Наверх