ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки

Классы МПК:C07C215/90 с четвертичными аммониевыми группами, связанными с углеродным скелетом
C07C211/63 с четвертичными атомами азота, связанными с ациклическими атомами углерода
A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах  1/00
A61K47/18 амины; четвертичные аммониевые соединения
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) (RU),
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук (ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН) (RU),
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-03-01
публикация патента:

Изобретение относится к cредству доставки ДНК в клетки, представляющему собой производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества (ГПАВ) формулы:

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

где m=4, 6, 12. Указанные соединения являются новыми низкотоксичными соединениями, обеспечивающими эффективную доставку ДНК в эукариотические клетки, и могут быть использованы для терапевтического лечения путем внутриклеточной доставки генов многих человеческих болезней. 6 ил., 1 табл., 13 пр.

Рисунки к патенту РФ 2513726

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

Изобретение относится к ряду химических соединений, а именно к алкиламмонийным геминальным поверхностно-активным веществам (ГПАВ) формулы (I),

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

где m=4, 6, 12, обеспечивающих эффективную доставку ДНК в клетки.

Данные соединения являются электролитами и диссоциируют в воде с образованием мицеллообразующего иона, имеющего заряд +2, создаваемого двумя положительно заряженными атомами азота, и двух противоионов: бромид-анионов.

Генная терапия имеет значительный потенциал для терапевтического лечения путем внутриклеточной доставки генов многих человеческих болезней, которые в настоящее время считаются неизлечимыми. Вирусные векторы на основе аденовирусов или ретровирусов очень эффективны в доставке генов. Тем не менее развитие способов доставки ДНК в эукариотические клетки без применения вирусных векторов остается очень актуальным из-за возможности использовать только целевые последовательности ДНК и существенно более низкого риска отдаленных осложнений.

В качестве альтернативы вирусным векторам для доставки ДНК в клетки используются разнообразные катионные полимеры и структуры, такие как полиэтиленимин [Bagnacani V. et al. Macrocyclic nonviral vectors: high cell transfection efficiency and low toxicity in a lower rim guanidinium calix[4]arene. Org Lett. 2008; 10 (18), 3953-6], поли (L-лизин) [Baldini L. et al. Calixarene-based multivalent ligands, Chem Soc Rev. 2007, 36 (2), 254-66], полиамидоамин дендример [Sun X. et al. Cationic polymer optimization for efficient gene delivery. Mini Rev Med Chem. 2010, 10 (2), 108-25] и катионные липосомы [V. Geromel et al. Mitochondria Transfection by Oligonucleotides Containing a Signal Peptide and Vectorized by Cationic Liposomes, Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 2001, 11 (3), 175-180]. Эти катионные агенты связываются с ДНК посредством электростатических взаимодействий и формируют комплексы наночастиц [Won Y.W. et al. Intracellular organdie-targeted non-viral gene delivery systems, J Control Release. 2011, 152 (1), 99-109]. В результате ДНК становится защищенной от деградации нуклеазой, в то же время катионные агенты являются посредником при проникновении в клетку и последующем освобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции.

В литературе есть данные о трансфекции ДНК в присутствии монокатионных ПАВ - цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) и цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромида (ЦГАБ) [Mel'nikov S.M. et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2401], [Mel'nikov, S.M. Et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9951], [Clamme, J. P. et al. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1467, 347], [Pinnaduwage, P. et al. Biochim. Biophys. Acta 1989, 985, 33], [Antara Dasgupta et al. J. Phys. Chem. B, Vol.111, No.29, 2007], которые являются монокатионными структурными аналогами заявляемых соединений и выбраны нами в качестве соединений сравнения.

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

К недостаткам использования вышеуказанных ПАВ в качестве средств доставки ДНК в клетки можно отнести (1) значительно более высокие величины критических концентраций мицеллообразования и более низкий поверхностный потенциал, что требует более высоких концентраций ПАВ для достижения сравнимых эффектов компактизации ДНК и перезарядки комплексов ПАВ/ДНК; (2) пониженную трансфекцию ДНК.

В литературе также имеются данные о применении в качестве трансфектантов геминальных ПАВ [Jagbir Singh et al. Current drug delivery, 2011, 8 (3), 299-306], [Peng Yang et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 75 (2010) 311-320], [Marianna Foldvari et al., J. Experimental Nanoscience, 1, No.2, 2006, 165-176], [Cecilia Bombelli et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 6274-6278]. Однако в описанных примерах трансфекция ДНК в клетки животных достигается только при использовании смеси ПАВ с липидами, а в некоторых случаях еще и при добавлении производных полиэтиленгликоля. Существенным моментом является также то, что независимо от соотношения геминальное ПАВ-липид именно липиды являются структурообразующим компонентом: во всех приведенных источниках рассматриваются липосомы и везикулы, которые формируются по специальной методике в системах в присутствии липидов.

Задачей изобретения является создание новых эффективных средств доставки ДНК в эукариотические клетки, используемых в чистом виде (без вспомогательных агентов) и расширяющих арсенал известных средств указанного назначения.

Поставленная задача решается применением геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) формулы (I) с гидроксиэтилированной алкиламмонийной головной группой в качестве средств доставки ДНК в клетки.

Для сравнительного описания свойств ГПАВ, являющихся предметом изобретения, получены репрезентативные данные как для заявляемых соединений (3-5), различающихся между собой длиной спейсерного фрагмента (значением m), так и для незамещенных аналогов (1) и (2), где отсутствует гидроксиэтилированный фрагмент в головной группе.

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

m=4 (соединение 3)

m=6 (соединение 4)

m=12 (соединение 5)

Синтез геминальных алкиламмонийных ПАВ

Алканедил-производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 -бис(метилдиалкиламмоний бромиды) получают кипячением в ацетоне смеси 2.2 моля метилдиалкиламина, в том числе содержащего гидроксиэтильную группу у атома азота, и 1.0 моля соответствующего производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 ,производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 -дибромалкана в течение 40-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, перекристаллизуют из смеси растворителей ацетон/метанол и высушивают в вакууме. Строение полученных соединений было подтверждено данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскопии.

Пример 1. Гексанедил-1.6-бис(диметилгексадециламмоний бромид) (1)

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями гексадецилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.

1Н ЯМР (CDCl 3, производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N+ CH2 (CH2)13CH2CH3 , J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 52Н, 2х N+ CH2 (CH2)13CH2CH3 ] 1.60 [с, 4Н, 2х N+ CH2(CH2 )13CH2CH3] 1.72-2.03 (м, 8Н, N+CH2(CH2) 4CH2N+) 3.39 [с, 12Н, 2х N+ (CH3)2] 3.45-3.56 [м, 4Н, 2х N +CH2(CH2)13CH 2CH3N+CH2 sp.] 3.73-3.77 (м, 4Н, 2х N+CH2sp.)

ИК-спектр (KBr), производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 /см-1: 2950, 2919, 2851, 1467, 1402, 1363, 1351, 1122, 1060, 974, 949, 900, 722.

Выход (84%). Формула: C42H90N2Br2. Вычислено (%): С 64.43, Н 11.58, N 3.58. Найдено (%): С 33, H 11.88, N 3.53.

Пример 2. Гексанедил-1.6-бис(диметилдециламмонимй бромид) (2)

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями децилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.

1Н ЯМР (CDCl3 , производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N+CH2 (CH2)7CH2CH3 , J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 28Н, 2х N+СН2 (СН2)7СН2СН3 ] 1.59 [с., 4Н, 2х N+СН2(CH2 )7CH2CH3] 1.72-2.01 (м, 8Н, N+CH2(CH2)4 CH2N+) 3.38 [с, 12Н, 2х N+( CH3)2] 3.46-3.56 [м, 4Н, 2х N+ СН2(СН2)7СН2 СН3] 3.72-3.76 (м., 4Н, 2х N+CH 2sp.)

ИК-спектр (KBr), производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 /см-1: 2953, 2922, 2853, 1485, 1467, 1401, 1377, 1128, 1062, 948, 898, 806, 724.

Выход (95%). Формула: C30H66N2Br2. Вычислено (%): С 58.62, Н 10.82, N 4.56. Найдено (%): С 58.31, Н 10.58, N 4.36.

Пример 3. Бутанедил-1.4-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (3)

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 ,производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 -дибромбутана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

1Н ЯМР (CDCl3, производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , м.д.; J, Гц): 0.89 [т. 6Н, 2х N+ СН2 (CH2)13CH2CH3 , J=6.75] 1.27-1.36 [уш.м., 52Н, 2х N+ СН2 (СН2)13СН2СН3 ] 1.75 (с., 4Н, 2х N+ CH2(CH2 )13CH2CH3] 2.12 (с., 4Н, N+CH2(CH2)2 CH2N+) 3.27 (с, 6Н, 2х N+ CH3) 3.43-3.88 (м., 12Н, 2х N+CH 2)3 4.12 (с., 4Н, 2х CH2CH 2OH) 5.0 (с., 2Н, 2х CH2CH2O H).

ИК-спектр (KBr), производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 /см-1: 3264, 2959, 2920, 2851, 1469, 1404, 1378, 1101, 1085, 1055, 721.

Выход (83%). Формула: C 42H90O2N2Br2 . Вычислено (%): С 61.89, Н 11.13, N 3.43. Найдено (%): С 61.72, Н 11.62, N 3.27.

Пример 4. Гексанедил-1.6-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (4)

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 ,производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 -дибромгексана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

1Н ЯМР (CDCl3, производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N+ CH2 (CH2)13CH2CH3 , J=6.97] 1.27-1.367 [уш.м., 52Н, 2х N+ СН2 (СН2)13СН2СН3 ] 1.57 (с, 4Н, 2х N+ СН2(СН2 )13СН2СН3] 1.73-1.98 (м, 8Н, N+CH2(CH2) 4CH2N+) 3.31 (с, 6Н, 2х N+ CH3,) 3.50-3.73 (м, 12Н, 2х N+ CH2)3 4.11 (с, 4Н, 2х CH2 CH2OH) 5.06 (с, 2Н, 2х CH2CH 2OH).

ИК-спектр (KBr), производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 /см-1: 3227, 2918, 2850, 1468, 1377, 1095, 1058, 721.

Выход (87%). Формула: C44H 94O2N2Br2. Вычислено (%): С 62.70, Н 11.16, N 3.33. Найдено (%): С 62.85, Н 11.73, N 3.35.

Пример 5. Додеканедил-1.12-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (5)

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 ,производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 -дибромдодекана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

1Н ЯМР (CDCl3, производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 , м.д.; J, Гц): 0.85 [т, 6Н, 2х N+CH2 (CH2)13CH2CH3 , J=7.13] 1.23-1.34 {уш.м., 68Н, [52Н, 2х N+CH 2(CH2)13CH2CH 3+16H, (CH2)8sp.]} 1.71 {с, 8Н [4Н, 2х N+CH2(CH2)13 CH2CH3+4Н, 2х N+CH 2CH2sp.]} 3.27 (с, 6Н, 2x N+ CH3) 3.45-3.51 [м, 8H, 2x N+( CH2)2] 3.65 (с, 4Н, 2х N+ CH2CH2OH) 4.07 (с, 4Н, 2х N +CH2CH2OH) 5.06 (с, 2Н, 2х N+CH2CH2OH).

ИК-спектр (KBr), производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 /см-1: 3261, 2919, 2850, 1469, 1379, 1085, 1053, 720.

Выход (92%). Формула: C50H 106O2N2Br2. Вычислено (%): С 64.75, Н 11.52, N 3.02. Найдено (%): С 64.42, Н 11.17, N 3.05.

Биологическая активность (цитотоксичность, доставка ДНК в клетки)

Пример 6. Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии 293Т

Цитотоксичность определяли с помощью 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ реагента). Культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета за день до определения цитотоксичности из расчета получить на следующий день 50-70% монослоя. За час до добавления МТТ-реагента клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в фосфатно-солевом буфере (ФСБ×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10-3, 10-2, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору плазмидной ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0.6 мкг плазмидной ДНК в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. Параллельно к клеткам добавляют индивидуальные вещества без ДНК в соответствующем количестве. По истечении 48 часов инкубации с соединениями к пробам добавляют по 20 мкл р-ра МТТ (5 мг/мл). После 3 часов инкубации с МТТ удаляют среду из лунок, стараясь не затрагивать кристаллы, растворяют кристаллы формазана в 200 мкл ДМСО. Далее определяют оптическую плотность на приборе Тесал Sunrise Basic при длине волны 492 нм с вычитанием фона. По полученным данным определяется CD50 (концентрация соединения, при которой гибнет 50% популяции клеток). На диаграмме Фиг.1 представлены результаты определения цитотоксичности потенциальных трансфектантов методом МТТ-теста.

Штриховкой отмечены данные, соответствующие пробам ДНК+ исследуемые соединения, ромбами - пробы только с исследуемыми соединениями.

Как видно из диаграммы, заявляемые соединения (3-5) в комплексах с ДНК проявляют цитотоксичность, сравнимую с незамещенными аналогами (1) и (2). Все исследуемые соединения с ДНК оказывают менее токсичное воздействие на клетки, чем без ДНК. Полученные концентрации, при которых наблюдается 50% гибель клеток, оказываются ниже, чем требуется для эффективной доставки ДНК.

Пример 7. Проведение трансфекции с помощью соединения (5)

Монослойную культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку за день до трансфекции из расчета получить на следующий день конфлуэнтность 50-70%. Для трансфекции НЕК293Т используют концентрацию 50-100 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета. За час перед трансфекцией клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Трансфекции проводят также в 96-луночном планшете, эксперименты проводят в тройном повторе. Сначала делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в ФСБ (×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10-3, 10-2, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0,6 мкг плазмидной ДНК peGFP-N1 (Clontech) в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. На следующие сутки флуоресценцию популяции клеток в планшете наблюдают на флуоресцентном микроскопе с обращенной оптикой. Через 48 часов после трансфекции проводят анализ методом проточной цитометрии, как описано далее. Получив результаты о предварительной функциональности новых соединений как трансфектантов, проводят оптимизацию соотношения количества трансфектанта к количеству плазмидной ДНК вблизи значений, при которых наблюдается максимальная трансфекционная эффективность. Используемый шаг в выбранном диапазоне составляет последовательное двукратное увеличение концентрации. Также оптимизируют продолжительность инкубации клеток с трансфекционной смесью и возможность комбинирования трансфекции. Оптимальное время инкубации с трансфектантом составляет 4 часа, по истечении которых среду в клетках меняют на полную среду DMEM с сывороткой и антибиотиком.

Определение эффективности трансфекции клеток методом проточной цитометрии

В исследовании степени трансфекции клеток используют метод проточной цитометрии. Каждую лунку планшета с клетками после инкубации с экспериментальными препаратами в течение 48 часов отмывают 200 мкл ФСБ (×1), обрабатывают трипсином, определяют цитотоксичность и фиксируют в 0,5% формалине. В полученной таким образом клеточной суспензии определяют методом проточной цитометрии процент клеток, экспрессирующих eGFP. Эта величина является мерой эффективности трансфекции. Клетки, инкубируемые без экспериментальных препаратов при тех же условиях, используют в качестве отрицательного контроля. Для сравнения проводится измерение процента eGFP положительных клеток, трансфицированных с помощью коммерческого препарата Metafectene easy по протоколу, предлагаемому производителем (Biontex, EU). Далее из полученных данных рассчитывают процент флуоресцентных клеток с использованием программы FACS Diva («Becton Dickinson», США), средние значения и стандартные отклонения для популяций. Результаты представляют как среднее значение и ошибку среднего для анализируемого соединения.

Микрофотография культуры трансфицированных клеток в флуоресцентном свете и данные эффективности трансфекции представлены на фигуре 2. Для соединения (5) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 52±10% при концентрации 0.01 мг/мл (11 мкмоль/л). Эта рабочая концентрация ниже уровня CD50 (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.

Пример 8. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦТАБ

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦТАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне контроля.

Пример 9. Проведение трансфекции с помощью соединения (1)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (1). Полученные результаты представлены на фигуре 3.

Для соединения (1) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±1.2% при концентрации 0.01 мг/мл (130 мкмоль/л).

Пример 10. Проведение трансфекции с помощью соединения (2)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (2). Полученные результаты представлены на фигуре 4.

Для соединения (2) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 1.6±0.6% при концентрации 0.1 мг/мл (160 мкмоль/л).

Сравнение результатов по исследованию трансфекции при помощи соединений (2) и (1) показывает, что увеличение гидрофобности (длины алкильного радикала) существенно улучшает эффективность трансфекции (процент трансфицированных клеток). Аналогичная корреляция прослеживается и для гидроксиэтилированных ГПАВ. Поэтому в качестве заявляемых соединений предлагаются наиболее активные гексадецильные производные (3-5)

Пример 11. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦГАБ

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦГАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне негативного контроля.

Пример 12. Проведение трансфекции с помощью соединения (3)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (3). Полученные результаты представлены на фигуре 5.

Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 32±5% при концентрации 0.01 мг/мл (25 мкмоль/л). Таким образом, эта рабочая концентрация ниже уровня CD50 (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.

Пример 13. Проведение трансфекции с помощью соединения (4)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (4). Полученные результаты представлены на фигуре 6.

Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±0.2% при концентрации 0.1 мг/мл (120 мкмоль/л).

Данные эффективности трансфекции по результатам проточной цитометрии клеток НЕК293Т через 48 часов после трансфекции объединены в таблице 1.

Таблица 1
СоединениеКонц., мг/мл % GFP(+)Среднее значение Станд. Откл.Конц., мкмоль/л
10.001 11.21.4 1.20.21
10.01 3.64.84.1 4.20.6 13
10.1 7.26.6 4.96.21.2 128
1 12.9 4.62.73.4 1.0640
20.001 0.210.6 0.60.42
20.005 0.60.90.5 0.70.2 7
20.01 0.61.5 21.40.7 13
20.1 1.22.3 1.21.60.6 163
3 0.00128 303731.7 4.73
30.01 181012 13.34.225
30.1 56.2 3.75.01.3 250
3 18.2 5.110.17.8 2.52500
40.2 4.865.8 5.50.6238
40.1 6.16.1 6.46.20.2 119
4 0.054.4 6.26.35.6 1.159
50.002 0.610.6 0.80.32.3
50.004 4437 5043.76.5 5.5
5 0.0152 416151.3 10.011
50.02 6.985 6.61.522
ЦТАБ0.001-0.1 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 0производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726
ЦГАБ 0.001-0.1производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 0производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726 производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

Данные табл.1 показывают, что

1. Гидроксиэтильные геминальные ПАВ проявляют более высокую трансфекционную эффективность при более низких концентрациях, чем соединения сравнения (монокатионные ПАВ ЦТАБ и ЦГАБ и незамещенные геминальные аналоги (1) и (2).

2. Среди заявляемых соединений наиболее высокий процент трансфицированных клеток получен для соединений (3) (m=4) и (5) (m=12).

3. Даже незначительное изменение структуры заявляемых ПАВ (изменение количества метиленовых звеньев в спейсере) приводит к значительному, в 5-9 раз, изменению эффективности трансфекции.

Таким образом, заявляемые гидроксиэтильные производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества обладают способностью эффективно доставлять ДНК в клетки без вспомогательных агентов и низкой токсичностью.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Средство доставки ДНК в клетки, представляющее собой производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества формулы:

производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного   вещества, обеспечивающие эффективную доставку днк в клетки, патент № 2513726

где m=4, 6, 12.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2513726

patent-2513726.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07C215/90 с четвертичными аммониевыми группами, связанными с углеродным скелетом

Класс C07C211/63 с четвертичными атомами азота, связанными с ациклическими атомами углерода

Патенты РФ в классе C07C211/63:
устойчивые и стабильные при хранении солевые кластеры соли аммония и минеральной соли с анионами двухосновных кислот и способ их получения -  патент 2417217 (27.04.2011)
конъюгат хризофанола, способ его получения, применение его в качестве лекарственного средства для лечения диабетической нефропатии, спаек кишок, остеоартрита -  патент 2416596 (20.04.2011)
1-дезокси-1-n-метиламмония-d-глюцитола сукцинат -  патент 2345060 (27.01.2009)
n-[алкилфеноксиполи(этиленокси)карбонилметил]морфолиний хлориды, обладающие свойствами ингибиторов асфальтосмолопарафиновых отложений, и способ их получения -  патент 2322435 (20.04.2008)
способ получения водного раствора n,n-диметилдиаллиламмонийхлорида -  патент 2321578 (10.04.2008)
способ получения дидецилдиметиламмония бромида -  патент 2313516 (27.12.2007)
способ получения полиморфной формы гидрохлорида сертралина -  патент 2310647 (20.11.2007)
способ получения гидрохлорида 2-(1-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептана -  патент 2307827 (10.10.2007)
антистатик для стекловолокон и способ его получения -  патент 2301223 (20.06.2007)
способ получения бикарбонатов четвертичного аммония и карбонатов четвертичного аммония (варианты) -  патент 2299193 (20.05.2007)

Класс A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах  1/00

Патенты РФ в классе A61P43/00:
улучшение памяти у пациентов с оценкой 24-26 баллов по краткой шкале оценки психического статуса -  патент 2529815 (27.09.2014)
способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
способ лечения ран мягких тканей различной этиологии -  патент 2528905 (20.09.2014)
хиназолиноны как ингибиторы пролилгидроксилазы -  патент 2528412 (20.09.2014)
новый агонист бета рецептора тиреоидного гормона -  патент 2527948 (10.09.2014)
стабильная жидкая фармацевтическая композиция комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината, обладающая антигипоксическим, антиоксидантным и адаптогенным действием -  патент 2527347 (27.08.2014)
четырехзамещенные бензолы -  патент 2527177 (27.08.2014)
способ коррекции негативных эффектов низких температур на предстательную железу крыс -  патент 2527172 (27.08.2014)
способ модулирования биологических функций, ассоциированных с процессом старения пожилого или старого животного-компаньона. -  патент 2525617 (20.08.2014)
гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты), способ получения гомографта, среда для воздействия на ткани гомографта (варианты) -  патент 2525197 (10.08.2014)

Класс A61K47/18 амины; четвертичные аммониевые соединения

Патенты РФ в классе A61K47/18:
лекарственные средства, содержащие фторхинолоны -  патент 2527327 (27.08.2014)
фотосенсибилизатор и способ его получения -  патент 2523380 (20.07.2014)
композиция в качестве бактерицидного и антифунгального средства (варианты) и макропористый бактерицидный материал на ее основе -  патент 2522986 (20.07.2014)
стабильная готовая к применению композиция парацетамола для инъекций -  патент 2519764 (20.06.2014)
лекарственные формы инсулина, обладающие быстрым усвоением -  патент 2506945 (20.02.2014)
фармацевтическая композиция для модифицированного высвобождения -  патент 2495666 (20.10.2013)
лиофилизированный препарат, содержащий гриппозную вакцину, и способ его получения -  патент 2484847 (20.06.2013)
фармацевтическая композиция для лечения артериальной гипертензии и застойной сердечной недостаточности и способ ее получения -  патент 2479310 (20.04.2013)
состав, содержащий никотин, с покрытием для перорального применения с буферными свойствами, приданными аминокислотой -  патент 2476221 (27.02.2013)
носитель лекарственного средства -  патент 2476204 (27.02.2013)


Наверх