предшественник искусственной почки и способ его получения

Формула изобретения

1. Предшественник искусственной почки для трансплантации, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона), перенесенные из живого организма.

2. Предшественник искусственной почки по п.1, где не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего принадлежит эмбриону млекопитающего, не относящегося к человеку, на стадии, когда экспрессия главного комплекса тканевой совместимости еще не установилась.

3. Предшественник искусственной почки по п.1, где предшественник может приобретать потенциал для получения эритропоэтина после трансплантации в сальник млекопитающего.

4. Способ получения предшественника искусственной почки по п.1, предусматривающий этапы:

(I) выделение метанефроса из млекопитающего, не относящегося к человеку;

(II) замораживания метанефроса млекопитающего, не относящегося к человеку, выделенного из живого организма;

(III) размораживания замороженного метанефроса млекопитающего, не относящегося к человеку; и

(IV) переноса мезенхимных стволовых клеток млекопитающего (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона) в метанефрос, не относящийся к человеку, вне живого организма до замораживания (II) или после размораживания (III).

5. Способ по п.4, в котором метанефрос, не относящийся к человеку, используемый в (II), представляет собой метанефрос, выделенный из эмбриона млекопитающего, не относящегося к человеку, на стадии, когда экспрессия главного комплекса тканевой совместимости еще не установилась.

6. Способ по п.4, в котором предшественник искусственной почки может приобретать потенциал для продуцирования эритропоэтина после трансплантации в сальник млекопитающего.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к предшественнику искусственной почки и способу его получения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Почки являются основным органом, получающим эритропоэтин; сниженное получение эритропоэтина, сопровождающее почечную недостаточность, вызывает почечную анемию в качестве осложнения.

В последнее время в качестве терапевтических методов нового поколения для лечения почечной анемии были предложены методы, в которых посредством регенеративной медицинской технологии получают искусственную почку или ее предшественника, обладающие возможностью продуцирования эритропоэтина, после чего они трансплантируются больным почечной анемией. Например, в Патентном документе 1 излагается способ получения предшественника эритропоэтин-продуцирующего органоида (искусственной почки), предусматривающий этапы трансплантации изолированной мезенхимной стволовой клетки, полученной из эмбриона млекопитающего, находящегося в беременном млекопитающем-носителе, или из эмбриона, выделенного из беременного млекопитающего-носителя, посредством чего индуцируется дифференцировка мезенхимной стволовой клетки, при этом местом, в которое мезенхимная стволовая клетка должна быть трансплантирована, является нефрогенная область эмбриона, и время трансплантации соответствует стадии, на которой иммунная система носителя все еще является иммунологически толерантной.

Однако в данном способе существует проблема сложности процесса, поскольку существует необходимость в сборе околоплодной жидкости у беременного млекопитающего непосредственно перед трансплантацией предшественника искусственной почки пациенту, а также в подтверждении биологической безопасности предшественника. Кроме того, мезенхимные стволовые клетки должны быть инъецированы в соответствующую область эмбриона, которая может стать почкой в будущем; данная операция требует высокой квалификации. Кроме того, поскольку мезенхимные стволовые клетки должны быть инъецированы в эмбрион в то время, когда иммунная система носителя находится в состоянии иммунной толерантности, то гибкость схемы лечения в целом является низкой. В данном способе трудно получить функционального предшественника искусственной почки, если не выполняется культивирование эмбриона целиком; при этом возникает риск загрязнения в процессе культивирования, и является необходимым проведение сложного процесса очистки после культивирования.

Следовательно, существует потребность в разработке способа получения предшественника искусственной почки, в котором 1) биологическая безопасность предшественника искусственной почки может быть легко протестирована до трансплантации пациенту, 2) операция является простой, 3) может быть обеспечена гибкость всего графика лечения и 4) не требуется проведения операции культивирования.

(Документы известного уровня техники)

(Патентный документ)

Патентный документ 1: WO 2008/004598

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Задачей настоящего изобретения является предоставление способа получения предшественника искусственной почки, в котором 1) биологическая безопасность предшественника искусственной почки может быть легко протестирована до трансплантации пациенту, 2) операция является простой, 3) может быть обеспечена гибкость всего графика лечения и 4) не требуется проведения операции культивирования.

Решение задачи

Изобретатели настоящего изобретения провели широкомасштабные исследования для решения описанной выше задачи; в результате изобретатели обнаружили, что вышеописанные задачи могут быть решены посредством использования предшественника искусственной почки, полученного путем замораживания и размораживания метанефроса, выделенного из эмбриона, и переноса извлеченных у пациента мезенхимных стволовых клеток в размороженный метанефрос, и разработали настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим элементам.

(1) Предшественник искусственной почки, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма.

(2) Предшественник искусственной почки, описанный в (1), где метанефрос принадлежит эмбриону млекопитающего на стадии, когда экспрессия MHC еще не установилась.

(3) Предшественник искусственной почки, описанный в (1), где предшественник может приобретать потенциал для получения эритропоэтина после трансплантации в сальник млекопитающего.

(4) Способ получения предшественника искусственной почки, предусматривающий этапы:

(I) замораживания метанефроса млекопитающего, выделенного из живого организма;

(II) размораживания замороженного метанефроса млекопитающего; и

(III) переноса мезенхимных стволовых клеток млекопитающего в метанефрос вне живого организма до замораживания (I) или после размораживания (II).

(5) Способ, описанный в (4), в котором метанефрос, используемый в (I), представляет собой метанефрос, выделенный из эмбриона млекопитающего на стадии, когда экспрессия MHC еще не установилась.

(6) Способ, описанный в (4), в котором предшественник искусственной почки может приобретать потенциал для получения эритропоэтина после трансплантации в сальник млекопитающего.

Эффект изобретения

С использованием способа по настоящему изобретению, биологическая безопасность предшественника искусственной почки может быть легко протестирована до трансплантации. С использованием способа по настоящему изобретению можно получить предшественник искусственной почки посредством простых операций. При использовании способа по настоящему изобретению разрабатываемый график лечения может быть гибким, поскольку предшественник искусственной почки может получаться с необходимыми временными интервалами посредством использования хранящегося в замороженном виде метанефроса. Кроме того, поскольку способ по настоящему изобретению в основном устраняет потребность в операции культивирования, то он не включает в себя риск загрязнения и не требует сложного процесса очистки после культивирования.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем изобретении представлен предшественник искусственной почки, содержащий метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма.

В настоящем изобретении «искусственная почка» относится к клеточной структуре, но не к единственной клетке, имеющей потенциал для получения эритропоэтина, являющегося функцией, которой почки обладают в природе. «Искусственная почка» в настоящем изобретении может не обладать функцией фильтрации отходов и воды в крови и выделяемой моче. Каждая клетка искусственной почки контактирует с другими клетками в трех измерениях, за исключением своей поверхности, при этом смежные клетки обмениваются информацией через межклеточное соединение, и может обладать потенциалом для регуляции получения эритропоэтина.

«Предшественник» относится к ткани, которая превращается в искусственную почку при помещении в живой организм. Несмотря на то что «предшественник» обладает факторами, необходимыми для потенциального получения эритропоэтина и регуляции получения, он находится в состоянии, в котором потенциалы для получения эритропоэтина и регуляции получения не активизируются из-за фактора окружающей среды. Предшественник искусственной почки обладает способностью приобретения потенциала для получения эритропоэтина после трансплантации в сальник млекопитающего.

«Потенциал для регуляции получения эритропоэтина» означает способность к получению больших объемов эритропоэтина (объема, требующегося для уменьшения интенсивности анемии) в моменты времени, в которые организму реципиента (пациента) требуется больший объем эритропоэтина, чем в нормальном состоянии (в случае анемии и т.п.), и получению объема эритропоэтина, требующегося для сохранения нормального состояния организма в моменты времени, в которые реципиент (пациент) находится в нормальном состоянии (интенсивность анемии была уменьшена и т.п.). То есть искусственная почка по настоящему изобретению обладает преимуществами относительно обычных клеток, получающих эритропоэтин, состоящими в том, что она способна получать объем эритропоэтина, требующийся для реципиента (пациента), и способна получать эритропоэтин непрерывно в течение длительного периода времени с помощью извлечения необходимых питательных веществ из кровеносных сосудов сальника.

В настоящем изобретении «метанефрос» относится к области, соответствующей возникновению почек в эмбрионе млекопитающего. Метанефрос, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно является таким, что бластные клетки почки находятся в состоянии прорастания до начала развития. Метанефрос расположен вокруг области прорастания зачатка мочеточника в эмбрионе млекопитающего, конкретнее, между сомитом и боковой пластинкой. Метанефрос предпочтительно представляет собой метанефрогенную мезодерму.

В качестве примеров млекопитающих, из которых получается метанефрос, можно упомянуть лабораторных животных, таких как грызуны, например мыши, крысы, хомяки и морские свинки, а также кролики; домашних животных, таких как свиньи, коровы, козы, лошади, овцы и норки; животных-компаньонов, таких как собаки и кошки; приматов, таких как люди, обезьяны, макаки-резус, мартышки, орангутаны и шимпанзе и т.п. Предпочтительными млекопитающими являются крыса и свинья.

Метанефрос выделяется из эмбриона млекопитающего вне живого организма. В качестве эмбриона подходит для использования эмбрион, в котором экспрессия MHC (главного комплекса тканевой совместимости) еще не выражена. Посредством использования метанефроса на этой стадии можно избежать иммунных реакций, сопровождающих трансплантацию предшественника искусственной почки реципиенту. Если эмбрион берется у не относящегося к приматам млекопитающего, то является предпочтительным, чтобы метанефрос выделялся на стадии до появления экзогенного антигена (углеводный антиген, такой как -Gal). Например, в экспериментах с крысами используется эмбрион в диапазоне обычно от E (день эмбриональной стадии) 9 до 16, предпочтительно от E10 до 15, предпочтительнее от E11 до 14. Эмбрион на аналогичных стадиях также подходит для использования в случае других млекопитающих. Однако предшествующие или последующие стадии также могут быть использованы в случае выбора соответствующих условий. Выделение метанефроса из эмбриона может выполняться с использованием стереомикроскопа и т.п.

Операция замораживания метанефроса выполняется в жидкости для криоконсервации, обычно используемой для замораживания ткани или клеток млекопитающих. Жидкость для криоконсервации содержит криоконсервант, такой как DMSO, глицерин и т.п. Концентрация криоконсерванта обычно находится в диапазоне от 5 до 30% по массе, предпочтительно от 10 до 20% по массе. Консервирующая жидкость может содержать сыворотку. Концентрация сыворотки находится в диапазоне от 5 до 50% по массе, предпочтительно от 10 до 30% по массе. В качестве предпочтительных жидкостей-криоконсервантов могут быть упомянуты раствор ET-KYOTO, содержащий DMSO и FCS, CELLBANKER (зарегистрированный торговый знак) и т.п.

Посредством замораживания метанефроса можно подавить иммунные реакции, возникающие при трансплантации предшественника искусственной почки реципиенту (пациенту).

Замороженный метанефрос может храниться в замороженном состоянии практически бессрочно и может быть использован по мере необходимости после размораживания и возвращения в активное состояние. Температура в течение криоконсервации обычно составляет от -80 до -200°C, предпочтительно -196°C (в жидком азоте). Поскольку предшественник искусственной почки может получаться в необходимые интервалы времени благодаря криоконсервации метанефроса, то разрабатываемый график лечения может быть гибким.

Замороженный метанефрос подвергается операции размораживания в физиологической культуральной среде в соответствии с обычным методом. Метод размораживания не ограничивается; например, при использовании замораживающей трубы, плавающей в терморегулируемой ванне при 37°C, замороженный метанефрос размораживается посредством добавления к нему физиологической культуральной среды по каплям. В целях исключения загрязнения криоконсервационной жидкости предпочтительно промывание размороженного метанефроса физиологической культуральной жидкостью.

Метанефрос, используемый в предшественнике искусственной почки по настоящему изобретению, содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма.

«Мезенхимные стволовые клетки» в широком смысле означают популяцию стволовых клеток, которые пролиферируют в недифференцированном состоянии, и могут дифференцироваться во все или некоторые клетки из остеобластов, хондробластов, липобластов и т.п. или в их клетки-предшественники. Мезенхимные стволовые клетки, используемые в настоящем изобретении, обладают потенциалом для дифференцировки в клетки почек, получающие эритропоэтин.

В качестве примеров млекопитающих, из которых извлекаются мезенхимные стволовые клетки, можно упомянуть лабораторных животных, таких как грызуны, например мыши, крысы, хомяки и морские свинки, а также кролики; домашних животных, таких как свиньи, коровы, козы, лошади, овцы и норки; животных-компаньонов, таких как собаки и кошки; приматов, таких как люди, обезьяны, макаки-резус, мартышки, орангутаны и шимпанзе и т.п. Предпочтительными млекопитающими являются крыса и человек.

Млекопитающее, из которого извлекаются мезенхимные стволовые клетки, предпочтительно принадлежит к тому же виду животных, что и реципиент, которому предполагается провести трансплантацию предшественника искусственной почки из настоящего изобретения. Наиболее предпочтительно, чтобы использовались собственные мезенхимные стволовые клетки реципиента.

Мезенхимные стволовые клетки могут быть получены из жидкости костного мозга, периферической крови, пуповинной крови и т.п. млекопитающего обычным общеизвестным способом. Например, человеческие мезенхимные стволовые клетки могут быть выделены через культивацию и пассирование кровообразующих стволовых клеток и им подобных, полученных путем аспирации костного мозга (Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171).

Мезенхимные стволовые клетки, выделенные из живого организма, также могут выращиваться in vitro с сохранением их потенциала дифференцирования посредством использования адгезионной культуры в соответствующей среде. Мезенхимные стволовые клетки, выращенные in vitro таким способом, также попадают в рамки настоящего изобретения. В качестве среды может использоваться, например, DMEM, EMEM, RPMI-1640, F-12, -MEM, питательная среда MSC (Bio Whittaker) и т.п. Температура культивирования обычно находится в диапазоне примерно от 30 до 40°C и предпочтительно составляет около 37°C. Концентрация CO₂ обычно находится в диапазоне от около 1 до 10% и предпочтительно составляет около 5%. Влажность обычно находится в диапазоне от около 70 до 100%, предпочтительно от около 95 до 100%. В целях поддержания высокого потенциала дифференцировки является предпочтительным, чтобы культивирование не продолжалось более чем от 2 до 5 пассажей или более.

Перенос мезенхимных стволовых клеток в метанефрос выполняется до замораживания или после размораживания метанефроса. Например, мезенхимные стволовые клетки инъецируются в метанефрос посредством микропипетки и т.д. под стереомикроскопом. Необходимое количество перенесенных клеток определяется на основании размера метанефроса и т.п.; обычно инъецируется от около 10⁴ до 10⁶ (например, 5×10⁴) мезенхимных стволовых клеток на один метанефрос крысы.

Несмотря на то что для переноса могут быть использованы мезенхимные стволовые клетки, растворенные в физиологической культуральной среде, мезенхимные стволовые клетки, заключенные в гель, содержащий внеклеточный матричный компонент (ламинин, коллаген типа IV, энтактин, гепарансульфатный протеогликан, Matrigel (зарегистрированный торговый знак) и т.п.), являются подходящими для использования с точки зрения предотвращения утечки внутриклеточной жидкости во время парацентеза после криоконсервации.

Размер предшественника искусственной почки по настоящему изобретению не обязательно должен быть близок к размеру почки, являющейся эритропоэтин-продуцирующим органом; достаточным является размер от 1/50 до 1/10 размера целой почки.

Предшественник искусственной почки из настоящего изобретения может получаться посредством выполнения следующего процесса:

(I) замораживания метанефроса млекопитающего, выделенного из живого организма;

(II) размораживания замороженного метанефроса млекопитающего; и

(III) переноса мезенхимных стволовых клеток млекопитающего в метанефрос вне живого организма до замораживания (I) или после размораживания (II).

Определения соответствующих терминов и подробности операций соответствуют описанным выше.

Несмотря на то что предшественник искусственной почки по настоящему изобретению, полученный посредством вышеописанного процесса, может подвергаться культуре органа, является предпочтительным, чтобы культура органа не выполнялась, поскольку отсутствует риск загрязнения, и сложный процесс очистки после культивирования не является необходимым. Преимущества предшественника искусственной почки из настоящего изобретения состоят в том, что он способен приобретать адекватные потенциалы для получения эритропоэтина и регуляции получения после трансплантации в млекопитающее, не подвергаясь такому процессу, как культура органа. Культура органа может выполняться путем помещения предшественника искусственной почки на фильтр, добавления соответствующей среды к планшету под ним и установки планшета в инкубатор.

При трансплантации предшественника искусственной почки из настоящего изобретения в живой организм млекопитающего-реципиента предшественник пересаживается в тело реципиента и мезенхимные стволовые клетки, содержащиеся в предшественнике, пролиферируют и дифференцируются в клетки почек, получающие эритропоэтин. В результате предшественник искусственной почки дифференцируется в искусственную почку, обладающую потенциалами для получения эритропоэтина и регуляции получения и которая теперь способна получать эритропоэтин в живом организме непрерывно в течение длительного периода времени с помощью извлечения необходимых питательных веществ из кровеносных сосудов. Следовательно, предшественник искусственной почки из настоящего изобретения является полезным для лечения связанных с эритропоэтином заболеваний. Связанные с эритропоэтином заболевания млекопитающих могут лечиться путем трансплантации предшественника искусственной почки из настоящего изобретения млекопитающему.

В настоящем изобретении «связанное с эритропоэтином заболевание» - это заболевание, ассоциированное с сокращением объема получаемого эритропоэтина, включая анемии, связанные с почечной недостаточностью, диабетами, язвами, раками, инфекциями, диализом, хирургией или химиотерапией. В частности, в случае анемии по причине почечной недостаточности эритропоэтин не может получаться из-за прогрессирующего разрушения почечной паренхимы и функции печени, в результате чего концентрация эритропоэтина в кровотоке не возрастает; это является основной проблемой.

В качестве примеров млекопитающих-реципиентов можно упомянуть лабораторных животных, таких как грызуны, например мыши, крысы, хомяки и морские свинки, а также кролики; домашних животных, таких как свиньи, коровы, козы, лошади, овцы и норки; животных-компаньонов, таких как собаки и кошки; приматов, таких как люди, обезьяны, макаки-резус, мартышки, орангутаны и шимпанзе и т.п. Предпочтительными млекопитающими являются крыса и человек.

Несмотря на то что способ трансплантации предшественника искусственной почки по настоящему изобретению в млекопитающее отдельно не ограничивается, поскольку предшественник может пересаживаться в тело реципиента и приобретать потенциалы для получения эритропоэтина и регуляции получения, предшественник искусственной почки предпочтительно трансплантируется в сальник млекопитающего-реципиента. Трансплантация в сальник может быть выполнена посредством обычной хирургической процедуры; например, может быть упомянут способ, включающий в себя взятие ткани, предназначенной для трансплантации, острыми щипцами, создание небольшого надреза на поверхности жировой ткани в сальнике с помощью наконечника щипцов и внедрение ткани в надрез. Предшественник искусственной почки из настоящего изобретения также может трансплантироваться в сальник посредством эндоскопа.

Доза предшественника искусственной почки по настоящему изобретению варьируется в зависимости от объекта введения, целевого заболевания, симптомов и т.п.; обычно предшественник искусственной почки, приготовленный из свиного метанефроса, трансплантируется взрослому пациенту-человеку, больному почечной анемией (предполагаемая масса тела 60 кг), при этом удобно трансплантировать около 10 метанефросов за одну хирургическую операцию и увеличивать количество метанефросов шаг за шагом, в случае необходимости отслеживая тяжесть анемии у пациента. В случае других животных может быть трансплантировано количество, рассчитанное на 60 кг массы тела.

Настоящее изобретение ниже описывается конкретнее посредством приведенного примера, которым, однако, изобретение никоим образом не ограничивается.

Пример

Метанефросы были выделены из эмбрионов крысы на 14 дне беременности и были подвергнуты криоконсервации в ET-Kyoto+10% DMSO+20% FCS. Диаметры составляли около 2 мм.

После криоконсервации в течение 2 дней замороженные метанефросы были разморожены. Мезенхимные стволовые клетки крысы были заключены в Matrigel и инъецированы в метанефросы в количестве 1×10 ⁴ клеток на метанефрос. После этого метанефросы были трансплантированы в сальник изогенных крыс.

Через семь дней после трансплантации выросшие метанефросы были выделены из крыс, подвергавшихся трансплантации метанефроса. Количество животных, получивших трансплантаты метанефроса, составило 2, в каждой из которых выросло соответственно три и шесть из семи метанефросов. Метанефросы выросли до диаметра от 6 до 8 мм. Получение эритропоэтина в выросших предшественниках искусственной почки было подтверждено таким же методом, который был описан в Transplantation VOL85, № 11, June 15 2008, то есть иммунным окрашиванием и генетическим анализом клеток, получающих эритропоэтин.

Промышленная применимость

С использованием способа настоящего изобретения биологическая безопасность предшественника искусственной почки может быть легко протестирована до трансплантации. С использованием способа настоящего изобретения можно получить предшественник искусственной почки посредством простых операций. При использовании способа настоящего изобретения разрабатываемый график лечения может быть гибким, поскольку предшественник искусственной почки может получаться с необходимыми временными интервалами посредством использования хранящегося в замороженном виде метанефроса. Кроме того, поскольку способ настоящего изобретения в основном устраняет потребность в операции культивирования, то он не включает в себя риск загрязнения и не требует сложного процесса очистки после культивирования.

Данная заявка основывается на заявке на патент № 2008-173935, поданной в Японии (дата подачи: 2 июля 2008 г.), содержание которое включено в настоящий документ посредством данной ссылки.