способ определения биологического ритма

Формула изобретения

1. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, включающий:

(1) стадию взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки;

(2) стадию измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадных циклов изменения уровней экспрессии; и

(3) стадию вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2), в котором на стадии (3) циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):



где в формуле (I): E_a(t), A _a, и C_a означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t; в формуле (II): E_b(t), A_b , и C_b означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t; а означает разность фаз между двумя часовыми генами,

где интервал между взятием образцов выбран из:

8:08, 7:09, 9:08, 8:07, 9:07, 7:08, 8:09, 7:07, 7:10, 10:07, 9:06, 6:09, 9:09, 6:08, 10:06, 8:10, 8:06, 6:10, 10:08, 11:07, 6:11, 7:06, 11:06, 7:11, 6:07, 5:10, 9:10, 10:05, 5:09, 10:09, 9:05, 6:12, 6:06, 12:06, 5:11, 11:08, 8:05, 11:05, 8:11. 5:08, 7:12, 12:05, 5:07, 5:12, 12:07, 7:05, 5:13, 13:06, 6:05, 6:13,13:05, 5:06, 4:10, 10:10, 10:04, 9:04, 4:11, 11:09, 4:09, 9:11, 11:04, 12:08, 4:12, 8:04, 8:12, 4:08, 12:04, 5:05, 14:05, 5:14, 13:04, 7:13, 4:07, 4:13, 7:04, 13:07, 6:14, 14:04, 4:06, 6:04, 4:14, 14:06, 4:05, 5:15, 15:04, 5:04, 15:05, 4:15, 10:11, 3:10, 11:03, 3:11, 11:10, 10:03, 9:12, 3:09, 12:03, 12:09, 3:12, 9:03, 13:03, 8:13, 3:08, 13:08, 3:13, 8:03, 7:14, 14:03, 3:07, 3:14, 14:07, 7:03, 4:16, 4:04, 15:06, 6:03, 6:15, 15:03, 3:06, 17:04, 4:03, 3:17, 3:05, 16:03, 5:16, 3:16, 16:05, 5:03, 4:17, 3:04, 17:03, 3:03, 18:03, 3:18, 17:05, 16:06, 6:02, 2:16, 5:02, 2:17, 4:02, 2:18, 2:01, 18:04, 1:20, 3:01, 20:03, 2:03, 3:19, 19:02, 2:04, 18:02, 4:18, 18:05, 1:18, 5:01, 2:19, 3:02, 19:03, 2:11, 11:02, 11:11, 1:21, 16:02, 2:06, 6:16, 17:02, 5:17, 2:20, 14:02, 2:08, 8:14, 16:04, 3:15, 2:02, 20:02, 8:02, 2:05, 10:12, 2:10, 12:02, 7:02, 2:15, 15:07, 7:01, 16:07, 1:16, 2:12, 12:10, 10:02, 2:14, 14:08, 13:09, 2:13, 9:13, 2:09, 13:02, 9:02, 9:01, 14:09, 1:14, 15:02, 7:15, 2:07, 21:02, 22:01, 15:08, 1:15, 8:01, 6:17, 1:06, 17:01, 21:01, 8:15, 15:01, 1:08, 6:01, 17:06, 1:17, 1:22, 1:01, 20:01, 3:20, 1:03, 18:01, 1:05, 5:18, 19:01, 4:19, 1:13, 10:01, 2:21, 13:10, 1:09, 14:01, 9:14, 16:01, 1:07, 7:16, 1:02, 1:19, 19:04, 4:01, 1:04, 13:01, 1:10, 10:13, 1:12, 11:01, 12:11, 1:11, 12:01, 11:12.

2. Способ по п.1, включающий:

вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час;

вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II);

вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и

вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов.

3. Способ по п.2, в котором биологические образцы у субъекта отбирают три раза в сутки с интервалом в 8 часов.

4. Способ по п.1, в котором в качестве часовых генов используют ген Per3 и ген Nr1d2.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к способу определения биологического ритма у субъекта. В частности, настоящее изобретение касается способа определения биологического ритма посредством взятия биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки.

Уровень техники

Известно, что различные биологические явления у живых организмов проявляют "периодический ритм", который совершает автономные колебания. Этот периодический ритм называется "биологическим ритмом". В частности, известно, что "циркадный ритм", период которого составляет около суток, в большой степени контролирует такие биологические явления, как цикл сна/бодрствования, температура тела, кровяное давление и суточные колебания секреции гормонов. Кроме того, циркадный ритм задействован в активности ума и тела, спортивных способностях и чувствительности к лекарственным препаратам.

Биологический ритм контролируется кластером генов, именуемых "часовыми генами". Часовые гены действуют в качестве "внутренних часов", самостоятельно вызывающих периодические колебания экспрессии, активности, локализации и т.д. часовых генов.

Очевидно, что генный полиморфизм и мутации часовых генов являются причиной возникновения рака, диабета, сосудистых заболеваний, нейродегенеративных и других заболеваний. Более того, недавно было высказано предположение, что генный полиморфизм и мутации часовых генов участвуют в возникновении таких психических заболеваний, как биполярный психоз и меланхолия.

С другой стороны, биологический ритм не только автономно контролируется внутренними часами, но и подвергается ограничениям из-за жизни в обществе. Например, в цикле сна/бодрствования могут быть отличия в ритме (фазовые отличия) между "циклом отхода ко сну/вставания в действительной жизни" и "запускаемым внутренними часами циклом сна/бодрствования" вследствие различий во времени регулярного отхода ко сну и времени вставания.

Считается, что отличия в биологическом ритме вызывают так называемый "синдром смены часовых поясов" и нарушения сна, а также вышеприведенные психические заболевания. Для лечения таких заболеваний предпринимаются попытки перенастроить аномальные внутренние часы с помощью облучения светом.

Более того, предпринимаются попытки довести до максимума действие лекарств с помощью биологического ритма. Полагают, что действие лекарств также подвержено суточным колебаниям из-за колебаний уровня экспрессии молекул (молекул-мишеней препарата), на которые воздействует препарат, и циркадного ритма ферментов (ферментов метаболизма препарата), метаболизирующих препарат. Поэтому была выдвинута концепция "ориентированной по времени медицинской помощи", которая стремится довести до максимума лечебное действие путем установки надлежащего времени введения для каждого препарата.

Кроме того, в более известных случаях, с использованием циркадного ритма активности ума и тела и спортивных способностей началось изучение такого периода активности, в который достигают максимума способности к обучению и тренировке, и такого времени приема внутрь, в которое с трудом происходит увеличение веса (или легко происходит увеличение веса).

В связи с вышесказанным полагаем, что точная оценка биологического ритма имеет положительное значение для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов, предупреждения различных заболеваний, осуществления ориентированной по времени медицинской помощи, проявления своих способностей и похудания.

В PTL 1 раскрыт способ определения внутреннего времени организма на основе данных по измерению уровня продукта экспрессии гена в стандартном образце, взятом у живого индивидуума. В этом способе определения внутреннего времени организма составляется таблица молекулярных часов для оценки внутреннего времени организма на основе уровня экспрессии продукта экспрессии гена (т.е. мРНК).

Список цитируемых документов

PTL 1: International Publication No. 2004/012128.

Раскрытие изобретения

В PTL 1 не раскрыт конкретный ген мишени для измерения. Биологические ритмы обычно оценивают, используя часовой ген в качестве мишени для измерения на основе изменений уровня экспрессии часового гена во времени.

Однако для измерения изменений уровня экспрессии часового гена во времени необходимо постоянно брать биологические образцы у субъекта. То есть для оценки биологического ритма с большой точностью необходимо брать биологические образцы у субъекта на протяжении 24 часов с интервалом в несколько часов, чтобы получить временной ряд данных по уровню экспрессии часового гена.

Для субъекта (данного индивидуума) взятие биологических образцов по несколько раз в день таким образом очень обременительно. Более того, субъекта иногда будят среди ночи, чтобы взять биологический образец. Это влияет на цикл сна/бодрствования у субъекта, что может привести к изменению самого биологического ритма.

Полагаем, что нужно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов для того, чтобы расширить пределы оценки биологического ритма, к примеру, с целью улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов и предупреждения различных заболеваний.

Соответственно, главной целью настоящего изобретения является получение способа, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.

Для достижения вышеприведенной цели настоящим изобретением предусмотрен способ определения биологического ритма у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, взятых у субъекта три раза в сутки, причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии.

В частности, способ определения биологического ритма включает стадии:

(1) взятия биологических образцов у субъекта три раза за 24 часа;

(2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и

(3) вычисления циркадных циклов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на стадиях (1) и (2).

При измерении двух часовых генов, имеющих разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии, взятие биологических образцов у субъекта может производиться всего лишь три раза в сутки.

На стадии (3) этого способа определения биологического ритма циркадные циклы рассчитывают из временных рядов данных по уровням экспрессии по приведенным ниже формулам (I) и (II):

В формуле (I): E_a(t), A _a, и C_a означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения одного из часовых генов в момент времени t. А в формуле (II): E_b(t), A_b , и C_b означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения другого часового гена в момент времени t. Кроме того, означает разность фаз между двумя часовыми генами.

Этот способ определения биологического ритма предпочтительно включает вычисление данных моделирования из графика, полученного путем аппроксимации косинусом временного ряда данных по уровням экспрессии, причем данные моделирования отражают изменения уровня экспрессии через каждый час; вычисление выборочных данных по трем точкам из трех произвольных точек времени и уровней экспрессии в этих точках из данных моделирования по приведенным выше формулам (I) и (II); вычисление разницы по времени между данными моделирования и выборочными данными по трем точкам в те моменты, в которые уровни экспрессии достигают максимума; и вычисление трех точек времени, в которых среднее значение разницы по времени составляет менее 0,6, а стандартная ошибка разницы по времени составляет менее 0,4; и взятие биологических образцов три раза в сутки именно в эти три точки времени как точки взятия образцов. В частности, можно определить биологический ритм с большой точностью при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов.

В этом способе определения биологического ритма часовыми генами могут быть ген Per3 и ген Nr1d2.

В общем случае "фаза" означает такое количество, которое характеризует, за один период, положение и состояние точек типа пиков и провалов при периодическом изменении. Циркадный цикл изменений уровня экспрессии часового гена можно наблюдать в виде волновой функции косинуса, представленной формулой (III) ниже. При этом E(t) - уровень экспрессии часового гена в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, а C - величина смещения:

В настоящем изобретении "фаза" задается выражением внутри скобок косинуса в формуле (III), а именно: "2 (t+ )/24" в формуле (III). Кроме того, "начальная фаза" есть " ", определяющая фазу в момент времени t=0. А "разность фаз" означает разность начальных фаз между часовыми генами.

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ, которым достигается определение биологического ритма с большой точностью и сводится к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен график, полученный нанесением точек времени, в которых уровни экспрессии достигают максимума в циркадных циклах изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 (Пример 1). По оси X (горизонтальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Per3, а по оси Y (вертикальной оси) - время, за которое достигает максимума уровень экспрессии гена Nr1d2. На фиг. пунктирной линией обозначено положение графика в том случае, когда разница по времени (разность фаз) между точками составляет 2 часа.

На фиг.2 представлен график, полученный нанесением разницы по времени в точках, в которых уровни экспрессии достигают максимума, между данными моделирования и циркадными циклами, рассчитанными по тем интервалам, в которых образцы брали три раза (пример 2). На фиг. по оси X (горизонтальной оси) -стандартная ошибка разницы по времени по интервалам взятия образцов, а по оси Y (вертикальной оси) - среднее значение.

На фиг.3 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанные при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам интервала "8:08" (A) или интервала "9:15" (B) по данным моделирования (Пример 2). На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.

На фиг.4 представлены графики циркадного цикла изменений уровня экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2, рассчитанные при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов (Пример 3). На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы гена Per3 и гена Nr1d2, полученные при взятии образцов по семи точкам.

Осуществление изобретения

1. Способ определения биологического ритма

Авторы настоящего изобретения посчитали, что количество раз, когда у субъекта берутся биологические образцы, можно сократить путем определения биологического ритма по различиям в циклах изменений уровня экспрессии между несколькими часовыми генами, и рассмотрели это предположение. Затем авторы изобретения обнаружили, что биологический ритм можно определить с большой точностью путем измерения двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии биологических образцов у субъекта всего лишь три раза в сутки. То есть в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с различными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии для биологических образцов, взятых у субъекта три раза в сутки, а биологический ритм субъекта прогнозируется на основе полученного временного ряда данных по уровням экспрессии.

Если два часовых гена a и b имеют различные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии и разность фаз равняется "0", то циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов можно смоделировать с помощью приведенных ниже формул косинусных графиков (I) и (II):

При этом в формуле (I): E_a (t), A_a, и C_a означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): E_b(t), A_b, и C _b означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t.

В том случае, когда известна разность фаз между двумя часовыми генами a и b, формулы косинусных графиков (I) и (II) включают 5 неизвестных констант ( , A_a, A_b, C_a и C_b ). Измеряя уровни экспрессии E_a(t) и E_b (t) часовых генов a и b в биологических образцах, взятых у субъекта в момент времени t, по формулам косинусных графиков (I) и (II) можно получить 2 уравнения. Следовательно, на этой модели, получая 6 уравнений по формулам косинусных графиков (I) и (II) при взятии (отборе) биологических образцов в три разных момента времени t, можно рассчитать циркадные циклы изменений уровней экспрессии часовых генов a и b.

Математически для нахождения 5 неизвестных требуется 5 уравнений. В настоящем изобретении, при моделировании циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов a и b с известной разностью фаз между ними по приведенным выше формулам косинусных графиков (I) и (II), рассчитывают 5 неизвестных на основе 6 уравнений. А именно, принимая разность фаз между часовыми генами a и b в качестве ограничивающего условия, можно более точно рассчитать неизвестные , A_a, A_b, C_a и C_b . Таким образом, с большой точностью можно рассчитать циркадный цикл уровня экспрессии часового гена, что является биологическим явлением, точная оценка которого обычно проводится с трудом.

Более конкретно, способ определения биологического ритма включает стадии: (1) взятия биологических образцов у субъекта три раза в сутки; (2) измерения уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, причем эти два часовых гена имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии; и (3) вычисления циркадных циклов изменений уровней экспрессии часовых генов из временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных на предыдущих стадиях.

В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению примеры субъектов в широком смысле включают, наряду с человеком, и таких лабораторных животных, как мыши, крысы и обезьяны.

2. Взятие биологических образцов

Биологические образцы, взятые у субъекта, не имеют особых ограничений, если только они представляет собой биологическую ткань, содержащую продукт экспрессии (мРНК) часового гена. В отношении легкости взятия образцов предпочтительно берут биологическую ткань из поверхности тела, как то волосы, слизистые ротовой полости или кожу.

Волосы можно брать путем вырывания с корнем. Корни вырванных волос содержат клетки волосяной сумки, и в них можно измерить мРНК часовых генов. При этом "клетки волосяной сумки" представляют собой группу клеток, которые образуют внутреннюю оболочку корней, внешнюю оболочку корней и сосочки, прилегающие к корням вырванных из тела волос.

Например, в том случае, когда субъектом является человек, место взятия волос не имеет ограничений, и можно использовать волосы из головы, бороды, ног или рук и т.п. Чтобы уменьшить разброс при измерении, предпочтительно каждый раз берут образцы из участков, близких друг к другу.

В случае человека приблизительное количество волос, отбираемых за один раз, составляет от 5 до 10 для волос головы, от 3 до 5 для бороды и от 10 до 20 для волос рук. Используя количество волос, большее или равное вышеприведенному количеству волос, можно экстрагировать достаточное количество мРНК для количественного определения уровней экспрессии часовых генов.

Образцы из слизистых ротовой полости можно получить путем соскабливания из поверхности ротовой полости, к примеру, с помощью щеточки или шпателя. При этом можно измерить мРНК часовых генов в соскобленных клетках слизистых оболочек ротовой полости.

Образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно получают из слизистых оболочек, находящихся на внутренней выстилке щеки. Чтобы уменьшить разброс при измерении, образцы слизистых оболочек ротовой полости предпочтительно берут из слизистых оболочек и левой, и правой щеки.

Авторы настоящего изобретения исследовали, какой промежуток времени между взятием образцов при трехкратном взятии образцов дает очень точное определение биологического ритма. В результате этого они обнаружили, что большая точность достигается при взятии биологических образцов у субъекта три раза в сутки с интервалом в 8 часов (см. Пример 2).

Иными словами, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению можно определить биологический ритм с наибольшей точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что промежуток времени между взятием первого и второго образца и промежуток времени между взятием второго и третьего образца одновременно составляет 8 часов.

3. Измерение уровня экспрессии

Уровень экспрессии часового гена в биологическом образце можно измерить общеизвестным способом. Например, из биологического образца экстрагируют ДНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК и синтезируют кДНК по реакции обратной транскрипции, используя в качестве матрицы выделенную РНК. Затем количественно определяют уровень экспрессии с использованием кДНК при помощи комплексного аналитического метода типа ДНК-микроматрицы (ДНК-чипа) либо индивидуального аналитического метода типа ПЦР в реальном времени.

Подлежащие измерению часовые гены могут представлять собой группу часовых генов, идентифицированных к настоящему времени. Репрезентативные примеры часовых генов включают ген Per3 (номер доступа в NCBI NM_016831), ген Per2 (NM_022817), ген Bmal1 (NM_001030272), ген Npas2 (NM_002518), ген Nr1d2 (NM_02174), ген Nr1d2 (NM_005126), ген Dbp (NM_001352) и ген Cry1 (NM_004075).

В способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух из этих часовых генов для получения временных рядов данных по уровням экспрессии, причем эти два гена имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. При этом в случае, когда субъектом является не человек, а другие организмы, измеряются уровни экспрессии гомологов (гомологичных генов) вышеприведенных часовых генов человека у данных организмов.

Комбинацию из двух часовых генов можно выбрать свободно, если только они имеют разные фазы суточных колебаний уровней экспрессии. Фазы суточных колебаний уровней экспрессии двух свободно выбранных часовых генов можно определить, к примеру, методом, описанным ниже в примере 1.

В качестве предпочтительной комбинации двух часовых генов можно использовать ген Per3 и ген Nr1d2. Ген Per3 и ген Nr1d2 устойчиво экспрессируются в биологических образцах и проявляют большие суточные колебания (амплитуды) уровней экспрессии. Таким образом, биологический ритм можно точно определить путем вычисления циркадных циклов изменения уровней экспрессии гена Per3 и гена Nr1d2 из этих временных рядов данных по уровням экспрессии.

4. Вычисление циркадного цикла

Циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов рассчитывают по приведенным ниже формулам (I) и (II) из временных рядов данных по уровням экспрессии, показывающих изменения уровней экспрессии генов во времени:

При этом в формуле (I): E_a (t), A_a, и C_a означают уровень экспрессии, амплитуду, начальную фазу и величину смещения часового гена а в момент времени t. А в формуле (II): E_b(t), A_b, и C _b означают уровень экспрессии, амплитуду и величину смещения часового гена b в момент времени t. Кроме того, означает разность фаз между двумя часовыми генами.

По вышеприведенным формулам (I) и (II) можно получить 6 уравнений из временных рядов данных по уровням экспрессии двух часовых генов при трехкратном взятии образцов. Из этих 6 уравнений получают 5 неизвестных , A_a, A_b, C_a и C_b методом сопряженных градиентов или др. Таким образом можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии часовых генов, причем циркадные циклы будут отражать биологический ритм субъекта.

Как описано выше, в способе определения биологического ритма по настоящему изобретению измеряются уровни экспрессии двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии при взятии образцов по трем точкам, при этом с большой точностью можно рассчитать циркадные циклы изменения уровней экспрессии и тем самым определить биологический ритм субъекта.

Устанавливая, что взятие биологических образцов у субъекта производится всего лишь три раза в сутки, можно уменьшить нагрузку на организм субъекта при взятии биологических образцов. Более того, при взятии образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов можно брать образцы только в тот период времени, когда субъект бодрствует. Таким образом, можно точно определить биологический ритм без ущерба для цикла сна/бодрствования у субъекта.

Пример 1. Определение разности фаз между геном Per3 и геном Nr1d2

В этом примере выбрали ген Per3 (в дальнейшем просто "Per3") и ген Nr1d2 (в дальнейшем просто "Nr1d2") в качестве двух часовых генов с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии и определяли разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии этих генов.

Брали волосы из головы у 15 мужчин и женщин в возрасте от 20 до 50 лет. Корни волос, включая прикрепленные к ним клетки волосяной сумки, быстро погружали в буфер для лизиса клеток (набор RNEasy Microkit: QIAGEN) для получения раствора лизата клеток. Волосы брали с интервалом в 3-4 часа, а за каждый раз отбирали 5-20 волос.

Из раствора лизата клеток, хранившегося при -70°C, экстрагировали общую РНК в соответствии с методикой, приложенной к буферу для лизиса клеток, и проводили реакцию обратной транскрипции. Для количественного определения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 проводили ПЦР в реальном времени, используя продукт обратной транскрипции в количестве 1/20 этого продукта. ПЦР в реальном времени проводили на приборе PRISM 7300 (ABI) с помощью зонда SYBR Green (ABI) или TaqMan MGB (ABI). Уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 подвергали коррекции по уровню экспрессии 18S-pPHK, служившей внутренним стандартом, получая временные ряды данных по уровням экспрессии.

Строили графики по полученным временным рядам данных по уровням экспрессии с аппроксимацией по приведенной ниже формуле косинуса (IV) с периодом в 24 часа нелинейным методом наименьших квадратов, получая разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2:

где E(t) - уровень экспрессии в момент времени t, A - амплитуда уровня экспрессии, - начальная фаза, а C - величина смещения.

Результаты представлены на фиг.1. График получен при нанесении моментов времени t, в которые уровень экспрессии E(t) достигал максимума на графике после аппроксимации по формуле косинуса (IV). Моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, наносили по оси X, а моменты времени t, в которые достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, наносили по оси Y.

Как видно из фиг.1, у 15 субъектов момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, имел широкий разброс от 0 до 12. Точно так же момент времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, имел широкий разброс от 0 до 12.

Однако разница по времени (разность фаз) между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Per3, и моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии E(t) гена Nr1d2, составляла примерно 2 часа для каждого из субъектов. На фиг.1 пунктирной линией представлено положение графика в том случае, когда разность фаз между Per3 и Nr1d2 составляет 2 часа.

Среднее значение и стандартное отклонение разности фаз между Per3 и Nr1d2 по 15 субъектам равнялись 2,3 и 0,8, соответственно. По этой разности фаз (в дальнейшем "разность фаз ") проводили моделирование циркадных циклов изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 по приведенным ниже формулам функции косинуса (V) и (VI) соответственно:

где E_Per3(t) - уровень экспрессии Per3 в момент времени t, A_Per3 - амплитуда уровня экспрессии, - начальная фаза Per3, а C_Per3 - величина смещения;

где E_Nr1d2(t) - уровень экспрессии Nr1d2 в момент времени t, A_Nr1d2 - амплитуда уровня экспрессии, - разность фаз между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2, a C_Nr1d2 - величина смещения.

Пример 2. Изучение интервала между взятием образцов

При использовании вышеприведенных формул графиков косинуса (V) и (VI) можно рассчитать циркадные циклы изменений уровня экспрессии Per3 или Nr1d2 при взятии образцов по меньшей мере три раза и таким образом оценить биологический ритм субъекта. Так, в данном примере, определяли интервал времени между трехкратным взятием образцов с тем, чтобы с наибольшей точностью оценить биологический ритм. Принимая, что взятие образцов проводится три раза в сутки, исследовали все возможные интервалы между взятием образцов (276 профилей).

Сначала рассчитывали почасовые изменения уровней экспрессии двух генов по формуле косинуса (IV), приведенной в примере 1, и проводили аппроксимацию графиков по временным рядам данных по уровням экспрессии Per3 и Nr1d2. Затем отбирали три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках в качестве данных из образцов по трем точкам из расчетных данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии.

Эти три произвольные точки времени t и уровни экспрессии V(t) в этих точках подставляли в формулы (V) и (VI) и получали амплитуды уровней экспрессии A_Per3 и A_Nr1d2, начальную фазу гена Per3 и величины смещения C_Per3 и C _Nr1d2 методом сопряженных градиентов.

Метод сопряженных градиентов выполняли по приведенной ниже методике. А именно, сначала определяли сумму квадратов d из подставленных в формулы (V) и (VI) уровней экспрессии V(t) и уровней экспрессии E(t) из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии, как расстояние между данными при взятии образцов по трем точкам и данными моделирования по приведенной ниже формуле (VII):

Затем методом сопряженных градиентов получали амплитуды A_Per3 и A_Nr1d2; начальную фазу и величины смещения C_Per3 и C_Nr1d2 , сводящие к минимуму расстояние d. Отметим, что в том случае, когда применялся нелинейный метод наименьших квадратов, эти неизвестные константы было невозможно получить, так как расстояние d не сходилось к минимальному значению.

При этом, когда применяется метод сопряженных градиентов, начальные значения неизвестных констант существенно влияют на получаемые константы. Так, если выбраны неправильные начальные значения, то расстояние d сходится к локальному экстремуму и поэтому невозможно получить правильные циркадные циклы.

Поэтому в таком случае в качестве правильных начальных значений амплитуд A_Per3 и A _Nr1d2 принимали среднее значение амплитуды A из данных моделирования, представляющих почасовые изменения уровней экспрессии. Кроме того, в качестве начальных значений величин смещения C _Per3 и C_Nr1d2 принимали среднее значение из данных при взятии образцов по трем точкам. Отметим, что в отношении амплитуды A по данным моделирования амплитуда A_Per3 гена Per3 составила 0,8014513, а амплитуда A_Nr1d2 гена Nr1d2 составила 0,6402411.

Кроме того, начальную фазу гена Per3 ограничивали целыми числами от 0 до 23, чтобы облегчить операционный анализ. Затем получали начальную фазу , обеспечивающую минимальное расстояние d, задавая по одному целые числа от 0 до 23 в качестве начальных значений и применяя метод сопряженных градиентов.

Как описано выше, получали разницу по времени между моментом времени t, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по формуле (V), по которой определяли амплитуду A_Per3 уровня экспрессии, начальную фазу гена Per3 и величину смещения C_Per3, и моментом времени, в который достигал максимума уровень экспрессии V(t) по данным моделирования. Затем исследовали интервал между взятием образцов с тем, чтобы свести к минимуму разницу по времени.

В качестве первого времени взятия образцов принимали все времена через каждый час от 0 до 23. Затем исследовали комбинации (276 профилей) промежутков времени между тремя моментами взятия образцов с тем, чтобы второе и третье взятие образцов завершались в пределах 24 часов от первого. В отношении комбинаций из всех промежутков времени получали среднее значение и стандартную ошибку разницы по времени. Стандартная ошибка показывает, насколько циркадный цикл, рассчитанный при данном интервале взятия образцов, зависит от первого времени взятия образцов. А среднее значение показывает точность рассчитанного циркадного цикла. Таким образом, можно сказать, что рассчитанный циркадный цикл становится более точным по мере уменьшения стандартной ошибки и среднего значения.

В таблицах 1-5 представлены средние значения и стандартные ошибки, полученные в отношении комбинаций из всех интервалов. Комбинации всех интервалов времени в таблицах 1-5 приведены в порядке уменьшения стандартной ошибки и среднего значения интервалов. Интервалы представлены путем сочетания промежутка времени между первым и вторым взятием образцов и промежутка времени между вторым и третьим взятием образцов. Например, "13:06" на фиг. означает, что интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 13 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 6 часов.

Кроме того, на фиг.2 представлен график, на котором каждая из комбинаций интервалов нанесена таким образом, что стандартная ошибка приводится по оси X, а среднее значение - по оси Y.

Таблица 1
Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее
8:08	0,000	0,127	5:10	0,045	0,130	13:05	0,057	0,134
7:09	0,017	0,129	9:10	0,045	0,130	5:06	0,057	0,134
9:08	0,017	0,129	10:05	0,045	0,128	4:10	0,062	0,131
8:07	0,017	0,129	5:09	0,045	0,128	10:10	0,062	0,132
9:07	0,017	0,127	10:09	0,045	0,130	10:04	0,062	0,131
7:08	0,017	0,127	9:05	0,045	0,129	9:04	0,062	0,131
8:09	0,017	0,127	6:12	0,046	0,129	4:11	0,062	0,131
7:07	0,026	0,129	6:06	0,046	0,129	11:09	0,062	0,132
7:10	0,026	0,129	12:06	0,046	0,129	4:09	0,063	0,132
10:07	0,026	0,129	5:11	0,047	0,129	9:11	0,063	0,131
9:06	0,030	0,128	11:08	0,047	0,128	11:04	0,063	0,133
6:09	0,030	0,129	8:05	0,047	0,128	12:08	0,064	0,134
9:09	0,030	0,127	11:05	0,048	0,128	4:12	0,064	0,132
6:08	0,032	0,127	8:11	0,048	0,129	8:04	0,065	0,133
10:06	0,032	0,127	5:08	0,048	0,130	8:12	0,065	0,133
8:10	0,032	0,127	7:12	0,051	0,131	4:08	0,065	0,132
8:06	0,032	0,127	12:05	0,051	0,130	12:04	0,065	0,132
6:10	0,032	.0,127	5:07	0,051	0,131	5:05	0,066	0,132
10:08	0,032	0,128	5:12	0,051	0,131	14:05	0,066	0,133
11:07	0,037	0,129	12:07	0,051	0,130	5:14	0,066	0,133
6:11	0,037	0,129	7:05	0,051	0,130	13:04	0,067	0,134
7:06	0,038	0,129	5:13	0,057	0,131	7:13	0,067	0,133
11:06	0,038	0,129	13:06	0,057	0,130	4:07	0,067	0,132
7:11	0,038	0,129	6:05	0,057	0,131	4:13	0,068	0,133
6:07	0,038	0,129	6:13	0,057	0,134	7:04	0,068	0,132

Таблица 2
Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее
13:07	0,068	0,133	13:03	0,084	0,136	16:03	0,094	0,141
6:14	0,071	0,133	8:13	0,084	0,135	5:16	0,094	0,142
14:04	0,071	0,133	3:08	0,084	0,135	3:16	0,097	0,142
4:06	0,071	0,133	13:08	0,084	0,135	16:05	0,098	0,139
6:04	0,072	0,133	3:13	0,085	0,137	5:03	0,098	0,139
4:14	0,072	0,133	8:03	0,085	0,137	4:17	0,100	0,139
14:06	0,072	0,133	7:14	0,085	0,137	3:04	0,100	0,143
4:05	0,077	0,134	14:03	0,085	0,139	17:03	0,100	0,143
5:15	0,077	0,134	3:07	0,085	0,139	3:03	0,105	0,146
15:04	0,077	0,134	3:14	0,086	0,139	18:03	0,105	0,146
5:04	0,077	0,134	14:07	0,086	0,136	3:18	0,105	0,145
15:05	0,077	0,136	7:03	0,086	0,136	17:05	0,106	0,142
4:15	0,077	0,135	4:16	0,087	0,136	16:06	0,106	0,143
10:11	0,082	0,135	4:04	0,087	0,137	6:02	0,106	0,143
3:10	0,082	0,135	16:04	0,087	0,137	2:16	0,107	0,145
11:03	0,082	0,135	3:15	0,088	0,137	5:02	0,107	0,144
3:11	0,083	0,137	15:06	0,088	0,137	2:17	0,107	0,145
11:10	0,083	0,135	6:03	0,088	0,137	4:02	0,108	0,140
10:03	0,083	0,136	6:15	0,089	0,138	2:18	0,108	0,140
9:12	0,083	0,135	15:03	0,089	0,136	2:01	0,108	0,141
3:09	0,083	0,137	3:06	0,089	0,140	18:04	0,109	0,142
12:03	0,083	0,137	17:04	0,091	0,139	1:20	0,109	0,143
12:09	0,084	0,138	4:03	0,092	0,136	3:01	0,109	0,143
3:12	0,084	0,136	3:17	0,092	0,136	20:03	0,110	0,143
9:03	0,084	0,136	3:05	0,094	0,141	2:03	0,110	0,143

Таблица 3
Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее
3:19	0,110	0,143	20:02	0,136	0,165	1:14	0,160	0,167
19:02	0,111	0,142	8:02	0,136	0,171	15:02	0,160	0,170
2:04	0,111	0,143	2:05	0,136	0,170	7:15	0,162	0,170
18:02	0,111	0,143	10:12	0,138	0,171	2:07	0,162	0,169
4:18	0,112	0,143	2:10	0,139	0,167	21:02	0,162	0,166
18:05	0,113	0,141	12:02	0,139	0,168	22:01	0,165	0,166
1:18	0,113	0,141	7:02	0,140	0,162	15:08	0,165	0,162
5:01	0,114	0,141	2:15	0,141	0,166	1:15	0,165	0,163
2:19	0,114	0,142	15:07	0,142	0,168	8:01	0,170	0,176
3:02	0,114	0,142	7:01	0,144	0,170	6:17	0,171	0,179
19:03	0,116	0,144	16:07	0,144	0,165	1:06	0,171	0,181
2:11	0,116	0,146	1:16	0,145	0,167	17:01	0,172	0,175
11:02	0,116	0,146	2:12	0,147	0,168	21:01	0,173	0,182
11:11	0,118	0,145	12:10	0,148	0,168	8:15	0,173	0,179
1:21	0,118	0,144	10:02	0,148	0,166	15:01	0,176	0,175
16:02	0,119	0,147	2:14	0,151	0,174	1:08	0,177	0,169
2:06	0,122	0,148	14:08	0,151	0,175	6:01	0,177	0,170
6:16	0,122	0,148	13:09	0,151	0,176	17:06	0,179	0,175
17:02	0,122	0,145	2:13	0,153	0,167	1:17	0,180	0,179
5:17	0,126	0,146	9:13	0,154	0,165	1:22	0,180	0,181
2:20	0,126	0,146	2:09	0,154	0,166	1:01	0,183	0,176
14:02	0,127	0,147	13:02	0,157	0,175	20:01	0,183	0,172
2:08	0,130	0,151	9:02	0,157	0,176	3:20	0,184	0,172
8:14	0,130	0,152	9:01	0,157	0,171	1:03	0,187	0,172
2:02	0,130	0,152	14:09	0,160	0,166	18:01	0,188	0,179

Таблица 4
Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее
1:05	0,188	0,178	1:02	0,209	0,187
5:18	0,191	0,176	1:19	0,210	0,189
19:01	0,191	0,173	19:04	0,213	0,184
4:19	0,192	0,171	4:01	0,213	0,185
1:13	0,195	0,188	1:04	0,215	0,179
10:01	0,195	0,186	13:01	0,288	0,328
2:21	0,196	0,194	1:10	0,289	0,327
13:10	0,199	0,176	10:13	0,290	0,331
1:09	0,200	0,175	1:12	0,321	0,445
14:01	0,200	0,172	11:01	0,322	0,444
9:14	0,203	0,179	12:11	0,323	0,443
16:01	0,203	0,180	1:11	0,355	0,515
1:07	0,204	0,180	12:01	0,355	0,516
7:16	0,208	0,181	11:12	0,356	0,514

Таблица 5
Интервал	Станд. ошибка	Среднее	Интервал	Станд. ошибка	Среднее
9:15	3,27	12,78	3:21	4,20	22,66
8:16	3,47	14,57	21:03	4,26	22,89
23:01	3,55	15,25	19:05	4,31	23,21
16:08	3,64	15,82	13:11	4,38	24,09
2:22	3,75	17,57	15:09	4,48	25,25
22:02	3,82	17,96	7:17	4,57	26,00
1:23	3,87	18,17	17:07	4,65	26,59
6:18	3,92	18,96	5:19	4,77	30,21
14:10	3,98	19,57	4:20	4,87	29,47
20:04	4,03	20,02	10:14	5,08	32,81
12:12	4,08	21,25	18:06	5,40	38,23
11:13	4,15	21,23

Как видно из таблиц 1-5 и фиг.2, стандартная ошибка и среднее значение достигают минимума в интервале "8:08". Из этого ясно, что циркадный цикл может быть рассчитан с большой точностью при трехкратном взятии образцов с тем, что интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов.

Кроме того, стандартная ошибка и среднее значение являются достаточно низкими в комбинациях интервалов, приведенных в таблицах 1-4. Полагаем, что при использовании этих интервалов взятия образцов можно рассчитать правильные циркадные циклы. С другой стороны, оказалось, что комбинации интервалов, приведенные в таблице 5, не подходят, так как стандартная ошибка и среднее значение являются высокими.

На фиг.3 представлен циркадный цикл изменений уровня экспрессии Per3, рассчитанный при выполнении всех профилей взятия образцов по трем точкам для интервала "8:08" (А) или интервала "9:15" (В) по данным моделирования. На фиг. цифрой 1 обозначен циркадный цикл Per3 по данным моделирования, а цифрой 2 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным моделирования. Далее цифрой 3 обозначен циркадный цикл Per3 по данным взятия образцов по трем точкам, а цифрой 4 обозначен циркадный цикл Nr1d2 по данным взятия образцов по трем точкам.

Как видно из фиг.3(А), в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов и интервал между вторым и третьим взятием образцов одновременно составляет 8 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам хорошо согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы могут быть рассчитаны с большой точностью.

С другой стороны, в том случае, когда интервал между первым и вторым взятием образцов составляет 9 часов, а интервал между вторым и третьим взятием образцов составляет 15 часов, циркадные циклы Per3 и Nr1d2 по данным моделирования и по данным взятия образцов по трем точкам не согласуются друг с другом, что означает, что циркадные циклы невозможно рассчитать.

Пример 3. Оценка биологического ритма при взятии образцов по трем точкам

Из приведенных в Примере 2 результатов оказалось, что циркадный цикл можно рассчитать с большой точностью при взятии образцов три раза с интервалом в 8 часов. Поэтому была сделана попытка определить биологический ритм при фактическом выполнении взятия образцов по трем точкам с интервалом в 8 часов. Взятие образцов по трем точкам проводили по трем профилям, приведенным ниже в таблице 6.

Таблица 6
	Время взятия образцов
	Первый раз	Второй раз	Третий раз
По трем точкам a	12:00	20:00	28:00
По трем точкам b	16:00	24:00	32:00
По трем точкам с	20:00	28:00	36:00

При взятии образцов по трем точкам профилей a-c в каждый момент времени количественно определяли уровни экспрессии Per3 и Nr1d2 методом, описанным в Примере 1. Затем по той же методике, что описана в Примере 2, в формулы (V) и (VI) подставляли три точки времени t и уровни экспрессии E(t) в этих точках и получали амплитуды A_Per3 и A_Nr1d2 уровней экспрессии, начальную фазу гена Per3 и величины смещения C_Per3 и C _Nr1d2 методом сопряженных градиентов. Таким образом рассчитывали циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2.

Результаты представлены на фиг.4. На фиг. символами a1, b1 и c1 соответственно обозначены циркадные циклы гена Per3 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c, а символами a2, b2 и c2 соответственно обозначены циркадные циклы гена Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a, b и c. Далее символами d1 и d2 обозначены циркадные циклы, полученные при аппроксимации по приведенной выше формуле косинуса (IV) нелинейным методом наименьших квадратов временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при взятии образцов семь раз с 12:00 до 36:00. Символом d1 обозначен циркадный цикл Per3, а символом d2 обозначен циркадный цикл Nr1d2.

Как видно из фиг.4, при взятии образцов по трем точкам профилей a-c циркадные циклы изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 были рассчитаны с высокой воспроизводимостью. Ошибка по фазе между циркадными циклами изменения уровней экспрессии Per3 и Nr1d2 при взятии образцов по трем точкам профилей a-c и циркадными циклами (см. символы d1 и d2 на фиг.) при взятии образцов семь раз составила в среднем 0,75 часов.

Как видно из этого результата, при взятии образцов по трем точкам в отношении уровней экспрессии генов Per3 и Nr1d2 с разными фазами циркадного цикла изменений уровня экспрессии оказалось, что были рассчитаны циркадные циклы изменения уровней экспрессии, по которым с большой точностью можно определить биологический ритм субъекта.

Промышленная применимость

Способ определения биологического ритма по настоящему изобретению может применяться для осуществления медицинской службы времени, проявления своих способностей и похудания. Более того, способ может применяться для предупреждения различных заболеваний, вызванных смещением биологического ритма, и для улучшения такого плохого физического состояния, как синдром смены часовых поясов.