штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов

Классы МПК:C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их
A61K35/76 вирусы
G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов
Автор(ы):, , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии наук медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-09-18
публикация патента:

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187. Штамм обладает стабильной репродуктивной активностью. Инфекционный титр составляет 6 lg ТЦД 50. Штамм является моделью для изучения антивирусной активности химиопрепаратов нового поколения, а также для создания вакцинных препаратов. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа   а для диагностических и вакцинных препаратов, патент № 2513693

Формула изобретения

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 субтипа А для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

Проблема ВИЧ-инфекции до сих пор остается одной из серьезных мировых проблем. Миллионы людей в мире уже инфицированы ВИЧ, и каждую минуту происходит новое заражение вирусом. В нашей стране эта проблема, к сожалению, тоже актуальна. Свыше 80% ВИЧ-инфицированных составляют лица от 30 до 40 лет, то есть речь идет о нетрудоспособности огромного числа лиц трудоспособного возраста [1]. В итоге данная проблема из разряда медицинской переходит в разряд социальной. В связи с этим создание вакцины против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) является актуальной проблемой. В настоящее время в ряде стран проводятся испытания вакцинных препаратов, созданных на основе изолятов ВИЧ-1, относящися к субтипу Е, доминирующего на Африканском континенте и Азии, и на основе изолятов ВИЧ субтипа В, преобладающего в Европе и Северной Америке [2, 3]. Однако для территории РФ характерен вариант ВИЧ, относящийся к субтипу А, поэтому для разработки диагностических и вакцинных препаратов и изучения химиопрепаратов нового поколения необходимо использовать штамм ВИЧ-1 именно данного субтипа [4, 5].

Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу А, доминирующему в настоящее время на большей части территории РФ.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 субтипа А для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1187 от 01.07.11 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1, хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИД, не получавшего антиретровирусную терапию. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция

Штамм ВИЧ-1 ИВ-742 обладает высокой репродуктивной активностью и реплицируется в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитеобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИДом [6]. Продуктивная активность штамма составляет 6,0 Ig ТЦД50 и сопоставима с инфекционным титром штамма-аналога (таблица 1).

Антигенные свойства

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюресценция. Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИДом, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 45-50% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41, 31, 24, 17 кД (таблица 2).

Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном ро1, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC) подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу А.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по цитопатическому действию

Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Сравнительный анализ показал, что инфекционные титры штамма ИВ742 сопоставим с инфекционным титром штамма-аналога LAV, что свидетельствует об их сходной активности. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Пример 2. Диагностика антител к ВИЧ-1 методом иммуноблота

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 8 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащих анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВ742 и штамм-аналог LAV. Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип) с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1 фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин), и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-1 вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.

Результаты исследований представлены в таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ742 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.

Пример 3. Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по уровню антигена вируса (р24)

Определение уровня вирусного антигена в вируссодержащей жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) на 96-луночных панелях. В лунки, в которые предварительно был внесены исследуемые образцы, добавляли конъюгат, содержащий биотилинированные поликлональные антитела к р24 ВИЧ-1. После инкубации в течение 1 часа при 37°С панель отмывали трис-солевым буфером и вносили стрептавидин-пероксидазный конъюгат. Проводили инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре отмывали панель трис-солевым буфером и затем для визуализации реакции добавляли тетраметилбензидин (ТМБ). После инкубации в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре в лунки для остановки реакции вносили 1 н. серную кислоту. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм. За положительный контроль принимали не менее чем 3-кратное превышение оптической плотности по сравнению с таковым показателем неинфицированной клеточной линии.

Результаты исследований представлены в Таблице 3. В результате проведенных исследований установлено, что штамм ИВ 742 не уступает по уровню выработки антигена ВИЧ-1, штамму-аналогу LAV и обладает высокой репродуктивной активностью, что позволяет успешно инфицировать им лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Источники информации

1. Постановление от 13.02.2012 № 6 «О неотложных мерах по противодействию распространения ВИЧ-инфекции в Российской Федерации».

2. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.5L. - P.229-240.

3. Kathy Stover. "In Thailand Clinical Study, HIV Vaccine Regimen Demonstrates Modest Preventive Effect." Medical News Today. MediLexicon, Intl., 25 Sep. 2009. Web. 22 Jun. 2012. http://www.medicalnewstoday.com/releases/165277.php

4. Bobkov A.F., Kazennova E.V., Selimova L.M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. - 2004. - V.74. - P.191-196.

5. Nosik M., Ryzhov К., Kravtchenko A. et al. Genotypic Analyses of HIV in antiretroviral drug-naive patients from Moscow and Moscow Region, Russia // 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 17-20 July 2011, Rome, Italy, Abs.CDA002.

6. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.

Таблица 1
Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 на модели клеток МТ-4 и Jurkat
Титр, Ig ТЦД50Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток МТ-4)Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток Jurkat)
LAVИВ742LAV ИВ742
6,0 6,06,0 6,0

Таблица 2
Исследование штамма ИВ742 методом иммуноблота
Вирусный антигенВыявленные антитела
Контроль (LAV) 16012065 5553 413124 17
ИВ742 16012065 5553 413124 17

Таблица 3
Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ742 по уровню антигена вируса (р24)
Контроль клетокШтаммы ВИЧ-1
Контроль (LAV) ИВ735
0,159* 2,9612,955
* оптическая плотность

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2513693

patent-2513693.pdf

Класс C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их

холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
штамм "г 244/11" вируса блютанга 14 серотипа для вирусологических исследований, изготовления вакцинных и диагностических препаратов -  патент 2528057 (10.09.2014)
флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование -  патент 2527891 (10.09.2014)
поликатионное соединение "тривирон (triviron)" и способ его получения -  патент 2527256 (27.08.2014)
аттенуированный рекомбинантный парвовирус, пригодный для защиты собак от инфицирования парвовирусом -  патент 2527157 (27.08.2014)
кодон-оптимизированная кднк, кодирующая дисферлин человека, генно-инженерная конструкция, рекомбинантный аденовирус и фармацевтическая композиция для лечения дисферлинопатий -  патент 2527073 (27.08.2014)
вакцина против ящура типа а инактивированная сорбированная -  патент 2526570 (27.08.2014)
способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов -  патент 2526504 (20.08.2014)
способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины -  патент 2526494 (20.08.2014)
набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени -  патент 2525938 (20.08.2014)

Класс A61K35/76 вирусы

кодон-оптимизированная кднк, кодирующая дисферлин человека, генно-инженерная конструкция, рекомбинантный аденовирус и фармацевтическая композиция для лечения дисферлинопатий -  патент 2527073 (27.08.2014)
способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов -  патент 2526504 (20.08.2014)
способ получения бактериофага -  патент 2525141 (10.08.2014)
способ оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы -  патент 2522483 (20.07.2014)
аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними -  патент 2520823 (27.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2520813 (27.06.2014)
композиция антибактериальная, штамм бактериофага escherichia coli, используемый для получения такой композиции. -  патент 2518303 (10.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513692 (20.04.2014)
способ лечения обострений хронического ларингита -  патент 2510757 (10.04.2014)
видоспецифический вирулентный штамм бактериофага, обладающий литической активностью в отношении staphylococcus aureus, включая мультирезистентные штаммы -  патент 2503716 (10.01.2014)

Класс G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов

способ прогнозирования риска развития инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с внутриматочной патологией после гистероскопии -  патент 2526163 (20.08.2014)
штамм вируса гриппа a/pochard/siberia/249/08-ma h10n7-субтипа для получения антиген-содержащего диагностического препарата и диагностической поликлональной сыворотки, применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе пцр и для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo -  патент 2522813 (20.07.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2520813 (27.06.2014)
иммуногенные белки streptococcus -  патент 2518315 (10.06.2014)
способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат -  патент 2518249 (10.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513692 (20.04.2014)
штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка ovis aries, используемый для вирусологических исследований -  патент 2507255 (20.02.2014)
штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка sus scrofa, используемый для вирусологических исследований -  патент 2506310 (10.02.2014)
способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления legionella pneumophila 1,3 и 6 серогрупп (варианты) -  патент 2505819 (27.01.2014)
способ определения антител к mycobacterium leprae -  патент 2500423 (10.12.2013)
Наверх