ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие аминокислотную замену в положении 59

Классы МПК:C07K14/62 инсулины
C12N15/17 инсулины
C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии
C12N1/00 Микроорганизмы, например простейшие; их композиции; способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды
C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом
A61K38/28 инсулины
A61P5/50 для увеличения или потенциирования активности инсулина
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):ИПСЕН ФАРМА С.А.С. (FR)
Приоритеты:
подача заявки:
2010-07-22
публикация патента:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новому пептидному аналогу инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), содержащему аминокислотную замену метионина в положении 59 на Asn, Leu, Nle, Ile, Arg, A6c, Glu, Trp или Tyr, а также другие дополнительные замены, вставки и делеции. Указанный пептид или его фармацевтически приемлемую соль используют в составе фармацевтической композиции для лечения IGF-1-опосредованных заболеваний, а также в способе лечения низкорослости. Изобретение позволяет получить аналог-агонист IGF-1, обладающий повышенной биологической активностью по сравнению с нативным IGF-1. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 табл.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым аналогам инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные аналоги, и к применению указанных аналогов для лечения состояний, опосредованных IGF-1-рецептором, таких как низкорослость, терапии диабета, лечения нейродегенеративных заболеваний и для восстановления хряща. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым аналогам IGF-1, содержащим аминокислотную замену в положении 59, например (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH и другую(ие) замену(ы), как это определено в описании.

Предшествующий уровень техники

IGF-1 представляет собой полипептидный гормон длиной 70 аминокислот, характеризующийся инсулиноподобной и митогенной ростовой биологической активностью. Данный гормон усиливает рост клеток в различных тканях, включая мышечно-скелетные системы, печень, почки, кишечник, ткани нервной системы, сердце и легкие.

IGF-1 дикого типа имеет следующую аминокислотную последовательность с тремя межцепочечными дисульфидными мостиками, где боковые цепи каждой пары остатков A6 и A48 , A47 и A52 и A18 и A61 образуют дисульфидную связь (SEQ ID NO:50):

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577

Хотя IGF-1 присутствует в разнообразных тканях организма, обычно он находится в неактивной форме, в которой он связан с IGF-связывающим белком (IGFBP). Известны шесть родственных IGFBP, и их обозначают IGFBP1-IGFBP6. См., например, Holly and Martin, "Insulin-like Growth Factor Binding Proteins: A Review of Methodological Aspects of Their Purification, Analysis and Regulation," Growth Regul., 4(Suppl 1):20-30 (1994). IGFBP играют важную роль в регуляции IGF-1 за счет наличия ингибиторного и/или стимулирующего эффектов на действие IGF-1. Например, примерно 90% циркулирующего IGF-1 присутствует в тримолекулярном комплексе, содержащем IGFBP-3 и чувствительную к кислотности дополнительную молекулу. IGF-1 в составе таких комплексов не может связываться с поверхностными рецепторами, и поэтому он не активен биологически. IGF-1, присутствующий в составе тримолекулярного комплекса, также характеризуется существенно более продолжительным периодом полужизни, чем не входящий в комплекс IGF-1.

Нарушение действия IGF-1 может вносить вклад в некоторые физиологические нарушения, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь двигательного нейрона (т.е. боковой амиотрофический склероз (ALS)), мышечная дистрофия и рассеянный склероз, заболевания хрящей, такие как остеоартрит, костные заболевания, такие как остеопороз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит, ишемические повреждения органов, таких как сердце, головной мозг или печень, и так далее.

Как хорошо известно специалистам в данной области, известные и потенциальные варианты применения IGF-1 разнообразны и многочисленны. Например, в ряде исследований сообщается о применении IGF-1 в качестве потенциального терапевтического средства для лечения нейродегенеративных состояний. См.,например, Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998). Терапия IGF-1 показана при многих неврологических состояниях, включая ALS, инсульт, эпилепсию, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, острое травматическое повреждение и другие нарушения, ассоциированные с травмой, старением, заболеванием или повреждением. См., например, патенты США № 5093137; 5652214; 5703045; международные публикации WO 90/1483 и WO 93/02695.

Применение терапии IGF-1 при различных других состояниях упоминается в ряде публикаций. См. например, Schalch et al., "Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors," ed. Spencer (Elsevier, New York), p. 705-714 (1991); Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab. , 79(1):4-6 (1994); и Langford et al., Eur. J. Clin. Invest. , 23(9):503-516 (1993) (относящиеся, например, к резистентным к инсулину состояниям и диабету); и O'Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993) (относящаяся, например, к почечной недостаточности). Также см. патент США № 7258864 (относящийся к низкорослости); патенты США № 5110604 и 5427778 (относящиеся, например, к заживлению ран); патент США № 5126324 (относящийся, например, к сердечным заболеваниям и задержке роста); патент США № 5368858 (относящийся, например, к дефектам или повреждениям хряща); патенты США № 5543441 и 5550188 (относящиеся, например, к косметической пересадке ткани); патент № 5686425 (относящийся, например, к ткани шрамов, локализованной мышечной дисфункции и недержанию мочи); и патент США № 5656598 (относящийся, например, к росту кости). Также см. международные публикации WO 91/12018 (относящуюся, например, к заболеваниям кишечника); WO 92/09301 и WO 92/14480 (относящиеся, например, к заживлению ран); WO 93/08828 (относящуюся, например, к повреждению нейронов, ассоциированному с ишемией, гипоксией или нейродегенерацией); WO 94/16722 (относящуюся, например, к устойчивости к инсулину); WO 96/02565A1 (относящуюся, например, к комплексу IGF/IGFBP для стимуляции образования кости и для регуляции реструктурирования кости); публикацию заявки на выдачу патента США 2003/0100505 (относящуюся, например, к остеопорозу) и публикацию заявки на выдачу патента США 2005/0043240 (относящуюся к ожирению).

Хотя терапию IGF-1 используют для ряда физиологических показаний, результаты иногда непредсказуемы. Краткосрочные благоприятные эффекты иногда не сохраняются (см., например, Miller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)), и могут возникать неблагоприятные побочные эффекты, в частности, от введения высоких доз и/или длительного введения (см., например, Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994); Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)). Также сообщалось, что высокие концентрации IGF-1 повышают риск рака предстательной железы (Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)).

В соответствии с этим в данной области существует потребность в лучших путях лечения состояний, которые реагируют на IGF-1 и/или другие белки, которые связываются с белками, связывающими инсулиноподобный фактор роста. Настоящее изобретение удовлетворяет данные потребности и дополнительно предоставляет другие связанные с ними преимущества.

Сущность изобретения

Как обнаружено авторами настоящего изобретения, за счет замены остатка метионина в положении 59 IGF-1 дикого типа, который является химически нестабильным и может легко окисляться другой аминокислотой, как описано в настоящем документе, например, (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH, полученные в результате аналоги IGF-1 становятся химически более стабильными и как таковые менее чувствительными к окислению во время продукции, очистки, хранения и т.д.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к пептидным вариантам (т.е. аналогам) IGF-1 следующей формулы (I):

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577

в которой:

A-1 представляет собой Met, Ser или делетирована;

A1 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или делетирована;

A2 представляет собой Pro, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, Lys или делетирована;

A3 представляет собой Glu, Ala, Asp, Gln или делетирована;

A4 представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ser;

A5 представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A6 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A7 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A8 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A9 представляет собой Glu, Ala, Asp или Gln;

A10 представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A11 представляет собой Val, Ala, Ile или Leu;

A 12 представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu или Lys;

A13 представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Val;

A14 представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A15 представляет собой Gln, Ala, Asn, Asp или Glu;

A16 представляет собой Phe, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Trp или Tyr;

A17 представляет собой Val, Ala, Ile или Leu;

A18 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A19 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A20 представляет собой Asp, Ala, Asn, Gln или Glu;

A21 представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A 22 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A23 представляет собой Phe, Ala, Trp или Tyr;

A24 представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A25 представляет собой Phe, Ala, Trp или Tyr;

A26 представляет собой Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Ser или Thr;

A 27 представляет собой Lys, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Pro;

A28 представляет собой Pro, Ala, Arg или Lys;

A29 представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Ser;

A 30 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A31 представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A32 представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A33 представляет собой Ser, Ala, Thr или Val;

A34 представляет собой Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Thr;

A 35 представляет собой Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Thr;

A36 представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A37 представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A 38 представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A39 представляет собой Pro, Ala, Arg или Glu;

A40 представляет собой Gln, Ala, Asn, Asp или Glu;

A41 представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Ser;

A42 представляет собой Gly, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A43 представляет собой Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A44 представляет собой Val, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Lys;

A45 представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu или Lys;

A46 представляет собой Glu, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln или Lys;

A47 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A48 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A49 представляет собой Phe, Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

A50 представляет собой Arg, Ala, Lys, Ser или Thr;

A51 представляет собой Ser, Aib, Ala, Arg, Lys или Thr;

A52 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A53 представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Lys, Ser или Thr;

A54 представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A55 представляет собой Arg, Ala, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr или Val;

A56 представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A57 представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A58 представляет собой Glu, Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln или Lys;

A59 представляет собой Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Nle, Ser, D-Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

A60 представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A61 представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, D-аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A62 представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Val;

A63 представляет собой Pro, D-Pro, Ala, Ser, Thr или делетирована;

A 64 представляет собой Leu, D-Leu, des-Leu, Ala, Ile, Val или делетирована;

A65 представляет собой Lys, D-Lys, des-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val или делетирована;

A66 представляет собой Pro, D-Pro, Ala или делетирована;

A67 представляет собой Ala, D-Ala, Aib или делетирована;

A 68 представляет собой Lys, D-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val или делетирована;

A69 представляет собой Ser, D-Ser, Aib, Ala, Thr или делетирована;

A70 представляет собой Ala, D-Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или делетирована;

A71 представляет собой Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Lys, Ser, Thr или делетирована; и

R1 представляет собой OH или NH 2;

при условии, что боковые цепи каждой пары остатков A6 и A48, A47 и A52 и A18 и A61 образуют дисульфидную связь; и

также при условии, что, когда A59 представляет собой Leu, Ile, Nle, Thr или Val, аналог содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену или вставку, определенную в настоящем документе.

В формуле (I) предпочтительные аминокислотные замены и дополнения определены следующим образом:

A-1 представляет собой Met, Ser или делетирована;

A1 представляет собой Gly или делетирована;

A 2 представляет собой Pro, Lys или делетирована;

A3 представляет собой Glu или делетирована;

A4 представляет собой Thr;

A5 представляет собой Leu;

A6 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A7 представляет собой Gly;

A8 представляет собой Ala;

A9 представляет собой Glu;

A10 представляет собой Leu;

A11 представляет собой Val;

A 12 представляет собой Asp;

A13 представляет собой Ala;

A14 представляет собой Leu;

A15 представляет собой Gln;

A16 представляет собой Phe;

A17 представляет собой Val;

A18 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A19 представляет собой Gly;

A20 представляет собой Asp;

A21 представляет собой Arg;

A22 представляет собой Gly;

A23 представляет собой Phe;

A24 представляет собой Tyr;

A 25 представляет собой Phe;

A26 представляет собой Asn;

A27 представляет собой Lys, Arg или Pro;

A28 представляет собой Pro или Lys;

A29 представляет собой Thr;

A30 представляет собой Gly;

A31 представляет собой Tyr;

A32 представляет собой Gly;

A33 представляет собой Ser;

A 34 представляет собой Ser;

A35 представляет собой Ser;

A36 представляет собой Arg;

A37 представляет собой Arg;

A38 представляет собой Ala;

A39 представляет собой Pro;

A40 представляет собой Gln;

A 41 представляет собой Thr;

A42 представляет собой Gly;

A43 представляет собой Ile;

A44 представляет собой Val;

A45 представляет собой Asp;

A46 представляет собой Glu;

A47 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A48 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A49 представляет собой Phe, Arg, Leu или Thr;

A 50 представляет собой Arg или Ser;

A 51 представляет собой Ser, Aib, Arg или Thr;

A52 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A53 представляет собой Asp, Arg или Ser;

A54 представляет собой Leu или A6c;

A55 представляет собой Arg или Tyr;

A56 представляет собой Arg или Gln;

A57 представляет собой Leu;

A58 представляет собой Glu или Arg;

A59 представляет собой A6c, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Nle, Ser, D-Ser, Trp или Tyr;

A60 представляет собой Tyr или Phe;

A61 представляет собой Cys, hCys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A62 представляет собой Ala или Asn;

A63 представляет собой Pro, D-Pro, Thr или делетирована;

A64 представляет собой Leu, D-Leu, des-Leu или делетирована;

A65 представляет собой Lys, D-Lys, des-Lys, Arg или делетирована;

A66 представляет собой Pro, D-Pro или делетирована;

A67 представляет собой Ala, D-Ala, Aib или делетирована;

A68 представляет собой Lys, D-Lys, Arg или делетирована;

A69 представляет собой Ser, D-Ser, Aib, Thr или делетирована;

A70 представляет собой Ala, D-Ala, Glu или делетирована; и

A 71 представляет собой Asp, Glu, Lys, Ser или делетирована.

Подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A59 представляет собой Asn.

Другое подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A59 представляет собой Leu, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену или вставку, выбранную из группы, состоящей из Arg27, Arg65, Arg 68, Leu49, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys52, Thr51, Thr69 , Asp71, Glu71, Lys71 и Ser 71.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A59 представляет собой Nle, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Aib51, Aib67, Aib69 , A6c54, N-Me-Cys47, N-Me-Cys48 , Pen52 и Pen61.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A59 представляет собой Ile, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Arg58, Arg 49, Arg51 и Arg53.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A59 представляет собой Arg, Asp, A6c, Gln, Glu, Ser, Trp или Tyr.

Предпочтительные соединения формулы (I) представляют собой:

Пример 1: (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)

Пример 2: (Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)

Пример 3: (Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)

Пример 4: (Pro27, Lys 28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)

Пример 5: (Pro27, Lys28, Asn 59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)

Пример 6: (Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)

Пример 7: (Ser-Gly1, Asn 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)

Пример 8: (Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)

Пример 9: (Tyr55, Asn 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)

Пример 10: (Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)

Пример 11: (Asn59,62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)

Пример 12: (Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)

Пример 13: (Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)

Пример 14: (Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)

Пример 15: (Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 16: (Asn59, D-Leu64 )hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 17: (Asn59 , D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 18: (Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 19: (Asn59, D-Ala67 )hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 20: (Asn59 , D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 21: (Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 22: (Asn59, D-Ala70 )hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 23: (Arg27,65,68 , Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)

Пример 24: (Leu59, Arg65,68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)

Пример 25: (Leu49,59 )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)

Пример 26: (аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)

Пример 27: (аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)

Пример 28: (Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID N0:20)

Пример 29: (Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)

Пример 30: (Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)

Пример 31: (Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)

Пример 32: (Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)

Пример 33: (Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)

Пример 34: (N-Me-Cys47 , Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)

Пример 35: (Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)

Пример 36: (N-Me-Cys48 , Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)

Пример 37: (Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)

Пример 38: (hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQIDNO:30)

Пример 39: (Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID N0:31)

Пример 40: (Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)

Пример 41: (Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)

Пример 42: (A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)

Пример 43: (Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)

Пример 44: (Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)

Пример 45: (Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)

Пример 46: (Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)

Пример 47: (A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)

Пример 48: (Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)

Пример 49: (Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)

Пример 50: (Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)

Пример 51: (Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)

Пример 52: (Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)

Пример 53: (Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)

Пример 54: (Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46) и

Пример 55: (Met-Gly1 , Asn59)hIGF-1(1-70)-OH. (SEQ ID NO:47)

Подробное описание изобретения

В заявке используются следующие общепринятые сокращения:

Acc: 1-амино-1-цикло(C3-C9)алкилкарбоновая кислота

Acc включает:

A3c: 1-амино-1-циклопропанкарбоновую кислоту

A4c: 1-амино-1-циклобутанкарбоновую кислоту

A5c: 1-амино-1-циклопентанкарбоновую кислоту

A6c: 1-амино-1-циклогексанкарбоновую кислоту

Aib: аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -аминоизомасляная кислота

Ala или A: аланин

Arg или R: аргинин

Asn или N: аспарагин

Asp или D: аспарагиновая кислота

Cys или C: цистеин

цистин: дисульфидный димер цистеина

hCys: гомоцистеин

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys: бета-метилцистеин, т.е.

(2S,3S)-2-амино-3-меркаптомасляная кислота

N-Me-Cys: N-метилцистеин

Gln или Q: глутамин

Glu или E: глутаминовая кислота

Gly или G: глицин

Ile или I: изолейцин

Leu или L: лейцин

des-Leu: делетированный Leu

Lys или K: лизин

des-Lys: делетированный Lys

Met или M: метионин

Nle: норлейцин

Pen: пеницилламин

Phe или F: фенилаланин

Pro или P: пролин

Ser или S: серин

Thr или T: треонин

Trp или W: триптофан

Tyr или Y: тирозин

Val или V: валин

Все сокращения (например, Ala) аминокислот в данном описании обозначают структуру -NR-CR'(Rаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 )-CO-, в которой каждый из R' и Rаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 независимо представляет собой водород или боковую цепь аминокислоты (например, R'=H и Rаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 =CH3 для аланина) и в которой R=H или CH 3, кроме пролина, т.е.

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577

Пептид по данному изобретению также обозначают в настоящем документе в другом формате, например (Asn59 )hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1), с аминокислотами, замещенными по сравнению с природной последовательностью, размещенными между скобками (т.е. Asn вместо Met в положении 59 IGF-1 дикого типа). Интервал, находящийся в скобках, относится к тем аминокислотам, которые находятся в аналоге. Например, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 IGF-1(4-68)-OHаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 (SEQ ID NO:48) указывает, что аналог содержит аминокислоты от 4 до 68, которые соответствуют пептидной последовательности IGF-1 дикого типа. аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 NH2аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 в аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 IGF-1(1-70)-NH2аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 (SEQ ID NO:49) указывает на то, что C-конец пептида амидирован. аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 IGF-1(1-70)аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 или аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 IGF-1(1-70)-OHаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 указывает на то, что C-конец представляет собой свободную кислоту (SEQ ID NO:50).

Некоторые другие сокращения, применяемые в настоящем документе, определены следующим образом:

Act: ацетонитрил

Boc: трет- бутилоксикарбонил

BSA: бычий сывороточный альбумин

DCM: дихлорметан

DIPEA: диизопропилэтиламин

DMEM: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла

ДМФА: диметилформамид

DTT: дитиотреитол

ESI: ионизация электрораспылением

FCS: эмбриональная телячья сыворотка

Fmoc: 9-флуоренилметилоксикарбонил

HBTU: гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония

HOBt: N-гидроксибензотриазол

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

LC-MS: жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

MPAA: 4-меркаптофенилуксусная кислота

NMP: N-метилпирролидинон

OtBu: O-трет -бутиловый сложный эфир

Pbf: 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил

QC: контроль качества

tBu: трет-бутил

TCA: трихлоруксусная кислота

TCEP: трис-2-карбоксиэтилфосфин

TIS: триизопропилсилан

ТФУК: трифторуксусная кислота

Tris: 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол

Trt: тритил

УФ-спектроскопия: ультрафиолетовая спектроскопия

«Алкил» относится к углеводородной группе, содержащей один или несколько атомов углерода, где множественные атомы углерода, если они присутствуют, соединены одинарными связями. Примеры этой группы включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил и бутил. Алкильная углеводородная группа может быть линейной или может содержать одну или несколько ветвей или циклических групп, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, изопропил и трет-бутил.

«Замещенный алкил» относится к алкилу, в котором один или несколько водородных атомов углеводородной группы заменены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, SH, NH2, NHCH3, NO2, (C1-2)-алкила, замещенного 1-6 галогенами, CF3, OCH3, OCF3 и (CH2)0-4-COOH. В других вариантах осуществления присутствуют 1, 2, 3 или 4 заместителя.

«Арил» относится к необязательно замещенной ароматической группе, по меньшей мере с одним кольцом, имеющим конъюгированную систему пи-электронов, содержащей до трех конъюгированных или конденсированных кольцевых систем. Арил включает карбоциклический арил, гетероциклический арил и биарильные группы. Предпочтительно, арил представляет собой 5- или 6-членное кольцо. Предпочтительные атомы для гетероциклического арила представляют собой один или несколько атомов серы, кислорода и/или азота. Примеры арила включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, индол, хинолин, 2-имидазол и 9-антрацен. Арильные заместители выбирают из группы, состоящей из -C1-20-алкила, -C 1-20-алкокси, галогена, -OH, -CN, -SH, -NH2, -NO2, -C1-20-алкила, замещенного галогенами, -CF3, -OCF3 и -(CH2)0-20 -COOH. В других вариантах осуществления арил содержит 0, 1, 2, 3 или 4 заместителя.

«Алкиларил» относится к «алкилу», присоединенному к «арилу».

Процедуры синтеза

Представленные в качестве примера аналоги IGF-1 по настоящему изобретению получали посредством первой стадии синтеза пептидных фрагментов, второй стадии сшивания (лигирования) и третьей стадии фолдинга. Следующие процедуры синтеза иллюстрируют, как специалист-химик может обеспечить получение любого из представленных в качестве примера аналогов IGF-1 по настоящему изобретению.

A) Синтез пептидного фрагмента (Gln56, Asn59 )hIGF-1(48-70)-OH,т.е. Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Arg-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH _(SEQ ID NO:51)

Основанный на Fmoc твердофазный пептидный синтез применяли для сборки указанного в заголовке пептидного фрагмента с использованием вспомогательной микроволновой обработки на пептидном синтезаторе Liberty (CEM; Matthews, NC, USA). Первый фрагмент из 14 остатков, например остатков 57-70 hIGF-1, или пептид из C-концевых кислот синтезировали в масштабе 1,0 ммоль с использованием Fmoc-Ala-смолы Ванга (0,72 мг-экв./г). Полученный в результате пептидный фрагмент затем разделяли на четыре партии по 0,25 ммоль для удлинения и разделения. Образец смолы массой 1,36 г помещали в коническую пробирку на 50 мл вместе с 15 мл раствора 1:1 ДМФА и DCM, которую загружали в заданное положение в синтезатор. Затем смолу переносили в реакционный сосуд посредством автоматического процесса синтезатора. Использовали стандартный протокол Liberty для масштаба 1,0 ммоль. Протокол включал удаление N-концевой защитной группы Fmoc путем обработки 20 мл 20% пиперидина, содержащего 0,1 M HOBt в ДМФА. Исходная стадия снятия защиты с помощью микроволновой энергии (45 ватт, максимальная температура 75°C) и барботирования азотом (3 секунды включено, 7 секунд выключено) продолжалась в течение 30 секунд. Из реакционного сосуда удаляли раствор и смолу тщательно промывали ДМФА несколько раз. Затем добавляли следующую аминокислоту (цикл 1), которую следовало присоединить к растущему пептиду (Fmoc-Ser(tBu)-OH), полученную в виде маточного раствора 0,2 M в ДМФА (15 мл, 3 эквивалента). Добавляли 6,0 мл 0,45 M (3 эквивалента) HBTU в ДМФА, после чего вносили 3,0 мл 2 M (6 эквивалентов) DIPEA в NMP. Стадию присоединения проводили с использованием микроволновой энергии (20 ватт, максимальная температура 75°C) с барботированием азотом в том же отношении, как на стадии снятия защиты, в течение периода 5 минут. Затем из реакционного сосуда удаляли раствор в слив и повторяли стадию присоединения.

Протокол присоединения для Fmoc-Cys(Trt)-OH представлял собой слегка модифицированную версию стандартного протокола. Для остатков Cys в течение первых 2 минут не использовали микроволновую энергию.

Затем следовал 4-минутный отрезок использования микроволновой энергии (20 ватт, максимальная температура 50°C). Все аминокислоты вводили одинаковым путем, используя стратегию двойного присоединения на всем протяжении целой последовательности. Циклы синтеза для указанного в заголовке пептидного фрагмента после первого Ser были следующими: цикл 2, Fmoc-Lys(Boc)-OH; цикл 3, Fmoc-Ala-OH; цикл 4, Fmoc-Pro-OH; цикл 5, Fmoc-Lys(Boc)-OH; цикл 6, Fmoc-Leu-OH; цикл 7, Fmoc-Pro-OH; цикл 8, Fmoc-Ala-OH; цикл 9, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 10, Fmoc-Tyr(tBu)-OH; цикл 11, Fmoc-Asn(Trt)-OH; цикл 12, Fmoc-Glu(OtBu)-OH; и цикл 13, Fmoc-Leu-OH.

Как только исходный пептидный фрагмент был завершен, смолу переносили обратно в коническую пробирку на 50 мл с использованием ДМФА в качестве растворителя. Смолу вручную равномерно разделяли на четыре образца, которые помещали в четыре конические пробирки на 50 мл, которые затем устанавливали обратно в синтезатор. Оставшуюся часть указанного в заголовке пептида синтезировали в масштабе 0,25 ммоль. Используемый протокол был тем же самым, как тот, который использовали для синтеза в большем масштабе, однако использовали меньшие количества реагентов. Удаление N-концевой защитной группы Fmoc состояло из обработки раствором, содержащим 10 мл 20% пиперидина и 0,1 M HOBt в ДМФА. Исходная стадия снятия защиты с помощью микроволновой энергии (45 ватт, максимальная температура 75°C) и барботирования азотом (3 секунды включено, 7 секунд выключено) продолжалась в течение 30 секунд. Затем из реакционного сосуда удаляли раствор и смолу тщательно промывали несколько раз ДМФА. Затем вводили следующую аминокислоту (цикл 14), полученную в виде 0,2 M маточного раствора в ДМФА (5,0 мл, 4 эквивалента), в растущий пептид (Fmoc-Gln(tBu)-OH). Затем добавляли 2,0 мл 0,45 M раствора (4 эквивалента) HBTU в ДМФА, после чего вносили 1,0 мл 2 M раствора (8 эквивалентов) DIPEA в NMP.

Протоколы присоединения для Fmoc-Cys(Trt)-OH и Fmoc-Arg(Pbf)-OH представляли собой слегка модифицированные версии стандартного протокола. Для присоединения остатков Cys микроволновую энергию вначале выключали на первые 2 минуты, затем включали на 4 минуты (20 ватт, максимальная температура 50°C). Для присоединения остатков Arg микроволновую энергию не использовали при первом присоединении, однако требовалась вторая стадия стандартного присоединения. В циклах 14, 16 и 21 использовали процедуру кэппинга, которая следовала непосредственно за стадией присоединения, включающей добавление 7 мл 0,5 M уксусного ангидрида, содержащего 0,015 M HOBt и 2 мл 2 M DIPEA, причем оба соединения были растворены в NMP, используя при этом многостадийный протокол микроволновой обработки (50 ватт в течение 30 секунд с максимальной температурой 65°C, затем без обработки в течение 30 секунд, 50 ватт в течение 30 секунд с максимальной температурой 65°C, затем без обработки в течение 30 секунд). Циклы синтеза для указанного в заголовке пептидного фрагмента после Gln были следующими: цикл 15, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 16, Leu-OH; цикл 17, Fmoc-Asp(O tBu)-OH; цикл 18, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 19, Fmoc-Ser(t Bu)-OH; цикл 20, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 21, Fmoc-Phe-OH; и цикл 22, Fmoc-Cys(Trt)-OH.

После завершения пептидного остова удаляли N-концевую защитную группу Fmoc, а смолу вновь промывали ДМФА. Затем смолу переносили обратно в коническую пробирку на 50 мл с использованием ДМФА в качестве растворителя для переноса.

Смолу переносили в реакционный сосуд с фильтром из пористого стекла. Удаляли ДМФА и смолу интенсивно промывали DCM. Пептидный фрагмент отщепляли и освобождали от защиты обработкой следующим реагентом: 5% TIS : 5% вода : 90% ТФУК. Реакционную смесь оставляли инкубироваться в течение 3 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем раствор фильтровали в коническую пробирку на 50 мл. Уровень ТФУК снижали упариванием в потоке газообразного азота. Пептидный фрагмент осаждали добавлением 40 мл холодного простого этилового эфира с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°C в центрифуге с охлаждением (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Полученный в результате осадок растворяли в 0,1% ТФУК в воде перед очисткой путем препаративной ВЭЖХ, укомплектованной колонкой с обращенной фазой C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), с использованием градиента 0-60% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 50 минут при скорости потока 10 мл/мин. Очищенный пептидный фрагмент анализировали путем ВЭЖХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) с градиентом 5-80% ацетонитрила (0,08% ТФУК) в течение 30 минут со скоростью потока 1 мл/мин и путем масс-спектрометрии (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Пептидный фрагмент затем лиофилизировали и хранили при -50°C для дальнейшего применения.

B) Синтез пептидного фрагмента hIGF-1(1-47)-тиоэфир,т.е. Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-тиоэфирпропионил-Leu-NH 2 (SEQ ID NO:52)

N-концевой пептидный фрагмент, например остатки 1-47 hIGF-1, объединяли с использованием основанного на Boc-химии твердофазного пептидного синтеза. Для синтеза в масштабе 0,5 ммоль использовали пептидный синтезатор ABI 433A (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), модифицированный для запуска стандартного протокола FastBoc. Реакционный сосуд, содержащий 0,645 мг 0,77 мг-экв./г смолы Tampal, помещали на синтезатор. Для набухания смолы вводили ДМФА. Протокол ABI FastBoc 0,5 использовали для получения фрагмента. Каждый цикл состоял из деблокирования N-концевой защитной группы Boc с помощью чистой ТФУК с последующей обильной промывкой ДМФА. Предварительно упакованные картриджи на 2,0 ммоль (4 эквивалента) каждой аминокислоты затем растворяли в 0,40 M HBTU и ДМФА. После полного растворения каждой аминокислоты раствор автоматически перемещали в емкость для активации. Раствор DIPEA (чистого) вводили в сосуд для активации и подвергали воздействию смолы в течение длительного периода. Реакционный сосуд опорожняли и смолу промывали ДМФА. Для картриджей Arg/Asn требовалось продолжительное время активации, чтобы гарантировать растворимость. Кроме того, любую аминокислоту, добавленную непосредственно после присоединения остатка Gln, промывали DCM до и после выполнения протокола деблокирования. Время присоединения составляло 30 минут. Следующие аминокислоты использовали для указанного в заголовке пептидного фрагмента: Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(cHex)-OH, Boc-Glu(cHex)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ser(OBzl)-OH, Boc-Thr(OBzl)-OH и Boc-Tyr(BrZ)-OH.

После последнего цикла присоединения смолу промывали DCM и сушили. С пептидного фрагмента снимали защиту и отщепляли его от смолы с использованием обработки 10 мл фтороводорода и анизола. Реакции давали проходить в течение 70 минут, причем к этому моменту фтороводород вымывали струей азота. Остаток промывали простым эфиром и затем пептид растворяли в 10-15 мл ТФУК. Пептидный фрагмент осаждали путем фильтрования ТФУК в 40 мл холодного простого этилового эфира с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°C в центрифуге с охлаждением (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Полученный в результате осадок растворяли в 0,1% ТФУК в воде и очищали путем препаративной ВЭЖХ, укомплектованной колонкой с обращенной фазой C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), с использованием градиента 20-40% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 120 минут со скоростью потока 10 мл/мин. Очищенный пептидный фрагмент анализировали путем ВЭЖХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) с градиентом 5-80% ацетонитрила (0,08% ТФУК) в течение 30 минут со скоростью потока 1 мл/мин и путем масс-спектрометрии (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Затем пептидный фрагмент лиофилизировали и хранили при -50°C для дальнейшего использования.

C) Общая процедура сшивания

Полноразмерные аналоги hIGF-1 конструировали способом химического сшивания, которое происходит в природе между N-концевым фрагментом со сложным тиоэфиром, например hIGF-1(1-47)-S-(CH2)2 C(0)-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52), и C-концевым фрагментом, например (Gln56, Asn59)hIGF-1(48-70)-OH (SEQ ID NO:51), который содержит на своем N-конце остаток цистеина.

Для начала способа получения указанного в заголовке пептида 5,5 мг C-концевого фрагмента hIGF-1 растворяли в 0,5 мл буфера для сшивания (200 мМ фосфат натрия, pH 8,5, 6M гидрохлорид гуанидина) в пробирке Эппендорфа на 1,5 мл. К данному раствору добавляли 100 мкл раствора TCEP (40 мг/мл) и смесь встряхивали. Смесь переносили во вторую пробирку Эппендорфа, содержащую 6,5 мг N-концевого фрагмента hIGF-1 со сложным тиоэфиром. Реагенты тщательно смешивали. Небольшой образец (5 мкл) удаляли и анализировали путем LC-MS (LCQ Deca XP; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). К реакционной смеси добавляли 100 мкл раствора MPAA (20 мг/мл) с последующим перемешиванием. Образцы (5 мкл) периодически извлекали, чтобы следить за процессом реакции с использованием LC-MS. Приблизительно через 3,5 часа, когда реакция была близка к завершению, смесь гасили и разбавляли добавлением 9,5 мл 0,1% ТФУК в воде. Продукт сшивания очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, 10×250 мм) в градиенте 5-80% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Пик продукта лиофилизировали и хранили при -50°C. Массу не подвергшегося фолдингу продукта сшивания определяли путем физического измерения.

D) Общая процедура фолдинга (окислительно-восстановительная пара глутатиона) для примера 14,т.е. (Gln56, Asn 59)hIGF-1 (1-70)-OH (SEQ ID NO:14)

Белок, полученный в процессе сшивания на стадии C), как описано выше, растворяли в буфере для сшивания (200 мМ фосфат натрия, pH 8,5, 6M гидрохлорид гуанидина) до концентрации 1 мг/мл. Затем добавляли буфер для фолдинга (100 мМ Tris, pH 8,5, 1 мМ окисленный глутатион, 10 мМ восстановленный глутатион) до достижения конечной концентрации белка 0,25 мг/мл. Обеспечивали осуществление процесса фолдинга в течение 3 часов. После этого реакцию гасили путем добавления по каплям ТФУК до достижения в реакционной смеси pH аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 3. Затем продукт очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, колонка 10×250 мм) в градиенте 5-60% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Продукт лиофилизировали. Содержание белка определяли путем повторного растворения продукта в 0,1% ТФУК в воде, измеряя затем оптическую плотность при 280 нм (спектрофотометр NanoDrop ND1000). Затем белок анализировали для QC (ВЭЖХ и MS).

E) Процедура окисления для получения (глиоксилил-Gly 1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEO ID NO:53) из примера 7,т.е. (Ser-Gly1, Asn 59)hIGF-1(1-70)OH (SEQ ID NO:7)

Массу подвергнутого фолдингу аналога hIGF-1 определяли по оптической плотности при 280 нм в 0,1% ТФУК в воде (спектрофотометр NanoDrop ND1000). Белок, полученный в процессе фолдинга на стадии D), как описано выше, повторно растворяли в 50 мМ имидазольном буфере (pH 7,0) до конечной концентрации 2 мг/мл (2,66×10-4 M). Добавляли периодат натрия (NaIO4) (4 эквивалента), растворенный в имидазольном буфере, и полученный в результате раствор осторожно перемешивали. Реакции давали происходить при комнатной температуре без дальнейшего перемешивания. Через 5 минут реакцию гасили добавлением 10 эквивалентов этиленгликоля. Смеси давали отстояться в течение 15 минут при комнатной температуре. Смесь разбавляли 0,1% ТФУК в воде до конечного объема 10 мл. Затем продукт очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, колонка 10×250 мм) в градиенте 5-60% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Затем продукт лиофилизировали и хранили при -50°C до необходимого применения.

F) Процедура синтеза для примера 27,т.е. (аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:19)

Указанный в заголовке белок объединяли путем нативного химического сшивания с использованием hIGF(1-46)-тиопропионил-Leu-NH2 (SEQ ID NO:54) и C-концевого фрагмента, т.е. (аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(47-70) (SEQ ID NO:55). Сложный тиоэфир белка (7,4 мг, 1,45 мкмоль) и C-концевой фрагмент (3,8 мг, 1,38 мкмоль) растворяли в буфере для сшивания (6 M гидрохлорид гуанидина в 200 мМ фосфате натрия, pH 8,5, 400 мкл) и TCEP (80 мкл, 40 мг/мл, pH 7). Добавляли катализатор MPAA (80 мкл, 20 мг/мл, pH 7). Прогрессирование реакции отслеживали путем LC-MS на LCQ Deca XP (Thermo Finnigan) с колонкой Luna C18(2) (5 мкм, 4,6×100 мм) в градиенте 5-80% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 30 минут. Реакцию гасили разбавлением 1:10 dH2O c 0,1% ТФУК (об./об.). Неочищенную смесь центрифугировали и пропускали через стеклянный фильтр с порами 1,0 мкм для удаления какого-либо осадка MPAA. Полноразмерный белок очищали с использованием линейного градиента B 5-60% в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин на Vydac C18 (10 мкм, 10×250 мм). Белок определяли количественно путем УФ-спектроскопии (спектрофотометр NanoDrop ND1000) и лиофилизировали для дальнейшего применения.

Находящийся на хранении белок (1,8 мг, 235 нмоль) растворяли в растворе 200 мМ H2PO4аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -, 6 M гуанидиния-HCl, имеющем pH 8,5, до концентрации 1,0 мг/мл. Буфер для фолдинга (100 мМ Tris, 10 мМ глутатион, 1 мМ окисленный глутатион при pH 8,5) добавляли к раствору до достижения конечной концентрации белка 250 мкг/мл. Смесь оставляли инкубироваться при комнатной температуре, осуществляя при этом мониторинг методом ВЭЖХ. Как только достигалось равновесие (что визуализировалось в виде стабильного профиля ВЭЖХ), реакцию гасили путем перемешивания либо с уксусной кислотой, либо с ТФУК для доведения pH раствора до 3. Раствор очищали с использованием вначале стеклянного фильтра с порами 1,0 мкм и затем полупрепаративной колонки.

Подвергнутый фолдингу белок очищали с использованием линейного градиента B 5-60% в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Белок определяли количественно путем УФ-спектроскопии (спектрофотометр NanoDrop ND1000) и лиофилизировали. Получали приблизительно 92 мкг очищенного продукта с представлением выхода 5%. Массу белка подтверждали на Finnigan LCQ Advantage MAX MS.

G) Процедура синтеза для примера 36, т.е. (N-Me-Cys48, Nle59 )hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:28)

Указанный в заголовке белок объединяли путем нативного химического сшивания с использованием hIGF-1(1-46)-тиопропионил-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52) и C-концевого фрагмента, т.е. (N-Me-Cys48 , Nle59)hIGF-1(48-70) (SEQ ID NO:56). Сложный тиоэфир белка (4,3 мг, 824 нмоль) и C-концевой фрагмент (2,1 мг, 790 нмоль) растворяли в буфере для сшивания (400 мкл, 6 M гидрохлорид гуанидина в 200 мМ фосфате натрия, pH 8,5) и TCEP (80 мкл, 40 мг/мл, pH 7). Добавляли катализатор MPAA (80 мкл, 20 мг/мл, pH 7). Прогрессирование реакции отслеживали, используя LC-MS на LCQ Deca XP (Thermo Finnigan) с колонкой Luna C18(2) (5 мкм, 4,6×100 мм) в градиенте 5-80% ацетонитрила (0,1% ТФУК), в течение 30 минут. Реакцию гасили разбавлением 1:10 dH2 O c 0,1% ТФУК (об./об.). Неочищенную смесь центрифугировали и пропускали через стеклянный фильтр с порами 1,0 мкм для удаления какого-либо осадка MPAA. Полноразмерный белок очищали с использованием линейного градиента B 5-60% в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин на Vydac C18 (10 мкм, 10×250 мм). Белок определяли количественно путем УФ-спектроскопии (спектрофотометр NanoDrop ND1000) и лиофилизировали для дальнейшего применения.

Находящийся на хранении белок растворяли в растворе 200 мМ H 2PO4аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -, 6 M гуанидиния-HCl (pH 8,5) до достижения концентрации 1,0 мг/мл. Буфер для фолдинга (100 мМ Tris, 10 мМ глутатион, 1 мМ окисленный глутатион, pH 8,5) добавляли к раствору до достижения конечной концентрации белка 250 мкг/мл. Смесь оставляли инкубироваться при комнатной температуре, осуществляя при этом мониторинг методом ВЭЖХ. Как только достигалось равновесие (что визуализировалось в виде стабильного профиля ВЭЖХ), реакцию гасили либо уксусной кислотой, либо ТФУК до pH 3. Раствор очищали с использованием вначале стеклянного фильтра с порами 1,0 мкм и затем полупрепаративной колонки.

Подвергнутый фолдингу белок очищали с использованием линейного градиента B 5-60% в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Белок определяли количественно путем УФ-спектроскопии (спектрофотометр NanoDrop ND1000) и лиофилизировали. Получали приблизительно 0,415 мг очищенного продукта с предоставлением выхода 10,6%. Массу белка подтверждали на Finnigan LCQ Advantage MAX MS.

Специалистом в данной области могут быть получены другие пептиды по изобретению с использованием процедур синтеза, аналогичных тем, которые раскрыты в указанных выше примерах. Физические данные для соединений, примеры которых приведены в настоящем документе, даны в таблице 1.

Таблица 1
Номер примераМол. масса (ожидаемая) Мол. масса (ESI-MS) % очистки (ВЭЖХ)
1 7631,67631,699,9
26838,6 6839,595,2
37348,3 7347,993,0
47631,67632,1 97,7
5 6838,66839,3 95,9
6 7603,67602,599,9
77718,7 7718,799,9
87452,3 7454,199,9
97638,67639,7 99,9
10 7585,57586,0 99,9
11 7674,67675,399,9
127615,6 7616,999,9
137562,5 7563,699,9
147603,67605,1 98,5
15 7631,67634,1 96,8
16 7631,67633,297,2
177631,6 7632,995,1
187631,6 7631,696,7
197631,67631,9 97,9
20 7631,67631,8 98,5
21 7631,67631,797,6
227631,6 7631,898,1
237714,7 7713,999,9
247686,77686,7 99,9
25 7596,67596,7 99,9
26 7644,77645,599,9
277644,7 7644,999,9
287759,8 7760,4100
297745,87746,5 100
30 7758,87758,4 100
31 7717,77718,5100
327644,7 7645,5100
337644,7 7645,495,5
347644,77643,9 100
35 7628,77628,1 94,0
36 7644,77644,899,9
377644,7 7644,699,9
387644,7 7645,399,9
397628,77628,4 99,9
40 7658,77658,8 99,9
41 7658,77658,899,9
427642,7 7641,799,9
437671,8 7672,499,9
447641,77641,8 99,9
45 7699,87701,0 97,7
46 7657,77658,796,1
477642,7 7640,999,9
487632,6 7632,599,9
497703,77704,0 99,9
50 7604,67604,7 99,9
51 7680,77680,5100
527646,6 7646,2100
537645,6 7644,9100
547673,77674,7 99,9

Функциональные анализы

A) Анализ связывания с рецептором IGF-1 in vitro

Получали мембраны для исследований связывания радиоактивного лиганда путем гомогенизации клеток MCF-7 человека, экспрессирующих природный рецептор IGF-1 в 20 мл ледяного 50 мМ Tris-HCl посредством Brinkman Polytron (Westbury, NY, USA) (режим 6, 15 сек). Гомогенаты промывали дважды при центрифугировании (39000 g/10 минут) и конечные осадки ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl, содержащем 2,5 мМ MgCl 2 и 0,1% BSA.

Для анализа аликвоты инкубировали с 0,05 нМ [125I]IGF-1. Иногда включали немеченые конкурентные тестируемые пептиды. Конечный объем для анализа составлял 0,25 мл. После периода инкубации, равного 120 минут, (20°C) связанный [125I]IGF-1 (~2000 Ки/ммоль, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) отделяли от свободных радиоактивных частиц путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант декантировали и радиоактивные частицы, захваченные осадком, считывали путем гамма-спектрометрии (Wallac LKB, Gaithersburg, MD, USA). Специфическое связывание определяли как общий связанный [ 125I]IGF-1 минус тот, что связывался в присутствии 100 нМ IGF-1.

Данные по связыванию рецептора IGF-1 in vitro (т.е. значения ЕС50) для соединений, приведенных в качестве примеров в настоящем документе, приведены в таблице 2.

B) Анализ биологической активности IGF-1 in vitro

Мышиные клетки 3T3/R (получены от Dr. Е. Rozengurt из UCLA в Los Angeles, СА, USA) культивировали в 24-луночном планшете (DMEM+10% FCS) и инкубировали в течение 2 суток в культуре.

Для анализа среду удаляли и промывали один раз бессывороточной DMEM. Затем инкубировали без сыворотки в течение 24 часов. После сывороточного голодания добавляли [3Н]-тимидин и пептиды IGF-1. Затем клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C.

В конце инкубации среду аспирировали. Затем клетки отмывали ледяным 0,9% раствором NaCl. Затем добавляли 5% ледяной раствор ТСА для инкубации в течение 30 минут при 4°C. ТСА аспирировали и лунки инкубировали с 95% этанолом в течение 4 часов. Затем среду переносили во флакон для жидкостной сцинтилляции с целью оценки радиоактивности.

Данные по биологической активности IGF-1 in vitro (т.е. значения ЕС50) для соединений, примеры которых приведены в настоящем документе, также приведены в таблице 2.

C) Скрининг in vitro пептидов IGF-1 на перекрестную реактивность с инсулиновым рецептором на клетках U2OS

Клетки U2OS (каталожный № 93-0466С3, DiscoveRX Corporation, Fremont, СА, USA) высевали в количестве 6×105 клеток/мл в 96-луночный покрытый поли-D-лизином планшет за 16 часов до анализа в бессывороточной среде для анализа. Инсулин дикого типа (каталожный № 10908, Sigma, St. Louis, MO, USA), IGF-1 дикого типа (Increlex®, Tercica, Inc., Brisbane, CA, USA) или тестируемый пептид IGF-1, описанный в настоящей заявке, добавляли в интервале доз от 10 мкМ (микромолярная) до 0,15 нм (наномолярная) и инкубировали в течение 3 часов при 37°C с 5% CO2. Реагент PathHunterаналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 (каталожный № 93-001, DiscoveRX) получали по инструкциям производителя и добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Люминесценцию считывали на спектрофотометре для многомаркерного анализа планшетов Envision 2104 (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Анализировали активность каждого тестируемого пептида и сообщали в виде максимального/минимального (max/min) значений. Данные in vitro по перекрестной реактивности с инсулиновым рецептором (т.е. значения max/min) для соединений, примеры которых приведены в настоящем документе, также представлены в таблице 2.

Обнаружено, что многие из соединений, примеры которых приведены в настоящем документе, являются значительно более активными, чем IGF-1 дикого типа, который характеризуется значением IC50 4,59 нМ, значением EC50 3,75 нМ и значением max/min 2,1.

Таблица 2
Номер примераIC50 (нМ) EC50 (нМ) max/min
1 0,570,512,1
20,50 2,31N/A
32,41 7,17N/A
40,881,90 N/A
5 1,141,89 N/A
6 0,660,98N/A
74,11 7,41N/A
819,02 32,00N/A
93,628,31 N/A
10 2,901,09 N/A
11 1,853,34N/A
121,47 5,11N/A
131,25 7,02N/A
145,943,56 N/A
15 0,813,70 N/A
16 2,617,59N/A
172,77 4,59N/A
180,72 3,33N/A
192,777,69 N/A
20 1,603,13 N/A
21 1,573,95N/A
220,91 4,22N/A
232,69 3,86N/A
242,892,60 N/A
25 2,406,72 N/A
26 3,601,28N/A
270,58 1,13N/A
283,25 2,12N/A
2913,254,86 N/A
30 1,951,87 N/A
31 2,031,18N/A
322,66 5,45N/A
332,25 2,30N/A
34N/AN/A N/A
35 3,643,15 N/A
36 N/AN/AN/A
3723,25 3,42N/A
3823,13 4,21N/A
3928,100,93 N/A
40 N/AN/A N/A
41 N/AN/AN/A
421,49 2,01N/A
431,27 5,08N/A
446,313,69 N/A
45 9,276,24 N/A
46 N/AN/AN/A
471,46 1,31N/A
4818,49 1,81N/A
494,542,69 N/A
50 30,632,63 N/A
51 2,181,29N/A
521,29 2,44N/A
53N/A N/AN/A
543,492,34 N/A

Введение

Аналоги IGF-1 по данному изобретению могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых солей. Примеры таких солей включают, но не ограничиваются ими, соли, образованные с органическими кислотами (например, уксусной, молочной, малеиновой, лимонной, яблочной, аскорбиновой, янтарной, бензойной, метансульфоновой, толуолсульфоновой или памовой кислотой), неорганическими кислотами (например, соляной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой) и полимерными кислотами (например, дубильной кислотой, карбоксиметилцеллюлозой, полимолочной, полигликолевой кислотой или сополимерами полимолочной-гликолевой кислот).

Обычный способ получения соли пептида по настоящему изобретению хорошо известен в данной области и может быть осуществлен стандартными способами обмена соли. Например, соль ТФУК пептида по настоящему изобретению (соль ТФУК образуется в результате очистки пептида с использованием препаративной ВЭЖХ, в которой элюирование происходит содержащими ТФУК буферными растворами) преобразовывали в другую соль, такую как ацетатная соль, путем растворения пептида в небольшом количестве 0,25 н. водного раствора уксусной кислоты. Полученный в результате раствор наносили на колонку для полупрепаративной ВЭЖХ (Zorbax, 300 SB, C-8). Элюирование с колонки проводят (1) 0,1 н. водным раствором ацетата аммония в течение 0,5 часов, (2) 0,25 н. водным раствором уксусной кислоты в течение 0,5 часов и (3) линейным градиентом (от 20% до 100% раствора B в течение 30 мин) при скорости потока 4 мл/мин (раствор A представляет собой 0,25 н. водный раствор уксусной кислоты, и раствор B представляет собой 0,25 н. уксусную кислоту в смеси ацетонитрил/вода в соотношении 80:20). Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизируют досуха.

Дозировка активного ингредиента в композициях по данному изобретению может варьировать; однако необходимо, чтобы количество активного ингредиента было таким, чтобы получалась подходящая лекарственная форма. Выбранная дозировка зависит от требуемого терапевтического эффекта, от пути введения и от длительности лечения. Дозировка легко определяется профессиональным, компетентным врачом-терапевтом.

Соединения по данному изобретению могут быть введены пероральным, парентеральным (например, путем внутримышечной, интраперитонеальной, внутривенной или подкожной инъекции или посредством имплантата), назальным, вагинальным, ректальным, сублингвальным или местным путем введения и могут быть составлены с фармацевтически приемлемыми носителями для обеспечения лекарственных форм, подходящих для каждого пути введения.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешивают по меньшей мере с одним инертным фармацевтически приемлемым носителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы могут также включать, в качестве обычной практики, дополнительные субстанции, которые отличаются от таких инертных разбавителей, например смазки, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы могут также включать буферные средства. Таблетки и пилюли могут быть дополнительно получены с энтеросолюбильными покрытиями.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают, без ограничения, фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры и т.п., содержащие инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода. Помимо таких инертных разбавителей, композиции могут также включать вспомогательные средства, такие как увлажнители, эмульгирующие и суспендирующие средства, а также подсластители, вкусовые добавки и отдушки.

Препараты по данному изобретению для парентерального введения включают, без ограничения, стерильные водные или неводные растворы, суспензии, эмульсии и т.п. Примеры неводных растворителей или носителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и вводимые путем инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Такие лекарственные формы могут также содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, увлажняющие, эмульгирующие и диспергирующие средства. Препараты можно стерилизовать, например, путем фильтрования через задерживающий бактерии фильтр, путем введения в композиции стерилизующих средств, путем облучения композиций и/или путем нагревания композиций. Фармацевтические композиции, содержащие новые аналоги IGF-1, описываемые в настоящем документе, могут также быть получены в форме стерильных твердых композиций, которые могут растворяться в стерильной воде или какой-либо другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед использованием.

Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут содержать, в дополнение к активному веществу, эксципиенты, такие как масло какао или воск для суппозиториев.

Композиции для назального или сублингвального введения также получают со стандартными эксципиентами, хорошо известными в данной области.

Кроме того, соединение по данному изобретению можно вводить в композиции с замедленным высвобождением, такие как композиции, описанные в следующих патентах и патентных заявках. В патенте США № 5672659 описаны композиции с замедленным высвобождением, содержащие биоактивное средство и сложный полиэфир. В патенте США № 5595760 описаны композиции с замедленным высвобождением, содержащие биоактивное средство в гелеобразной форме. В патенте США № 5821221 описаны композиции с замедленным высвобождением, содержащие биоактивное средство и хитозан. В патенте США № 5916883 описаны композиции с замедленным высвобождением, содержащие биоактивное средство и циклодекстрин. В публикации PCT WO 99/38536 описаны абсорбируемые композиции с замедленным высвобождением, содержащие биоактивное средство. В публикации PCT WO 00/04916 описан способ получения микрочастиц, содержащих терапевтическое средство, такое как пептид, в системе эмульсии «масло в воде». В публикации PCT WO 00/09166 описаны комплексы, содержащие терапевтическое средство, такое как пептид, и фосфорилированный полимер. В публикации PCT WO 00/25826 описаны комплексы, содержащие терапевтическое средство, такое как пептид, и полимер, несущий неполимеризуемый лактон.

Кроме того, изобретение, описанное в патенте США № 7258864, относится к способу лечения субъекта с дефицитом инсулиноподобного фактора роста-1 (IGFD), включающему введение пациенту педиатрического профиля эффективного количества немодифицированного IGF-1, где субъект характеризуется следующим: a) во время лечения или перед исходным лечением IGF-1 имеет или имел рост, по меньшей мере, приблизительно на 2 стандартных отклонения (SD) ниже нормального среднего роста для соответствующего возраста и пола, и b) во время лечения или перед исходным лечением IGF-1 имеет или имел уровень IGF-1 в крови, по меньшей мере, приблизительно на -1 SD ниже нормальных средних уровней, где субъект не страдает от синдрома Ларона или синдрома частичной нечувствительности к гормону роста и где указанное введение эффективно для лечения IGFD у субъекта.

Аналогично, изобретение, описанное в WO 2006/130769, относится к способу лечения субъекта с идиопатической низкорослостью (ISS), включающему введение пациенту педиатрического профиля, страдающему ISS, характеризующемуся неполной активностью или неполной сигнализацией эндогенного гормона роста, количества IGF-1, эффективного для ускорения роста у субъекта, где субъект дополнительно характеризуется следующим: a) во время лечения или перед исходным лечением IGF-1 имеет или имел рост, по меньшей мере, приблизительно на 2 стандартных отклонения (SD) ниже нормального среднего роста для соответствующего возраста и пола, и b) имеет уровни GH и IGF-1 в крови, которые являются, по меньшей мере, нормальными для субъекта того же возраста и пола.

Кроме того, новые аналоги, описываемые в настоящем документе, могут быть введены отдельно или в сочетании с другим терапевтическим средством, что определяется профессиональным врачом-терапевтом.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое им обычно придается специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение. Также, все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем документе, включены, таким образом, в него путем ссылки, причем каждая в полном объеме.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Аналог-агонист IGF-1 формулы (I),

аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577

в которой:

A-1 представляет собой Ser или делетирована;

A1 представляет собой Gly или делетирована;

A2 представляет собой Pro или делетирована;

A3 представляет собой Glu или делетирована;

A4 представляет собой Thr;

A5 представляет собой Leu;

A6 представляет собой Cys;

A7 представляет собой Gly;

A8 представляет собой Ala;

A9 представляет собой Glu;

A10 представляет собой Leu;

A11 представляет собой Val;

A12 представляет собой Asp;

A 13 представляет собой Ala;

A14 представляет собой Leu;

A15 представляет собой Gln;

A16 представляет собой Phe;

A17 представляет собой Val;

A18 представляет собой Cys;

A19 представляет собой Gly;

A20 представляет собой Asp;

A21 представляет собой Arg;

A22 представляет собой Gly;

A23 представляет собой Phe;

A24 представляет собой Tyr;

A25 представляет собой Phe;

A26 представляет собой Asn;

A27 представляет собой Lys, Arg или Pro;

A28 представляет собой Pro или Lys;

A29 представляет собой Thr;

A30 представляет собой Gly;

A31 представляет собой Tyr;

A32 представляет собой Gly;

A33 представляет собой Ser;

A34 представляет собой Ser;

A35 представляет собой Ser;

A36 представляет собой Arg;

A37 представляет собой Arg;

A38 представляет собой Ala;

A39 представляет собой Pro;

A40 представляет собой Gln;

A41 представляет собой Thr;

A42 представляет собой Gly;

A43 представляет собой Ile;

A44 представляет собой Val;

A45 представляет собой Asp;

A46 представляет собой Glu;

A47 представляет собой Cys, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys;

A48 представляет собой Cys;

A49 представляет собой Phe, Arg, Leu или Thr;

A50 представляет собой Arg или Ser;

A 51 представляет собой Ser или Thr;

A52 представляет собой Cys или аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys;

A53 представляет собой Asp, Arg или Ser;

A54 представляет собой Leu или A6c;

A55 представляет собой Arg или Tyr;

A56 представляет собой Arg или Gln;

A 57 представляет собой Leu;

A58 представляет собой Glu;

A59 представляет собой Asn, Leu, Nle, Ile, Arg, A6c, Glu, Trp, Tyr;

A60 представляет собой Tyr или Phe;

A61 представляет собой Cys;

A62 представляет собой Ala или Asn;

A63 представляет собой Pro, D-Pro или делетирована;

A64 представляет собой Leu, D-Leu или делетирована;

A65 представляет собой Lys, D-Lys, Arg или делетирована;

A66 представляет собой Pro, D-Pro или делетирована;

A67 представляет собой Ala, D-Ala или делетирована;

A68 представляет собой Lys, D-Lys, Arg или делетирована;

A69 представляет собой Ser, D-Ser, Aib, Thr или делетирована;

A70 представляет собой Ala, D-Ala или делетирована; и

A71 представляет собой Glu, Lys, Ser или делетирована;

R1 представляет собой OH или NH2;

при условии, что боковые цепи каждой пары остатков A6 и A48, A 47 и A52 и A18 и A61 образуют дисульфидную связь; и

также при условии, что, когда A 59 представляет собой Leu, Ile или Nle, аналог содержит по меньшей мере одну дополнительную замену или вставку аминокислоты согласно Формуле I;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, где указанный аналог представляет собой:

(Asn59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 1)

(Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO: 2)

(Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO: 3)

(Pro27, Lys28, Asn59 )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 4)

(Pro27, Lys 28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO: 5)

(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 6)

(Ser-1-Gly1, Asn 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 7)

(Tyr55 , Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 9)

(Thr 49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 10)

(Asn59,62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 11)

(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 12)

(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 13)

(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 14)

(Asn59, D-Pro63 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Leu64 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Lys65 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Pro66 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Ala67 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Lys68 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Ser69 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Ala70 )hIGF-1(1-70)-OH;

(Arg27,65,68, Leu59 )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 15)

(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 16)

(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 17)

(аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 18)

(аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 19)

(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 20)

(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 22)

(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 23)

(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 24)

(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 25)

(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 27)

(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 34)

(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 35)

(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 36)

(A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 39)

(Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 41)

(Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 43)

(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 44) или

(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 46)

или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, в котором А59 представляет собой Asn; или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Аналог-агонист IGF-1 по п.3, где указанный аналог представляет собой:

(Asn59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 1)

(Asn 59)hIGF-1(1-62)-ОН; (SEQ ID NO: 2)

(Asn59 )hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO: 3)

(Pro27, Lys 28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 4)

(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO: 5)

(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 6)

(Ser-1-Gly1, Asn 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 7)

(Tyr55 , Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 9)

(Thr 49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 10)

(Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 11)

(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 12)

(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)

(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)

(Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;

(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-ОН; или

(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;

или его фармацевтически приемлемая соль.

5. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, в котором А59 представляет собой Leu; или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Аналог-агонист IGF-1 по п.5, в котором указанная по меньшей мере одна дополнительная замена или вставка аминокислоты выбрана из группы, состоящей из Arg27, Arg65, Arg68, Leu 49, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys52, Thr51, Thr69 , Glu71, Lys71 и Ser71; или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Аналог-агонист IGF-1 по п.5 или 6, где указанный аналог представляет собой:

(Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 15)

(Leu59, Arg65, 68 )hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 16)

(Leu49, 59 )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 17)

(аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 18)

(аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие   аминокислотную замену в положении 59, патент № 2511577 -Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 19)

(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 20)

(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 22)

(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 23)

(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 24) или

(Thr51, Leu59 )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 25)

или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, в котором А59 представляет собой Nle; или его фармацевтически приемлемая соль.

9. Аналог-агонист IGF-1 по п.8, в котором указанная по меньшей мере одна дополнительная замена аминокислоты представляет собой Aib69 или A6c54; или его фармацевтически приемлемая соль.

10. Аналог-агонист IGF-1 по п.8 или 9, где указанный аналог представляет собой:

(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 27) или

(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO:34)

или его фармацевтически приемлемая соль.

11. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, где А59 представляет собой Ile; или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Аналог-агонист IGF-1 по п.11, в котором указанная по меньшей мере еще одна замена аминокислоты представляет собой Arg 49 или Arg53; или его фармацевтически приемлемая соль.

13. Аналог-агонист IGF-1 по п.11 или 12, где указанный аналог представляет собой:

(Arg53, Ile 59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 35) или

(Arg 49, Ile59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO:36)

или его фармацевтически приемлемая соль.

14. Аналог-агонист IGF-1 по п.1, в котором А59 представляет собой Arg, A6c, Glu, Trp или Tyr; или его фармацевтически приемлемая соль.

15. Аналог-агонист IGF-1 по п.14, где указанный аналог представляет собой:

(A6c59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 39)

(Trp59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 41)

(Tyr59)hIGF-1(1-70)-ОН; (SEQ ID NO: 43)

(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 44) или

(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 46)

или его фармацевтически приемлемая соль.

16. Фармацевтическая композиция для применения при лечении IGF-1-опосредованных состояний или заболеваний, содержащая эффективное количество аналога-агониста по любому из пп.1-15, где указанное состояние или заболевание выбраны из группы, состоящей из низкорослости, ожирения, потери массы, кахексии, анорексии, нейродегенеративных нарушений, связанных с фиброзом состояний, нарушений хрящевой ткани, костных заболеваний, воспалительных нарушений, кишечных нарушений, резистентности к инсулину, диабета, диабетического кетоацидоза, синдрома Рабсона-Менденхолла, ретинопатии, акромегалии, фиброзно-мышечной гиперплазии и сердечных нарушений; и где указанное лечение включает стадию введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества указанного аналога или фармацевтической композиции.

17. Способ лечения низкорослости, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного аналога-агониста по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.16.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2511577

patent-2511577.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/62 инсулины

Патенты РФ в классе C07K14/62:
инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения -  патент 2527893 (10.09.2014)
новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие -  патент 2524423 (27.07.2014)
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
производные инсулина -  патент 2518460 (10.06.2014)
аналоги инсулина с ацильной и алкиленгликолевой группировкой -  патент 2514430 (27.04.2014)
хроматографические способы и соединения, очищенные этими способами -  патент 2508294 (27.02.2014)
способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера -  патент 2495881 (20.10.2013)
способ получения рекомбинантного инсулина гларгина -  патент 2495131 (10.10.2013)
препаративный хроматографический способ на основе нелинейного градиента и продукты, очищенные этим способом -  патент 2489441 (10.08.2013)
способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) -  патент 2458989 (20.08.2012)

Класс C12N15/17 инсулины

Патенты РФ в классе C12N15/17:
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
рекомбинантная плазмидная днк phig05, кодирующая гибридный белок с проинсулином glargine человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк phig05, и штамм бактерий escherichia coli jm109/phig05-продуцент гибридного белка с проинсулином glargine человека -  патент 2515115 (10.05.2014)
рекомбинатная плазмидная днк рнi03 кодирующая, гибридный белок с проинсулином человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк рнi03, и штамм бактерий escherichia coli jm109/phi03-продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека -  патент 2515061 (10.05.2014)
рекомбинантная плазмидная днк philp07, кодирующая гибридный белок с проинсулином lispro человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк philp07, и штамм бактерий escherichia coli jm109/philp07-продуцент гибридного белка с проинсулином lispro человека -  патент 2514480 (27.04.2014)
стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста -  патент 2477287 (10.03.2013)
способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека -  патент 2451750 (27.05.2012)
фармацевтическая композиция для генной терапии заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа (ифр-1, igf-1) -  патент 2372941 (20.11.2009)
рекомбинантная плазмидная днк phins11, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк phins11, штамм бактерий escherichia coli jm109/phins11 - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека и способ получения инсулина человека -  патент 2354702 (10.05.2009)
рекомбинантная плазмидная днк pas-2, кодирующая полипептид проинсулина aspart человека, и штамм бактерий escherichia coli bas2 - продуцент рекомбинантного проинсулина aspart -  патент 2337964 (10.11.2008)
рекомбинантная плазмидная днк pgg-1, кодирующая полипептид проинсулина glargin человека и штамм бактерий escherichia coli bgg18 - продуцент рекомбинантного проинсулина glargin -  патент 2325440 (27.05.2008)

Класс C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

Патенты РФ в классе C12N15/63:
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
способ получения наноматериала на основе рекомбинантных жгутиков археи halobacterium salinarum -  патент 2526514 (20.08.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новая мутация, вовлеченная в повышенную толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам -  патент 2525933 (20.08.2014)
способ создания трансгенных животных со стабильным и высоким уровнем экспрессии целевого белка в молоке -  патент 2525712 (20.08.2014)
синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии -  патент 2524431 (27.07.2014)

Класс C12N1/00 Микроорганизмы, например простейшие; их композиции; способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Патенты РФ в классе C12N1/00:
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5031 для производства хересных виноматериалов -  патент 2529838 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5030 для производства белых столовых вин -  патент 2529834 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5032 для производства красных столовых виноматериалов -  патент 2529833 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5029 для производства десертных вин -  патент 2529832 (27.09.2014)
способ культивирования дрожжей phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин -  патент 2529715 (27.09.2014)
способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам -  патент 2529367 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)

Класс C12N5/10 клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

Патенты РФ в классе C12N5/10:
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование -  патент 2527891 (10.09.2014)
антитела против g-белка распираторно-синцитиального вируса (rsv) -  патент 2526517 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
средство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения -  патент 2522778 (20.07.2014)
одноцепочечное антитело к раково-эмбриональному антигену, химерный мономолекулярный т-клеточный рецептор, вектор и клетка-хозяин для обеспечения экспрессии такого рецептора и способ диагностики или лечения. -  патент 2522004 (10.07.2014)
средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток -  патент 2519714 (20.06.2014)

Класс A61K38/28 инсулины

Патенты РФ в классе A61K38/28:
инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения -  патент 2527893 (10.09.2014)
композиции для доставки белков и методы их применения -  патент 2526904 (27.08.2014)
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
твердая кишечнорастворимая лекарственная форма с-пептида проинсулина для перорального применения (варианты) и способ ее получения (варианты) -  патент 2522897 (20.07.2014)
применение сверхбыстродействующего инсулина -  патент 2519706 (20.06.2014)
фармацевтическая композиция -  патент 2519099 (10.06.2014)
конъюгат инсулина с применением фрагмента иммуноглобулина -  патент 2519073 (10.06.2014)
производные инсулина -  патент 2518460 (10.06.2014)
аналоги инсулина с ацильной и алкиленгликолевой группировкой -  патент 2514430 (27.04.2014)
микрочастицы дикетопиперазина с определенными удельными площадями поверхности -  патент 2509555 (20.03.2014)

Класс A61P5/50 для увеличения или потенциирования активности инсулина

Патенты РФ в классе A61P5/50:
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
лекарственное средство, включающее совместное применение или комбинацию ингибитора dpp-iv и другого лекарственного средства для лечения диабета -  патент 2523552 (20.07.2014)
хиназолинон, хинолон и родственные аналоги в качестве модуляторов сиртуина -  патент 2519779 (20.06.2014)
лекарственные формы инсулина, обладающие быстрым усвоением -  патент 2506945 (20.02.2014)
новое производное 1,2,3,4-тетрагидрохиноксалина, содержащее в качестве заместителя фенильную группу, имеющую структуру эфира сульфокислоты или амида сульфокислоты, и обладающее связывающей активностью в отношении рецептора глюкокортикоидов -  патент 2498980 (20.11.2013)
способ прогнозирования эффективности лечения диабетической полинейропатии у больных сахарным диабетом 2 типа и дислипидемией -  патент 2491925 (10.09.2013)
усовершенствованная система доставки сухого порошкообразного лекарственного средства -  патент 2487731 (20.07.2013)
конъюгированные липидные производные -  патент 2480447 (27.04.2013)
способ предотвращения побочных эффектов glp-1 -  патент 2474415 (10.02.2013)
способ лечения метаболического синдрома -  патент 2457834 (10.08.2012)


Наверх