антитело к эритропоэтину человека (варианты) и продуцирующий моноклональное антитело к эритропоэтину штамм гибридомы

Формула изобретения

1. Химерное рекомбинантное антитело, специфически связывающееся с эритропоэтином человека, характеризующееся следующими признаками:

A) Kd=2,4×10^-9 М, изоэлектрическая точка в диапазоне рН 7,5-8,0;

Б) последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:12;

B) последовательность легкой цепи SEQ ID NO:14.

2. Штамм гибридомы мышей, являющийся продуцентом моноклонального антитела к эритропоэтину человека, депонированный в СХЖ РАСХН под № 84.

3. Мышиное моноклональное антитело, специфически связывающееся с эритропоэтином человека, продуцируемое гибридомой по п.2 и характеризующееся следующими признаками:

A) Kd=0,95×10^-9 М, молекулярный вес = 160 кД, изоточка в диапазоне рН 6,8-7,1;

Б) последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:1;

B) последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:2;

Г) последовательности участков, определяющих комплементарность антитела:

CDRH-1 - SEQ ID NO:5, CDRH-2 - SEQ ID NO:6, CDRH-3 - SEQ ID NO:7, CDRL-1 - SEQ ID NO:8, CDRL-2 - SEQ ID NO:9, CDRL-3 - SEQ ID NO:10.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению антител к эритропоэтину человека, и может быть использовано для его очистки.

Уровень техники

Эритропоэтин является основным регулятором эритропоэза и стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников. При патологиях почек и на поздних стадиях ряда онкологических заболеваний его синтез снижается, что приводит к тяжелым анемическим состояниям. Дефицит эритропоэтина компенсируют введением рекомбинантного эритропоэтина, который производят с использованием генно-инженерных технологий. Для получения лекарственных препаратов рекомбинантный эритропоэтин человека, полученный в результате культивирования клеток-продуцентов, подвергают очистке, которая может включать стадию иммунохроматографии с помощью иммобилизованных моноклональных антител к эритропоэтину.

Известны моноклональные антитела к эритропоэтину (US 4558005 А, 10.12.1985; ЕР 0116446 В1, 22.08.1990; RU 2151184 C1, 20.06.2000; RU 2145610 C1, 20.02.2000, RU 2451071 C1, 02.05.2012). Указанные антитела могут применяться при очистке эритропоэтина, однако все они являются мышиными.

Применение мышиных моноклональных антител для очистки эритропоэтина имеет два недостатка, заключающихся в потенциальной возможности контаминации препарата эритропоэтина вирусами мышиного происхождения, а также в возможности развития иммунного ответа на мышиные антитела или их фрагменты, которые могут контаминировать препарат эритропоэтина вследствие протеолиза используемых для его очистки иммобилизованных антител.

Таким образом, существует необходимость в создании улучшенных антител к эритропоэтину.

Сущность изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является получение рекомбинантного антитела к эритропоэтину, в частности химерного (мышь-человек) антитела.

Данная задача решена тем, что предложено химерное рекомбинантное антитело, специфически связывающееся с эритропоэтином человека, характеризующееся следующими признаками:

A) Kd=2,4×10^-9 М, изоэлектрическая точка в диапазоне рН 7,5-8,0;

Б) последовательность тяжелой цепи Seq ID NO:12;

B) последовательность легкой цепи Seq ID NO:14.

Предложен также штамм гибридомы мышей, являющийся продуцентом моноклонального антитела к эритропоэтину человека, депонированный в СХЖ РАСХН под № 84, и мышиное моноклональное антитело, специфически связывающееся с эритропоэтином человека, продуцируемое этой гибридомой, характеризующееся следующими признаками:

A) Kd=0,95×10 ^-9 М, молекулярный вес = 160 кД, изоточка в диапазоне рН 6,8-7,1;

Б) последовательность вариабельной области легкой цепи Seq ID NO:1;

B) последовательность вариабельной области тяжелой цепи Seq ID NO:2;

Г) последовательности участков, определяющих комплементарность антитела:

CDRH-1 - Seq ID NO:5, CDRH-2 - Seq ID NO:6, CDRH-3 - Seq ID NO:7,

CDRL-1 - Seq ID NO:8, CDRL-2 - Seq ID NO:9, CDRL-3 - Seq ID NO:10.

Полученное антитело эффективно связывает эритропоэтин человека. Его структура близка к структуре антитела человека, благодаря замене константных областей легкой и тяжелой цепей IgG мыши на аналогичные области IgG человека. Рекомбинантное химерное антитело по настоящему изобретению можно экспрессировать в культивируемых клетках яичников китайского хомячка (СНО), широко применяемых для продукции рекомбинантных белков терапевтического назначения.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 представляет собой данные иммуноблота по связыванию антител 6-4А3 и 6-4A3-him с эритропоэтином человека.

Фиг.2 представляет собой данные электрофореза антитела 6-4А3 в полиакриламидном геле (4-20% полиакриламидный гель с ДДС натрия).

Фиг.3 представляет собой данные изофокусирования антител 6-4А3 и 6-4A3-him к эритропоэтину человека в полиакриламидном геле (Pharmalyte 3-10).

Подробное описание изобретения

Для создания данных антител был получен штамм мышиной гибридомы, депонированный в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) за № 84 от 24 мая 2012 года. Указанная гибридома является продуцентом моноклонального антитела (рабочее название 6-4А3) к эритропоэтину человека. Из клеток данного штамма были выделены кДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей данного антитела. Данные кДНК были слиты с последовательностями, кодирующими, соответственно, константные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G человека с получением химерного антитела (рабочее название 6-4A3-him).

Было показано, что экспрессия химерных (мышь-человек) цепей антитела по изобретению в клетках СНО приводит к секреции антитела, эффективно связывающего эритропоэтин человека. Рекомбинантное антитело по изобретению имеет аффинность к антигену (эритропоэтину), сравнимую с аффинностью исходного моноклонального антитела, то есть при создании рекомбинантного антитела удалось избежать возможной потери как аффинности, которая в отдельных случаях уменьшается на несколько порядков, так и селективности. Таким образом, задача изобретения решена.

На основе моноклонального антитела 6-4А3 и химерного антитела 6-4A3-him могут быть также получены одноцепочечные и гуманизированные антитела к эритропоэтину человека.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение и характеристика клонов культивируемой гибридомы мыши.

Для получения гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело к эритропоэтину человека, мышей линии Balb/c иммунизировали очищенным рекомбинантным эритропоэтином человека. Эритропоэтин (10 мкг эритропоэтина в объеме 50 мкл +50 мкл полного адъюванта Фрейнда) вводили подкожно: половину дозы - в подушечки лап задних конечностей, а другую половину в холку животных. Через 30 дней и через 51 день производили вторую и третью иммунизации, отличавшиеся от первой использованием неполного адъюванта Фрейнда. Еще через 21 день проводили бустирование внутривенным введением эритропоэтина в дозе 10 мкг/мышь, после чего животных забивали и из их селезенок и периферических лимфоузлов выделяли лимфоциты. Слияние полученных лимфоцитов с клетками миеломы Sp2/0 проводили с помощью полиэтиленгликоля по стандартной методике. После селекции на селективной питательной среде, содержащей HAT, из ячеек с растущими клетками (200 первичных клонов) отбирали образцы культуральной жидкости для скрининга антител к эритропоэтину человека с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Полученные позитивные клоны подвергали дальнейшему клонированию и размножению. В результате нескольких циклов выращивания и скрининга был отобран клон гибридных клеток, стабильно секретирующих высокоаффинное антитело к эритропоэтину человека, пригодное для диагностических целей, а также для выделения ЭПО из различных биологических жидкостей. Этот клон был обозначен как 6-4А3.

Полученный штамм культивируемой гибридомы мышей 6-4А3 депонирован в СХЖ РАСХН за № 84 от 24 мая 2012 года.

Штамм характеризуется следующими признаками:

1. Морфологические признаки.

Клетки правильной округлой формы, одиночные или сгруппированные в кластеры.

2. Культуральные признаки.

Тип роста - суспензионный.

3. Способ гибридизации.

Гибридома получена слиянием миеломы мышей SP 2/0 с лимфоцитами мышей линии Balb/c помощью полиэтиленгликоля.

4. Устойчивость к селективным факторам.

Растет на среде HAT.

5. Криоконсервация.

Среда для криоконсервации - 90% фетальной сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Температура хранения - 196°С (жидкий азот).

6. Контроль видовой идентичности.

Гибридома способна к культивированию в брюшной полости сингенных мышей без использования иммуносупрессии и продуцирует иммуноглобулины мыши типа G2A.

7. Контаминация.

Клетки гибридомы свободны от микоплазмы.

Пример 2. Очистка и характеризация антитела 6-4А3.

Антитело 6-4А3 из асцитной жидкости мышей выделяли с помощью гель-проникающей и ионообменной хроматографии для его дальнейшей характеризации.

С помощью иммуноферментного набора фирмы Invitrogen был установлен изотип тяжелой цепи - G2A и легкой цепи - . С помощью иммуноблота и иммуноферментного анализа было установлено, что антитело (6-4А3) связывается с эритропоэтином человека (Фиг.1) и не связывается с белками сыворотки крови и селезенки мышей, а также с белками сыворотки крови человека и растворимыми белками гомогената культивируемых клеток овариев китайского хомячка (СНО). Молекулярный вес антитела 6-4А3 составляет 160 килодальтон по результатам электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях, в восстанавливающих условиях антитело диссоциирует на тяжелую (52 кДа) и легкую (28 кДа) цепи (Фиг.2), изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 6,8-7,1 (Фиг.3).

Константа диссоциации (Kd) очищенного антитела для эритропоэтина человека, вычисленная на основании результатов иммуноферментного анализа по Скэтчерду, составляет 0,95×10^-9 М. Свойства антитела 6-4А3 представлены на табл.1.

Таблица 1
Иммунологическая характеристика антител к эритропоэтину человека
Антите ло	Тип Ig	Kd по ЭПО	Наличие неспецифического связывания
			Сыворотка крови человека	Сыворотка крови мыши	Белки селезенки мыши	Белки СНО
6-4А3	IgG2A Изотип CL	0,95×10-9 М	-	-	-	-
6-4A3-him	IgG 1 Изотип CL k	2,4×10-9 М	-	-	-	-

Пример 3. Выделение кДНК и сиквенирование вариабельных областей легкой и тяжелой цепей.

Из клеток гибридомы 6-4А3 выделяли РНК, на матрице которой с помощью наборов синтетических праймеров (Immunogenetics Information System http://www.imgt.org) были амплифицированы фрагменты генов, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела.

Полученные фрагменты клонировали в вектор pALTA и сиквенировали по Сэнджеру с внешних праймеров (M13dir-M13rev) с помощью автоматического сиквентора АВ3500. Последовательности нуклеотидов, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела 6-4А3, представлены в списке последовательностей за номерами Seq ID NO:1 и Seq ID NO:2, вычисленные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела 6-4А3 представлены за номерами Seq ID NO:3 и Seq ID NO:4.

Анализ полученных последовательностей, выполненный с помощью программы IMGT/V-QUEST (Immunogenetics Information System http://www.imgt.org), выявил участки CDR, определяющие комплементарность антитела антигену. Участки CDRH-1, CDRH-2, CDRH-3, тяжелой цепи антитела 6-4А3 и участки CDRL-1 CDRL-2 CDRL-3 легкой цепи антитела 6-4А3 представлены в таблице 2.

Таблица 2
Последовательности участков CDR тяжелой и легкой цепей антитела 6-4А3
Наименование участка	Последовательность аминокислот участка N C	Номер в списке последовательностей
CDRH-1	GYTFTDYE	Seq ID NO:5
CDRH-2	IYPGSGGT	Seq ID NO:6
CDRH-3	TRIGIMTGYFDV	Seq ID NO:7
CDRL-1	DHINNW	Seq ID NO:8
CDRL-2	GAT	Seq ID NO:9
CDRL-3	QQYWSTPT	Seq ID NO:10

Пример 4. Конструирование химерного антитела 6-4A3-him (мышь-человек) к эритропоэтину человека.

С помощью полимеразной цепной реакции последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела 6-4А3 были состыкованы с последовательностями ДНК, кодирующими, соответственно, константные области тяжелой цепи иммуноглобулина G1 человека ( 1) и константной области легкой цепи иммуноглобулина G человека (k). Полученные гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи рекомбинантного химерного (мышь-человек) антитела 6-4A3-him к эритропоэтину человека, представлены под номерами:

Последовательность нуклеотидов гена тяжелой цепи химерного антитела 6-4A3-him-Seq ID NO:11;

Последовательность нуклеотидов гена легкой цепи химерного антитела 6-4A3-him-Seq ID NO:13.;

Последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей химерного антитела 6-4A3-him представлены под номерами Seq ID NO:12 и Seq ID NO:14 соответственно. С помощью стандартных методов генетической инженерии последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи химерного антитела 6-4A3-him, были вставлены в экспрессионные вектора pOptiVec и pCDNA3.3 с получением экспрессионных плазмидных ДНК p6-4A3-him-H и p6-4A3-him-L, которыми были трансформированы клетки СНО линии DG-44. Через 7 дней культивирования трансформированных клеток продукция антитела, связывающего эритропоэтин человека, была показана с помощью иммуноблота.

Пример 5. Очистка химерного антитела 6-4A3-him, определение его свойств и использование иммобилизованных моноклонального и химерного анитител для очистки эритропоэтина.

Предварительно отобранные на среде OptiCHO(-HT) с необходимыми добавками клетки СНО, трансформированные векторами, экспрессирующими тяжелую и легкую цепи химерного антитела 6-4A3-him, культивировали в среде MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и необходимых добавок при 37°С и 5% CO₂. Антитело 6-4A3-him очищали из среды культивирования с помощью гель-проникающей и ионообменной хроматографии, после чего исследовали его свойства. Антитело 6-4A3-him связывается с рекомбинантным эритропоэтином человека в иммуноблоте (Фиг.1), его изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 7,5-8,0 (Фиг.2), Kd, вычисленное по Скэтчарду, составляет 2,4×10^-9 М.

Очищенные антитела 6-4А3 и 6-4A3-him - по 10 мг каждого антитела - иммобилизовывали на 5 мл CNBr-активированной матрицы Sepharose FF по методике изготовителя и упаковывали в хроматографические колонки. На каждую колонку, уравновешенную фосфатным буфером, наносили по 100 мл культуральной жидкости, содержащей эритропоэтин человека. После промывки колонок фосфатным буфером, содержащим хлористый натрий (1М), и фосфатным буфером, содержащим 0,02% неионного детергента, сорбированный белок элюировали 0,1 М раствором лимонной кислоты, нейтрализовывали, после чего анализировали его свойства. По данным электрофореза в полиакриламидном геле чистота эритропоэтина, очищенного с помощью иммобилизованных антител 6-4А3 и 6-4A3-him, составляет 95%, с выходом не менее 80%, биологическая активность составила 1,3×10⁵ МЕ/мг белка для эритропоэтина, очищенного с помощью антитела 6-4А3, и 0,98×10⁵ МЕ/мг белка для эритропоэтина, очищенного с помощью антитела 6-4A3-him.