способы трансформации дрожжей

Формула изобретения

1. Способ получения дрожжевой библиотеки, где способ включает стадии:

инкубация клеток дрожжей в растворе, содержащем от 0,01 до 1,0 М ацетата лития (LiAc) и от 1 до 100 мМ дитиотреитола (DTT);

получения суспензии, содержащей линеаризованный ДНК вектор и ДНК вставку в соотношении от 1:0,5 до 1:10, сорбит и CaCl₂ или MgCl₂, причем вставка ДНК содержит достаточную 5' и 3' векторную последовательность для эффективного проведения гомологичной рекомбинации, и где используют 4 мкг ДНК вектора на 400 мкл 1,6×10⁹ клеток дрожжей/мл, и

электропорация раствора дрожжевых клеток суспензией, содержащей линеаризованный ДНК вектор и ДНК вставку, при напряжении от 0,5 кВ/см до 12,5 кВ/см с емкостью от 10 до 50 мкФ.

2. Способ по п.1, где суспензия содержит 1 М сорбита и 1 мМ CaCl_2.

3. Способ по п.1, где суспензия содержит 1 М сорбита и 1 мМ MgCl_2.

4. Способ по п.1, где клетки дрожжей инкубируют в растворе, содержащем холодный 0,1 M LiAc и 10 мМ DTT.

5. Способ по п.1, где суспензию подвергают электропорации при 2,5 кВ/см с емкостью 25 мкФ.

6. Способ по п.1, где стадию электропорации проводят в кювете с просветом 0,2 см.

7. Способ по п.1, где суспензия содержит 400 мкл 1,6×10⁹ клеток дрожжей/мл.

8. Способ по п.1, где соотношение ДНК вектора к ДНК вставки составляет 1:3.

9. Способ получения дрожжевой библиотеки, где способ включает стадии:

культивирования клеток дрожжей до OD₆₀₀ от 1,0 до 2;

промывки клеток дрожжей в воде;

промывки клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl₂;

инкубации клеток дрожжей во втором растворе, содержащем от 0,01 до 1,0 М ацетата лития (LiAc) и от 1 до 100 мМ дитиотреитола (DTT);

промывки клеток дрожжей в третьем растворе, содержащем сорбит и CaCl ₂;

ресуспендирования клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl₂ или MgCl₂ для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации;

добавления суспензии клеток дрожжей для электропорации к суспензии, содержащей линеаризованный ДНК вектор и ДНК вставку в соотношении от 1:0,5 до 1:10, сорбит и CaCl₂ или MgCl₂, причем вставка ДНК содержит достаточную 5' и 3' векторную последовательность для эффективного проведения гомологичной рекомбинации, и где используют 4 мкг ДНК вектора на 400 мкл 1,6×10⁹ клеток дрожжей/мл, для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации, и

электропорация суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации суспензией, содержащей линеаризованный ДНК вектор и ДНК вставку, при напряжении от 2,5 кВ/см до 12,5 кВ/см в кювете с просветом 0,2 см.

10. Способ по п.9, где четвертый раствор содержит 1 М сорбита и 1 мМ CaCl_2.

11. Способ по п.9, где четвертый раствор содержит 1 М сорбита и 1 мМ MgCl_2.

12. Способ по п.9, где второй раствор содержит холодный 0,1 M LiAc и 10 мМ DTT.

13. Способ по п.9, где суспензию клеток дрожжей - ДНК для электропорации, подвергают электропорации при 2,5 кВ/см с емкостью 25 мкФ.

14. Способ по п.9, где суспензия содержит 400 мкл 1,6×10⁹ клеток дрожжей/мл.

15. Способ по п.9, где соотношение ДНК вектора к ДНК вставки составляет 1:3.

Описание изобретения к патенту

Родственная заявка

По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущества предварительной заявки США номер 61/067910, поданной 3 марта 2008 г.

Область изобретения

Изобретение относится к области трансформации дрожжей, к клеткам дрожжей, библиотекам клеток дрожжей, трансформированных таким образом, и к продукции в них рекомбинантных продуктов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к трансформации дрожжей электропорацией.

Предпосылки изобретения

Терапевтические антитела, полученные с использованием иммунизаций животных in vivo или посредством способа дисплея рекомбинантных антител in vitro, являлись успешными в клинической практике, и в таком качестве подтвердили, что эти способы являются эффективными способами поиска новых лекарственных средств. В то время как, как правило, ожидают, что моноклональные антитела, полученные при иммунизациях животных, обладают достаточно высокой аффинностью для достижения терапевтической эффективности, то для разработки терапевтических антител при иммунизациях животных необходима либо гуманизация не относящихся к человеку антител, либо доступ к трансгенным животным, экспрессирующим человеческие антитела. Непосредственный отбор полностью человеческих антител из предварительно полученных библиотек антител посредством способов дисплея in vitro (фагового, бактериального, дрожжевого дисплеев, дисплея клеток млекопитающих и рибосомного дисплея) (Chao, G. et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-68; Gai, S. A. and Wittrup, K. D. (2007) Curr. Opin. Struct. Biol. 17:467-73; Griffiths, A. D. et al. (1994) EMBO J. 13:3245-60; He, M. and Khan, F. (2005) Expert Rev. Proteomics 2:421-30; Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Hoogenboom, H. R. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1105-16) предлагает ценный параллельный способ и может представлять наилучшую альтернативу в случаях, когда антиген-мишень не может вызывать продуктивный иммунный ответ in vivo.

Сконструированы библиотеки человеческих антител для экспонирования полноразмерного антитела или различных фрагментов антитела, таких как Fab, scFv и dAb. Библиотеки, как правило, конструируют либо отражением и переносом разнообразия антител из репертуара B-клеток в библиотеку с дополнительным введением синтетического разнообразия или без него (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8), либо посредством синтетического случайного распределения остатков CDR в ограниченных каркасных областях человеческих антител (Rothe, C. et al. (2008) J. Mol. Biol. 376:1182-200). Поскольку тяжелые и легкие цепи антитела амплифицируют по отдельности и переформатируют в формат библиотеки дисплея, новые объединения между VH и VL формируются в ходе этого процесса. В то время как эта перетасовка VH-VL позволяет создать новые антигенсвязывающие участки, она также очень значительно увеличивает теоретическое разнообразие библиотеки. Разработано несколько стратегий для конструирования лучших и более продуктивных библиотек антител посредством уменьшения теоретического разнообразия библиотеки и действительного размера библиотеки, необходимого для эффективного отбора образцов из библиотеки. Эти способы включают в себя интеллектуальное конструирование синтетических или полусинтетических библиотек (Rothe, C. et al. (2008) J Mol Biol. 376:1182-200) и иммунных (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8) или псевдоиммунных (Lee, H. W. et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 346:896-903) библиотек, полученных из менее разнообразных, но потенциально более реакционно-способных репертуаров B-клеток. Хотя эти способы могут являться эффективными для значительного уменьшения теоретического разнообразия библиотеки на несколько или даже много порядков, необходимость в больших размерах библиотек и способах их получения всегда будет дополнять конструирование библиотек для увеличения шансов идентификации найденных антител независимо от их редкости.

Доступность средств для получения библиотек нуклеиновых кислот и продуцируемых в них рекомбинантных продуктов, таких как фармацевтические белки, в эукариотических системах, таких как дрожжи, обеспечивает значительные преимущества по отношению к применению прокариотических систем, таких как E. coli . Дрожжи, как правило, можно выращивать до более высокой плотности клеток, чем бактерии, и их можно легко адаптировать для переработки с непрерывной ферментацией. Однако развитие видов дрожжей в качестве систем хозяин/вектор для получения рекомбинантных продуктов и библиотек серьезно затруднено отсутствием знаний об условиях трансформации и подходящих средствах для стабильного введения чужеродных нуклеиновых кислот в дрожжевые клетки-хозяева.

Среди различных электрических и биологических параметров, облегчающих электротрансформацию клеток, присутствует адсорбция ДНК на поверхности клеток. Переменные электрические поля низкой интенсивности также стимулируют перенос ДНК в бактерии E. coli, предположительно, посредством электрической стимуляции пермеаз ДНК. Накоплены свидетельства преобладающего электродиффузионного или электрофоретического эффекта на перенос генов посредством электропорации для полиэлектролитной ДНК. Опубликованы также облегчение электроосмотических эффектов и выпячивания мембраны посредством электропорации.

Приложение электрического поля через мембрану дрожжевой клетки приводит к образованию временных пор, являющемуся критическим для процесса электропорации. Генератор сигнала для электропорации обеспечивает напряжение (в кВ), проходящее через промежуток (в см) между электродами. Эта разность потенциалов определяет то, что называют силой электрического поля, где E эквивалентно кВ/см. Каждая клетка обладает собственной критической силой поля для оптимальной электропорации. Это обусловлено размером клетки, строением мембраны и индивидуальными характеристиками самой клеточной стенки. Например, для клеток млекопитающих, как правило, необходимо между 0,5 и 5,0 кВ/см до смерти клетки и/или прохождения электропорации. Как правило, необходимая сила поля меняется в обратной зависимости от размера клетки.

Способы трансформации

1. Трансформация посредством электропорации

Becker et al. (Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991)) описывают способы трансформации дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ). Becker описывает также трансформацию сферопластов.

Faber et al. (Curr. Genet. 25: 305-310 (1994)) описывают способы трансформации метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha . Faber также применял способ к Pichia methanolica.

Helmuth et al. (Analytical Biochem. 293:149-152 (2001)) описывают увеличение эффективности трансформации дрожжей комбинацией предварительных обработок как LiAc, так и DTT.

Kasutske et al. (Yeast 8: 691-697 (1992)) описывают электроимпульсную трансформацию интактных клеток Candida maltosa различными гомологичными векторными плазмидами.

Meilhoc et al. (Bio/Technology 8: 223-227 (1990)) описывают систему трансформации с использованием интактных клеток дрожжей S. cerevisiae и импульсов электрического поля.

Neumann et al. (1996) Biophys. J. (1996) 71:868-877 описывают кинетику трансформации клеток дрожжей посредством электропорации и опосредованной кальцием адсорбции ДНК.

Piredda et al. (Yeast 10: 1601-1612 (1994)) описывает систему трансформации для дрожжей Yamadazyma (Pichia) ohmeri.

Scorer et al. (Bio/Technology 12: 181-184 (1994)) описывают векторы P. pastoris, позволяющие быструю селекцию с G418 редких трансформантов с большим числом копий для экспрессии в Pichia pastoris с использованием систем как электропорации, так и трансформации сферопластов.

Sherman et al. (Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, pages 91 102, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)) описывают трансформацию мутантов дрожжей LEU2 и HIS3.

Suga и Hatakeyama (Curr. Genet. 43:206-211 (2003)) описывают способ замораживания для получения компетентных клеток до электропорации с помощью добавления кальция.

Thompson et al. (Yeast 14:565-571 (1998)) описывают подготовку клеток дрожжей, таких как S. cerevisiae и Candida albicans , для трансформации посредством электропорации.

Yang et al. (Applied and Environmental Microbiology 60(12): 4245-4254 (1994)) описывают электропорацию Pichia stipitis, основанную на их гене URA3 и гомологичной автономно реплицирующейся последовательности ARS2.

В патенте США No. 5716808 от Raymond описаны способы получения клеток Pichia methanolica, содержащих чужеродные конструкции ДНК, с использованием электропорации и способы продукции чужеродных пептидов в клетках Pichia methanolica .

В патенте США No. 7009045 от Abbas описана трансформация флавиногенных дрожжей, Pichia guilliermondii и Candida famata, посредством электропорации и посредством трансформации сферопластов.

2. Трансформация посредством образования сферопластов

Becker et al. (Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991)) описывают способы трансформации дрожжей S. cerevisiae, так же как трансформации сферопластов.

Scorer et al. (Bio/Technology 12: 181-184 (1994)) описывают векторы P. pastoris, позволяющие быструю селекцию с G418 редких трансформантов с большим числом копий для экспрессии в Pichia pastoris с использованием систем как электропорации, так и трансформации сферопластов.

В патенте США No. 4808537 от Stroman et al. описан способ выделения и клонирования индуцируемого метанолом гена из Pichia pastoris и регуляторные области, применимые для регуляции посредством метанола экспрессии гетерологичных генов с использованием трансформации сферопластов.

В патенте США No. 4837148 от Cregg et al. описаны последовательности для автономной репликации, способные поддерживать плазмиды в форме внехромосомных элементов в штаммах-хозяевах Pichia. Кроме того, в патенте описаны конструкции, включая последовательности ДНК, так же как трансформированные организмы, полученные посредством образования сферопластов, и предоставлены способы получения последовательностей ДНК и конструкций по изобретению, так же как способы выделения последовательностей из любого источника.

В патенте США No. 4855231 от Stroman et al. описаны последовательности ДНК, ответственные за присутствие метанола, не репрессируемые катаболитами источники углерода и голодание по источникам углерода. В патенте '231 показана трансформация сферопластов Pichia pastoris.

В патенте США No. 4879231 от Stroman et al. описан способ трансформации сферопластов дрожжей, таких как Pichia pastoris.

В патенте США No. 4882279 от Cregg et al. описан способ трансформации сферопластов для дрожжей рода Pichia, например, Pichia pastoris.

Патент США No. 5135868 от Cregg относится к способу сайтспецифической геномной модификации дрожжей рода Pichia. В патенте '868 используют способ трансформации сферопластов.

Патент США No. 5268273 от Buckholz относится к способу трансформации сферопластов Pichia pastoris .

Патент США No. 5736383 от Raymond относится к способу трансформации штаммов дрожжей рода Pichia, в частности, Pichia methanolica. Кроме того, патент '383 относится к способу трансформации сферопластов дрожжей рода Pichia, так же как к способу трансформации посредством электропорации.

3. Другие системы трансформации

Kunze et al. (Current Genetics 9(3): 205-209 (1985)) описывают способ трансформации S. cerevisiae, Candida maltosa и Pichia guilliermondii G266 плазмидой pYe(ARG4)411, содержащей ген ARG4 S. cerevisiae, вставленный в pBR322. Kunze использовал CaCl₂ в способе трансформации.

Kunze et al. (J. Basic Microbiol. 25(2): 141-144 (1985)) описывают способ трансформации промышленно важных дрожжей Candida maltosa и Pichia guilliermondii G266 с использованием CaCl₂.

Kunze et al. (Acta Biotechnol. 6(1): 28 (1986)) описывают трансформацию промышленно важных дрожжей Candida maltosa и Pichia guilliermondii .

Neistat et al. (Mol. Ge. Mikrobiol. Virusol. 12: 19-23 (1986))(Только аннотация) описывают трансформацию дрожжей Hansenula polymorpha, Pichia guilliermondii, Williopsis saturnus плазмидой, несущей ген ADE2 S. cerevisiae . Способ трансформации не описан.

В патенте США No. 4929555 от Cregg et al. описан способ получения цельных клеток метилотрофных видов рода Pichia, компетентных по трансформации посредством ДНК и способ трансформации с помощью ДНК цельных клеток таких видов, в частности, Pichia pastoris.

В патенте США No. 5231007 от Heefner et al. описан способ получения и выделения высоко флавиногенных штаммов Candida famata, продуцирующих выходы рибофлавина приблизительно 7,0-7,5 грамм на литр за 6 суток. Способ включает в себя сочетание повторяющихся стадий мутагенеза и слияния протопластов, проводимых для исходного штамма и происходящих из него штаммов, которые отбирают после каждой стадии согласно протоколу скрининга.

4. Векторы, элементы ARS и библиотеки генов

Clyne, R. K. et al. (EMBO J. 14(24): 6348-6357 (1995)) относится к тонкому структурному анализу ARS1, элемента ARS делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. Характеризация серий мутаций с гнездовыми делециями показала, что минимальный фрагмент ДНК, содержащий ARS1, является большим, поскольку ни один фрагмент ниже 650 п.о. не сохранял значительную активность ARS.

Liauta-Teglivets, O. et al. (Yeast 11(10): 945-952 (1995)) описывают клонирование структурного гена GTP-циклогидролазы, вовлеченного в биосинтез рибофлавина, из геномной библиотеки Pichia guilliermondii .

Cannon, R. D. et al. (Mol. Gen. Genet. 221(2): 210-218 (1990)) описывают выделение и нуклеотидную последовательность элемента автономно реплицирующейся последовательности (ARS), функционального в Candida albicans и S. cerevisiae .

Takagi, M. et al. (J. Bacteriol. 167(2): 551-555 (1986)) описывают конструирование системы вектор-хозяин в Candida maltosa с использованием участка ARS, выделенного из их генома.

Pla, J. et al. (Gene 165(1): 115-120(1995)) относится к фрагментам ДНК ARS2 и ARS3 Candida albicans с активностью автономной репликации, способствующие, как показано, неинтегративной генетической трансформации как Candida albicans , так и S. cerevisiae.

В патенте США No. 5212087 от Fournier et al. описаны последовательности ARS, являющиеся эффективными в Yarrowia lipolytica, так же как плазмиды, несущие эти последовательности.

В патенте США No. 5665600 от Hagenson et al. описаны линейные плазмиды Pichia pastoris и их ДНК фрагменты, содержащие последовательности ARS. В патенте '600 использовали систему трансформации сферопластов, как описано у Cregg et al в патенте США No. 4929555.

В патенте США No. 4837148 от Cregg et al. описаны автономно реплицирующиеся последовательности, способные поддерживать плазмиды в форме внехромосомных элементов в штаммах-хозяевах Pichia. Кроме того, патент '148 относится к конструкциям, содержащим последовательности ДНК, так же как к трансформированными ими организмами. Кроме того, патент относится к способам получения последовательностей ДНК и конструкций по изобретению, так же, как к способам выделения последовательностей из любого источника.

Chao et al. (Nature Protocols, 1(2):755-768 (2006)) описывает способ трансформации клеток дрожжей посредством электропорации и достижение максимального размера библиотеки 5 × 10⁷ с помощью 5 мкг ДНК вставки и 1 мкг ДНК вектора.

Вышеуказанные способы и описания, в то время как позволяют достигать все более высокой эффективности трансформации, все еще являются трудоемкими и занимают значительное время и повторяющиеся усилия для накопления множества малых библиотек в диапазоне размеров 10⁶ -10⁷ до более крупной и комбинированной библиотеки размером в диапазоне размеров 10⁸-10⁹.

Для дрожжевых библиотек не достигают размера или эффективности, достигнутых для фаговых библиотек. По обзору Hoogenboom в 2005 (Nature Biotech., 23(9):1105-1116), типичный максимальный размер фаговой библиотеки составляет 10¹⁰-10¹¹ , в то время как размер типичной дрожжевой библиотеки составляет 10⁷ (значительно менее, чем размер, достигаемый с технологиями другого дисплея (Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Hoogenboom, H. R. (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1105-16), хотя ранее опубликованные размеры библиотек в области 10⁹ (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8; Lipovsek, D. et al. (2007) J. Mol. Biol. 368:1024-41; Segal, L. et al. (2007) Bioinformatics 23:i440-9. Feldhaus et al. (Nature Biotech., 21: 163-170 (2003)) показали, что библиотеку 1,5 × 10⁹ можно сконструировать посредством тщательного повторения трансформации и объединения затем трансформированных библиотек. Хотя недавний прогресс в способах электропорации (смотри Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006)) сделал возможным достигать максимального размера дрожжевой библиотеки 5 × 10⁷ при однократной трансформации, авторы настоящего изобретения обнаружили, что по способу Chao дрожжи, как правило, трансформируют со значительно более низкой эффективностью трансформации. До сих пор является корректным утверждение, что эти размеры дрожжевых библиотек, достигаемые к настоящему времени, все еще значительно ниже тех, которые можно достичь общепринятым образом посредством библиотек фагового дисплея размером 10¹⁰-10¹¹ .

Отбор библиотеки дрожжевого дисплея, с использованием как магнитных бусин, так и активированной флуоресценцией сортировки клеток, предоставляет эффективный и чувствительный способ обогащения членами, специфически связывающими антигены-мишени, в частности, благодаря их совместимости с активированной флуоресценцией сортировкой клеток (FACS). Преимуществу этой мощности отбора, однако, препятствует ограниченный размер типичных библиотек дрожжевого дисплея из-за низкой эффективности трансформации клеток дрожжей. Если бы способ отбора дрожжевого дисплея можно было бы объединить с более крупными библиотеками антител, сходных с библиотеками, полученными для фагового дисплея (размером приблизительно 10¹⁰), способ дрожжевого дисплея предоставлял бы чрезвычайно эффективный инструмент для обнаружения антител.

Таким образом, существует необходимость в эффективных способах получения библиотек белков, например, библиотек антител, с использованием дрожжей.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к высокоэффективным и быстрым способам трансформации клеток дрожжей, например, для получения библиотек клеток дрожжей размером вплоть до 2 × 10¹⁰. Способы по изобретению делают возможными достигать выходов в масштабе фаговых библиотек. Способы по изобретению удаляют значительное узкое место при применении способа дрожжевого дисплея в качестве практического инструмента для достижения намного большего объема разнообразия, ранее неисследованного, и размер библиотеки в настоящее время ограничен только размером культуры дрожжей, которую можно выращивать в лабораториях.

Множество компонентов и условий, включая использование CaCl₂, MgCl₂ , сахарозы, сорбита, ацетата лития, дитиотреитола, напряжение электропорации, нагрузку ДНК и объем клеток, тестировали или титровали для идентификации наилучшей комбинации. Посредством применения этого недавно разработанного способа библиотеку антител 2×10¹⁰ сконструировали из РНК селезенки человека по существу за одни сутки с типичной эффективностью трансформации 1-1,5×10⁸ трансформантов на микрограмм ДНК вектора. Анализ последовательности подтвердил разнообразное представление зародышевых последовательностей антител в этой библиотеке антител неимунной селезенки человека. Посредством проведения пилотных отборов из библиотеки авторы настоящего изобретения идентифицировали антитела человека против TNF- и IL-18 с низкими наномолярными аффинностями, показав продуктивность этой библиотеки.

В одном аспекте изобретение относится к способам получения дрожжевой библиотеки посредством электропорации клеток дрожжей, где способ включает в себя стадии (a) получения суспензии, содержащей векторы из нуклеиновой кислоты, клетки дрожжей, сорбит и CaCl₂ ; и (b) электропорации суспензии при от 0,5 кВ/см до более 12,5 кВ/см с емкостью от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкФ. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК для получения библиотеки, где способ включает в себя стадии (a) культивирования клеток дрожжей до OD₆₀₀ от приблизительно 1,0 до приблизительно 2; (b) промывки клеток дрожжей в одном объеме холодной воды; (c) промывки клеток дрожжей в одном объеме холодного 1 M сорбита/1 мМ CaCl₂; (d) инкубации клеток дрожжей в одном объеме 30°C 0,1 M LiAc/10мМ DTT; (e) промывки клеток дрожжей во втором объеме холодного 1 M сорбита /1 мМ CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в третьем объеме холодного 1M сорбита/1 мМ CaCl₂ для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (g) добавления одного объема суспензии клеток для электропорации к ДНК вектора и ДНК вставки для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; и (h) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации при напряжении между приблизительно 2,5 кВ/см и приблизительно 12,5 кВ/см в кювете с просветом 0,2 см.

Соотношение ДНК вектора к ДНК вставки лежит в диапазоне от приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:10, например, 1:0,5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, или 1:10. В одном из вариантов осуществления, приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 1 мкг ДНК вставки используют для реакции. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 2 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 3 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 4 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления, приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 5 мкг ДНК вставки преципитируют.

В одном из вариантов осуществления суспензия клеток содержит от приблизительно 50 до приблизительно 400 мкл клеток дрожжей, например, приблизительно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 мкл клеток дрожжей.

В одном из вариантов осуществления суспензия клеток дрожжей содержит от приблизительно 1 до приблизительно 10 × 10⁹ клеток дрожжей/мл, например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10×10⁹ клеток дрожжей/мл.

В одном из вариантов осуществления сила поля, используемая для электропорации клеток дрожжей, составляла от приблизительно 0,5 кВ/см до приблизительно 12,5 кВ/см, например, приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5, приблизительно 11,0, приблизительно 11,5, приблизительно 12,0, приблизительно 12,5, приблизительно 13,0, приблизительно 13,5, приблизительно 14,0, приблизительно 14,5, или приблизительно 15,0 кВ/см.

В одном из вариантов осуществления проводят электропорацию клеток дрожжей при емкости от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкФ, например, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45 или приблизительно 50.

В одном из вариантов осуществления клетки дрожжей суспендируют в от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 М сорбите и в от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мМ CaCl₂ или MgCl_2, например, приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, или приблизительно 10,0 M сорбит, или, например, приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0 или приблизительно 10,0 мМ CaCl₂ или MgCl₂.

В одном из вариантов осуществления клетки дрожжей инкубируют в от приблизительно 0,01 до приблизительно 1,0 M LiAc, например, приблизительно 0,01, приблизительно 0,02, приблизительно 0,03, приблизительно 0,04, приблизительно 0,05, приблизительно 0,06, приблизительно 0,07, приблизительно 0,08, приблизительно 0,09, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 или приблизительно 1,0 M LiAc, и/или в от приблизительно 1 до приблизительно 100 мМ DTT, например, приблизительно 1, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90 или приблизительно 100 мМ DTT.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК для получения библиотеки, где способ включает в себя одну или несколько из стадий (a) культивирования клеток дрожжей в течение ночи до OD₆₀₀ от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0; (b) промывки клеток дрожжей в воде; (c) промывки клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl ₂; (d) инкубации клеток дрожжей в растворе, содержащем LiAc и DTT; (e) промывки клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в одном объеме раствора, содержащего сорбит и CaCl₂ , для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (g) добавления одного объема суспензии клеток для электропорации к ДНК вектора и ДНК вставки для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; и (h) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации при напряжении между приблизительно 2,5 кВ/см и приблизительно 12,5 кВ/см в кювете с просветом 0,2 см.

В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК, где способ включает в себя две или более стадии из: (a) минимизации объема ДНК вектора и вставки в соотношении приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:10 посредством преципитации ДНК в осадок с последующим ресуспендированием в минимальном объеме; (b) культивирования клеток дрожжей от колонии до соответствующего состояния роста посредством (i) инокуляции первого объема среды колонией дрожжей из чашки для выращивания или частью растущей культуры дрожжей; (ii) выращивания клеток дрожжей в течение ночи при 30°C; (iii) инокуляции второго объема среды клетками со стадии (ii) и выращивания клеток при 30°C, пока они не достигнут OD₆₀₀ от приблизительно 1,3 до приблизительно 1,6; (c) осаждения клеток дрожжей центрифугированием; (d) промывки клеток дрожжей холодной водой; (e) промывки клеток дрожжей холодным 1М сорбитом/1 мМ CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в 0,1 М LiAc/10 мМ DTT; (g) инкубации клеток дрожжей при 30°C при 250 об/мин в течение 30 минут; (h) промывки клеток дрожжей с помощью 1 М сорбита/1 мМ CaCl₂; (i) ресуспендирования клеток дрожжей в 1 М сорбите/1 мМ CaCl ₂ для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (j) добавления части суспензии клеток дрожжей для электропорации к осадку ДНК для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; (k) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации в диапазоне от приблизительно 0,5 кВ до приблизительно 2,5кВ и при емкости 25 мкФ; (1) добавления смеси 1:1 1 М сорбита/YPD (конечная концентрация: 0,5 М сорбит, 0,5 × YPD) к подвергнутой электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации и инкубации при 30°C в течение 1 часа; и (m) осаждения клеток дрожжей и ресуспендирования в 10 мл 1 М сорбита.

Краткое описание фигур

Вышеупомянутые и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения, так же как собственно изобретение, можно более полно понять из следующего ниже описания предпочтительных вариантов осуществления при чтении вместе с сопровождающими фигурами:

На фигуре 1 показано графическое представление данных в таблице 1, которая представляет счет колоний как функцию от вектора: вставки и напряжения от 2,5кВ/см до 12,5кВ/см.

На фигуре 2 показано графическое представление данных в таблице 3, которая представляет счет колоний как функцию от вектора: вставки и напряжения от 2,5 кВ/см до 12,5кВ/см.

Фигура 3 показывает, что эффективность электропорации значительно улучшается посредством увеличения объема на кювету.

Фигура 4 показывает, что увеличенная нагрузка ДНК и высокое напряжение, но не соотношение вектора и вставки, являются критическими для максимальной эффективности трансформации.

Подробное описание изобретения

Способ высокоэффективной электропорации для Saccharomyces cerevisiae разработан посредством тестирования и комбинации нескольких ранее идентифицированных условий (Chao, G. et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-68; Becker, D. M. and Guarente, L. (1991) Methods Enzymol. 194:182-7; Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293:149-52; Neumann, E. et al. (1996) Biophys. J. 71:868-77; Simon, J. R. (1993) Methods Enzymol. 217:478-83; Suga, M. and Hatakeyama, T. (2003) Curr. Genet. 43:206-11; Thompson, J. R. et al. (1998) Yeast 14:565-71. Они включают в себя комбинацию ацетата лития (LiAc) и дитиотреитола (DTT) в качестве модифицирующих клетки средств, оба из которых использовали для увеличения частоты трансформации дрожжей (Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293: 149-52; Thompson, J. R. et al. (1998) Yeast 14:565-71; Gietz, R. D. et al. (1995) Yeast 11:355-60), и включения сорбита и хлорида кальция (Becker, D. M. and Guarente, L. (1991) Methods Enzymol. 194:182-7; Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293:149-52; Neumann, E. et al. (1996) Biophys. J. 71:868-77) в буфер для электропорации.

Определения:

Термин «экспрессирующий вектор» обозначает конструкцию ДНК, которая содержит участок автономной репликации (ARS), участок инициации транскрипции и по меньшей мере один структурный ген, кодирующий белок, подлежащий экспрессии в организме-хозяине. Участок репликации, или ориджин репликации, представляет собой любую последовательность ДНК, контролирующую репликацию клонирующих и экспрессирующих векторов. Экспрессирующий вектор обычно содержит также подходящие контрольные области, такие как один или несколько энхансеров и/или промоторов, супрессоров и/или сайленсеров и терминаторов, контролирующих экспрессию белка в дрожжах-хозяевах. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению могут содержать также селективный маркер, содержащий жизненно необходимый ген, как описано в настоящем документе. Экспрессирующий вектор также, необязательно, содержит другие селективные маркеры, широкодоступные и хорошо известные специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы представляют собой один тип вектора. Векторы могут, необязательно, содержать одну или несколько последовательностей (элементов) ARS из одного или нескольких штаммов дрожжей.

Термин «функционально связанный» означает, что фрагменты ДНК расположены так, что они функционируют во взаимодействии для их намеченных предназначений, например, транскрипция инициируется на промоторе и продолжается через кодирующий отрезок до терминатора.

Термин «трансформация» означает введение ДНК или других нуклеиновых кислот в клетку-хозяина дрожжей-реципиента, что изменяет генотип.

Термин «трансформант», или «трансформированная клетка» означает клетку-хозяина дрожжей-реципиента, который подвергли трансформации, и его потомство.

Векторы, применимые в способах электропорации по изобретению, включают в себя вектор pYD, любые другие векторы и их производные конструкции, которые можно размножать в клетках дрожжей, или нуклеиновые кислоты в общем. Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может быть основан на любом типе вектора, пока вектор может трансформировать, трансфицировать или трансдуцировать дрожжевую клетку-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор основан на дрожжевой плазмиде, особенно плазмиде из S. cerevisiae. После трансформации клеток дрожжей экзогенная ДНК, кодирующая последовательности библиотеки, поглощается клетками и затем экспрессируется в трансформированных клетках.

Более предпочтительно, экспрессирующий вектор может представлять собой челночный вектор для дрожжей-бактерий, который можно размножать либо в E. coli, либо в дрожжах (Struhl, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:1035-1039). Включение последовательностей ДНК плазмиды E. coli, такой как pBR322, облегчает количественное получение ДНК вектора в . coli, и таким образом, эффективную трансформацию дрожжей.

Типы дрожжевых плазмидных векторов, которые могут служить челночными, могут представлять собой реплицирующийся вектор или интегрирующий вектор. Реплицирующийся вектор представляет собой дрожжевой вектор, способный опосредовать свое собственное поддержание, независимо от хромосомной ДНК дрожжей, благодаря присутствию функционального ориджина репликации ДНК. Интегрирующий вектор зависит при рекомбинации от хромосомной ДНК для облегчения репликации и таким образом продолжительного поддержания рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине. Реплицирующий вектор может представлять собой основанный на плазмиде 2 микронный вектор, в котором ориджин репликации ДНК происходит из эндогенной 2-микронной плазмиды дрожжей. Альтернативно, реплицирующийся вектор может представлять собой автономно реплицирующийся (ARS) вектор, в котором «кажущийся» ориджин репликации происходит из хромосомной ДНК дрожжей. Необязательно, реплицирующийся вектор может представлять собой центромерную (C N) плазмиду, несущую, в дополнение к одному из вышеуказанных ориджинов репликации ДНК, последовательность хромосомной ДНК дрожжей, несущую, как известно, центромеру.

Клетки дрожжей можно трансформировать векторами в замкнутой кольцевой форме или в линейной форме. Трансформация дрожжей интегрирующими векторами, хотя и с наследственной стабильностью, может не быть эффективной, когда вектор присутствует в замкнутой кольцевой форме (например, с выходом только приблизительно 1-10 трансформантов на мкг ДНК). Линеаризованные векторы, со свободными концами, локализованными в последовательностях ДНК, гомологичных хромосомной ДНК дрожжей, трансформируют дрожжи с более высокой эффективностью (в 100-1000 раз), и обнаружено, что трансформирующая ДНК, как правило, интегрирует в последовательности, гомологичные участку расщепления. Таким образом, посредством расщепления ДНК вектора подходящей рестрикционной эндонуклеазой, можно увеличить эффективность трансформации и нацелиться на участок интеграции в хромосому. Интегративная трансформация может являться применимой для генетической модификации пивных дрожжей, при условии, что эффективность трансформации является достаточно высокой и последовательность ДНК - мишень для интеграции - лежит внутри области, которая не нарушает генов, необходимых для метаболизма клетки-хозяина.

Плазмиды с ARS, обладающие высоким числом копий (приблизительно 20-50 копий на клетку), обладают тенденцией являться наиболее нестабильными, и теряются с частотой более 10% на поколение. Однако стабильность плазмиды с ARS можно увеличить присоединением центромеры; центромерные плазмиды присутствуют в 1 или 2 копиях на клетку и теряются только приблизительно в 1% на поколение. Неограничивающие примеры белков для экспрессии в дрожжевых клетках-хозяевах с использованием способов электропорации по изобретению включают в себя любые интересующие гены, включая антитела и фрагменты антител, гормоны, цитокины и лимфокины, рецепторы, молекулы адгезии и ферменты.

Штаммы дрожжей, которые можно трансформировать способом электропорации по изобретению, включают в себя виды дрожжей рода Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae и рода Schizosaccharomyces, такие как Schizosaccharomyces Pombe. В одном варианте осуществления клетки дрожжей представляют собой диплоидные клетки дрожжей. Альтернативно, клетки дрожжей представляют собой гаплоидные клетки, такие как «a» и « » штамм гаплоидных клеток дрожжей.

Изобретение относится к способам трансформации клеток дрожжей, включающим в себя электропорацию суспензии клеток, содержащей дрожжи вместе с одной или несколькими конструкциями нуклеиновой кислоты. Трансформация клеток дрожжей может в результате приводить к чему угодно от отдельного клона до популяции клеток дрожжей (т.е. дрожжевой библиотеки или библиотек), которые можно использовать для скрининга (a) пептида(пептидов) или белка(белков), экспонированных на поверхности клеток дрожжей, посредством прикрепления к белку на поверхности дрожжей или связывания посредством специфической ковалентной связи или нековалентного взаимодействия с белками или другими компонентами на поверхности клеток дрожжей; (b) пептида(пептидов) или белка(белков), экспрессируемых внутри клеток; или (c) пептида(пептидов) или белка(белков), секретируемых во внеклеточное пространство, такое как культуральная среда, или накапливаемых на твердых поверхностях. Такие дрожжевые библиотеки могут поддаваться удобному использованию для множества применений, для скрининга или характеризации взаимодействий пептида(пептидов) или белка(белков) с другим белком, пептидом, ДНК, РНК или другими химическими веществами, которые можно вводить в клетки дрожжей или добавлять экзогенно. Конкретные примеры этого обнаружены в дрожжевом дисплее, дрожжевой двугибридной системе, дрожжевой трехгибридной системе и т.д.

Изобретение относится к способу трансформации клеток дрожжей, включающему в себя электропорацию суспензии клеток, содержащей дрожжи вместе с одной или несколькими конструкциями нуклеиновых кислот, содержащими один или несколько регуляторных последовательностей и один или несколько генов или фрагментов генов, с использованием одного или нескольких из сопротивления, силы поля и длительности импульса, достаточных для трансформации клеток дрожжей.

В одном из вариантов осуществления сила поля составляет от приблизительно 2,5 кВ/см до приблизительно 12,5 кВ/см. В конкретных вариантах осуществления сила поля составляет приблизительно 0,5 кВ/см, приблизительно 1,0 кВ/см, приблизительно 1,5 кВ/см, приблизительно 2,0 кВ/см или приблизительно 2,5 кВ/см. Для этих значений принимают во внимание, что кювета для электропорации имеет просвет 0,2 см. Более высокие силы поля являются возможными, но их целесообразность в значительной степени зависит от разработки аппарата, который может доставлять более сильный импульс.

В одном из вариантов осуществления длительность импульса составляет от приблизительно 3 миллисекунд до приблизительно 10 миллисекунд. В конкретном варианте осуществления длительность импульса составляет приблизительно 4,8 миллисекунд.

Обработку клеток способами электропорации по изобретению проводят приложением электрического поля к суспензии клеток дрожжей между парой электродов. Силу поля необходимо целесообразно точно регулировать, так чтобы электропорация клеток происходила без повреждения клеток или с минимальным повреждением клеток. Затем можно измерять расстояние между электродами и затем подходящее напряжение согласно формуле E=V/d можно прилагать к электродам (E=сила электрического поля в В/см; V=напряжение в вольтах; и d=расстояние в см).

Генераторы импульса для осуществления способов, описанных в настоящем документе, доступны и были доступны на рынке в течение ряда лет. Одним подходящим генератором сигнала является Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Типичная схема состоит из Gene Pulser II, присоединенного к модулям дополнительного усилителя емкости и дополнительного контроллера импульса.

Дополнительные модели для электропорации являются коммерчески доступными, включая систему Gene Pulser MXcell или эукариотическую систему Gene Pulser × cell (Bio-Rad), электропоратор CelljecT Pro (Thermo Scientific), системы для электропорации Multiporator и другие системы для электропорации Eppendorf® (Eppendorf, Северная Америка), генераторы для электропорации ECM и 96-луночную систему для электропорации BTX^® HT (BTX, Harvard apparatus), все из которых являются подходящими приборами для электропорации клеток дрожжей с использованием описанных здесь условий.

Электропорацию используют по настоящему изобретению для облегчения введения ДНК в клетки дрожжей. Электропорация представляет собой способ с использованием импульсного электрического поля для обеспечения временной проницаемости мембран клеток, позволяющий макромолекулам, таким как ДНК, проходить в клетки. Однако действительный механизм, посредством которого ДНК переносится в клетки, не совсем понятен. Для трансформации Candida famata, например, электропорация неожиданно является эффективной, когда клетки подвергают воздействию экспериментально затухающего импульсного электрического поля, обладающего силой поля от приблизительно 10 до приблизительно 13 кВ/см и величиной сопротивления приблизительно R5 (129 Ом), и постоянного времени приблизительно 4 5 мс. Как правило, сопротивление и емкость либо присутствуют, либо могут быть выбраны пользователем в зависимости от выбранного оборудования для электропорации. В любом случае, конфигурацию оборудования устанавливают согласно инструкциям производителя для обеспечения соответствующим образом силы поля и параметров затухания.

Кроме того, изобретение относится к высокоэффективным способам трансформации дрожжей, обеспечивающим высокий уровень экспрессии любого одного или нескольких желаемых эндогенных (т.е., естественно существующих внутри этой дрожжевой клетки) или гетерологичных генов. Кроме того, способы по изобретению относятся к способу получения библиотек, например, экспрессирующих антитела или их химеры или фрагменты.

По одной программе действий, экспрессирующими векторами, несущими интересующие гены, можно трансформировать клетки-хозяева дрожжей посредством электропорации для получения отдельного клона или библиотеки, состоящей из множества трансформированных клеток, экспрессирующих внутриклеточные белки (например, ядерные или цитоплазматические белки), мембранные белки (например, проходящие через мембрану белки или связанные с мембраной белки), или секретируемые белки. Можно использовать трансформированные клетки или библиотеку для очистки белков, изучения функций белков, идентификации белок-белковых взаимодействий или для идентификации новых связывающих белок веществ или характеров взаимодействия. Важным замечанием является возможность получать очень большие дрожжевые библиотеки, экспонирующие или экспрессирующие антитела и фрагменты антител. Библиотеку можно подвергать отбору посредством антигенов-мишеней для идентификации антител, связывающихся с селективными антигенами.

Поскольку трансформированные дрожжи проявляют тенденцию терять искусственно сконструированные плазмиды, является преимущественным использовать культуральную среду, такую, чтобы оказывать давление положительной селекции на них. Когда штамм является ауксотрофным мутантом по жизненно важному метаболиту, и когда используемая векторная плазмида содержит маркерный ген, способный восстанавливать прототропию штамма, например, ген LEU2, упомянутый выше, это селективное давление можно оказывать исключением метаболита из культуральной среды. Существуют другие средства для получения такого же результата, и их также можно использовать для осуществления изобретения на практике.

В зависимости от природы интересующего структурного гена, продукт или продукт экспрессии может оставаться в цитоплазме дрожжевой клетки-хозяина или секретироваться. Обнаружено, что не только белки, которые остаются в клетке, но и те, которые секретируются, являются растворимыми. Когда продукт или продукт экспрессии предназначен, чтобы оставаться в дрожжевой клетке-хозяине, как правило, может являться желательным иметь индуцибельную область инициации транскрипции, так чтобы пока трансформант не достигнет высокой плотности, экспрессия или продукция желаемого продукта присутствует в небольшом количестве или не присутствует. После времени, достаточного для экспрессии продукта или продукта экспрессии, клетки можно выделять общепринятыми способами, например, центрифугированием, лизисом, и выделять интересующий продукт. В зависимости от природы и применения продукта, лизат можно подвергать различным способам очистки, таким как хроматография, электрофорез, экстракция растворителем, кристаллизация, диализ, ультрафильтрация или т.п. Способы хроматографии включают в себя в качестве неограничивающих примеров газовую хроматографию, HPLC, колоночную хроматографию, ионообменную хроматографию и другие способы хроматографии, известные специалистам в данной области. Степень чистоты может меняться от приблизительно 50% до 90% или выше, предпочтительно, вплоть до приблизительно 100%.

Альтернативно, продукт экспрессии или интересующий продукт можно секретировать в культуральную среду и продуцировать на непрерывной основе, где среду частично отбирают, желаемый продукт экстрагируют, например, колоночной или аффинной хроматографией, ультрафильтрацией, преципитацией или т.п., и использованную среду выбрасывают или рециркулируют возобновлением необходимых компонентов. Фильтрат, содержащий продукт, после ультрафильтрации можно дополнительно подвергать концентрации, с последующим выпариванием, с последующей кристаллизацией или преципитацией с использованием спирта и/или доведения pH. Специалистам в данной области известно много возможностей способов. Когда продукт подлежит секреции, в норме можно использовать конститутивную область инициации транскрипции, хотя можно использовать неконститутивные области.

Если нет иных указаний, все нуклеотидные последовательности, впервые описанные в настоящем документе, определяли с использованием автоматического секвенатора ДНК (например, такого как модель 377 из PE Applied Biosystems, Inc.). Таким образом, как известно в данной области, для любой последовательности ДНК, определенной этим автоматизированным способом, любая нуклеотидная последовательность, определенная в настоящем документе, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные автоматически, как правило, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичны, более конкретно, от по меньшей мере приблизительно на 95% до по меньшей мере приблизительно на 99,9% идентичны действительной нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Действительную последовательность можно более точно определить другими способами, включая способы ручного секвенирования ДНК, хорошо известные в данной области.

Примеры

Пример 1: Получение ДНК вектора

Вектор pYDsTev расщепляли рестрикционными ферментами SfiI и NotI для использования в рекомбинации с фрагментами ДНК scFv + 300 п.о. Для улучшения эффективности и предотвращения трансформации неразрезанным вектором, расщепленный SfiI/NotI вектор дополнительно расщепляли BglII и HpaI (оба разрезают внутри балластного фрагмента).

Расщепленную ДНК очищали с использованием Sureclean от Bioline (Randolph, MA). Кратко, смесь после рестрикционного расщепления смешивали с равным объемом Sureclean. Образцы инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 13200 об/мин Супернатант выбрасывали и осадки промывали 70% этанолом 2,5-кратным объемом от образца. Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 13200 об/мин. Супернатант удаляли и осадки высушивали на воздухе. Осадки ресуспендировали в 5-10 мкл TE pH 8.

Пример 2: Получение ДНК вставки

ДНК вставки получали с использованием ПЦР для амплификации интересующей вставки с добавлением к вставке достаточной 5' и 3' векторной последовательности (например, приблизительно 300 пар оснований) для эффективного проведения гомологичной рекомбинации.

Конструировали праймеры для константной области иммуноглобулина (Таблица 2), гибридизующиеся с иммуноглобулинами IgM и IgG (для кДНК IgM/G) или IgK (кДНК IgK) для синтеза 1^й цепи кДНК. Конкретно, для кДНК IgM/G использовали праймеры FcgRev1, 2, и 3 и FcmRev1, 2 и 3. Для синтеза 1^й цепи кДНК IgK использовали Ckrev1, 2 и 3.

Реакции синтеза кДНК проводили с использованием набора для синтеза 1^й цепи от Invitrogen с использованием вышеуказанных праймеров.

Таблица 1 Иллюстративные реакции ПЦР (Стадия 1)
IgM/G кДНК	IgK кДНК
20 мкл 50 нг/мкл полиA РНК селезенки, CloneTech	10 мкл 50 нг/мкл полиA РНК селезенки CloneTech
ДНК	ДНК
3 мкл 300 нг/мкл FcgRev 1	1,5 мкл 300 нг/мкл CkRev 1
3 мкл 300 нг/мкл FcgRev 2	1,5 мкл 300 нг/мкл CkRev 2
3 мкл 300 нг/мкл FcgRev 3	1,5 мкл 300 нг/мкл CkRev 3
3 мкл 300 нг/мкл FcmRev 1	10 мкл dNTP (10 мМ)
3 мкл 300 нг/мкл FcmRev 2	75,5 мкл бидистиллированной воды
3 мкл 300 нг/мкл FcmRev 3	общий объем 100 мкл
20 мкл dNTP (10 мМ)
142 мкл бидистиллированной воды
общий объем 200 мкл
50 мкл/реакцию, реакции при 65°C в течение 5', затем до 4°C в течение 1 минуты

Таблица 2 Олигонуклеотиды, применяемые в этом исследовании
Наименование олигонуклеотида	Последовательность	Описание	SEQ ID NO
Ckrev 1	TCCACCTTCCACTG	Ck обратный праймер 1	SEQ ID NO: 1
Ckrev 2	CAGGCACACAACA G	Ck обратный праймер 2	SEQ ID NO: 2
Ckrev 3	GAGTGTCACAGAG C	Ck обратный праймер 3	SEQ ID NO: 3
FcGrev 1	AGTTCCACGACACC	IgG обратный праймер	SEQ ID NO: 4
FcGrev2	GAAGGTGTGCACG	IgG обратный праймер	SEQ ID NO: 5
FcGrev	CCACGCTGCTGAG	IgG обратный праймер	SEQ ID NO: 6
FcMrev 1	ACTTTGCACACCAC	IgM обратный праймер	SEQ ID NO: 7
FcMrev 2	TTTGTTGCCGTTGG	IgM обратный праймер	SEQ ID NO: 8
FcMrev 3	GGGAATTCTCACAG G	IgM обратный праймер	SEQ ID NO: 9
PYD5prev	GCGCCCTGAAAATA CAGGTTTTC	Гибридизуется непосредственно на 5'-конце от сайта SfiI в векторе pYD. Использовали совместно с праймером 5107 для получения удлинения приблизительно 300 п.о., добавленного к scFv для увеличения эффективности гомологичной рекомбинации	SEQ ID NO: 10

Стадия 2 синтеза:

45 мкл концентрированной реакционной смеси (подготовленного исходного раствора, содержащего 80 мкл буфера для RT (10×), 160 мкл MgCl_2, 80 мкл 0,1 M DTT, 40 мкл RNAse Out), добавляли к каждым 50 мкл охлажденной реакционной смеси, и пробирки помещали на 42°C на 2 минуты. В каждую реакционную пробирку добавляли 5 мкл обратной транскриптазы SuperscriptII и инкубировали при 42°C в течение 50 минут, переносили на 70°C на 15 минут, и затем переносили на 4°C. В каждую реакционную смесь добавляли 5мкл РНКазы H и затем инкубировали при 37°C в течение 20 минут. Четыре реакционные смеси для IgG/M объединяли, и две реакционные смеси для IgK объединяли.

Пример 3: Получение ДНК IgG/M VH и IgK VL селезенки человека

Разнообразие иммуноглобулинов VH и VK человека амплифицировали с использованием олигонуклеотидных праймеров, определенных в Sblattero and Bradbury (1998) Immunotechnology 3:271-278.

8 × 100 мкл реакционной смеси для образцов VH
80 мкл	10× реакционного буфера для ПЦР
8 мкл	dNTP (10 мМ)
32 мкл	MgSO4 (50 мМ)
8 мкл	обратного праймера для VH (20 мкМ)
8 мкл	эквимолярной смеси прямых VH 1/2, VH4/5, VH3 и VH6 (5 мкМ каждый/всего 20 мкМ 3'-праймер)
16 мкл	кДНК IgM/G
8 мкл	Platinum Taq HiFi
640 мкл	бидистиллированной воды
100 мкл/реакционную смесь

8 × 100 мкл реакционной смеси для образцов VK
80 мкл	10× реакционного буфера для ПЦР
8 мкл	dNTP (10 мМ)
32 мкл	MgSO4 (50 мМ)
8 мкл	обратного праймера для VK (20 мкМ)
8 мкл	эквимолярной смеси VK1, VK2/4, VK3 и VK5 (5 мкМ каждый/всего 20 мкМ 3'-праймер)
16 мкл	кДНК IgK
8 мкл	Platinum Taq Hi Fi
640 мкл	бидистиллированной воды
100 мкл/реакционную смесь

Программа ПЦР:

1. 94°C 2 минуты

2. 94°C 30 секунд

3. 55°C 30 секунд

4. 68°C 30 секунд

5. повторение стадии 2 39 раз

6. 68°C 5 минут

7. 4°C хранение

Реакционные смеси очищали в гелях из 1% GTG агарозы. Полосы правильного размера, приблизительно 400 п.о., очищали с использованием набора для выделения из геля Qiaquick. 0,4 мг содержащей ДНК агарозы использовали для центрифугируемой колонки. Образцы элюировали с помощью 50 мкл EB, предварительно нагретого до 55°C. Сходные образцы объединяли и A_260/280 определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, Delaware).

Пример 4: Получение scFv VH/VK

scFv VH/VK получали посредством ПЦР со стыковкой перекрывающихся фрагментов (SOE) ПЦР. Прямой VH и обратный VK праймеры разделяли гомологию, образующую линкер (Gly₄Ser)₃, соединяющий области VH и VL для получения молекулы scFv. Реакционные смеси подготавливали следующим образом:

24 реакционные смеси при 100 мкл/реакционную смесь (сборка VH10/VK в качестве примера)
240 мкл	10x буфера для Plat Taq Hi Fi
24 мкл	dNTP (10 мМ)
96 мкл	MgSO4 (50 мМ)
24 мкл	scFv Rev (20 мкМ)
24 мкл	scFv For (20 мкМ)
141 мкл	обратного VH10 (24 пмоль VH/1 пмоль на 100 мкл реакционной смеси)
72 мкл	эквимолярной смеси ДНК VK1, 2, 9 и 12 (24 пмоль всего/0,25 пмоль каждого VK на 100 мкл реакционной смеси)
24 мкл	Platinum Taq HiFi
1755 мкл	бидистиллированной воды
100 мкл/реакционную смесь

Программа ПЦР

1. 94°C 2 минуты

2. 94°C 30 секунд

3. 55°C 30 секунд

4. 68°C 1 минута

5. Переход к стадии 2 39x

6. 68°C 5 минут

7. 4°C хранение

Полосы scFv (приблизительно 800 п.о.) очищали в геле, как выше для фрагментов геля с VH или VK. Сходные образцы объединяли для использования в SOE ПЦР с фрагментом pYD5'300 п.о.

Для обеспечения увеличенной эффективности трансформации авторы настоящего изобретения сконструировали фрагменты ДНК вставки, обладающие приблизительно 300 п.о. гомологии на 5'-конце от участка вставки scFv (SfiI) в векторе pYD. Для добавления этой гомологии к scFv селезенки человека сконструировали праймер, комплементарный области непосредственно на 5'-конце от участка SfiI pYD1sTev (pYD5prev). Этот праймер использовали в сочетании с 5'-праймером pYD1 (5107) для получения фрагмента приблизительно 300 п.о. для добавления к существующему scFv селезенки посредством SOE ПЦР.

ПЦР 5107/pYD5prev
1 мкл	pYDsTev (10 нг/мкл)
10 мкл	10× буфера для Plat Taq Hi Fi
4 мкл	MgSO4 (50 мМ)
1 мкл	dNTP (10 мМ)
1 мкл	5107 (20 мкМ)
1 мкл	pYD5prev (20 мкМ)

1 мкл	Platinum Taq Hi Fi
80 мкл	бидистиллированной воды
100 мкл/реакционную смесь

Программа ПЦР

1. 94°C 2 минуты

2. 94°C 30 секунд

3. 55°C 30 секунд

4. 68°C 30 секунд

5. Переход к стадии 2 39x

6. 68°C 5 минут

7. 4°C хранение

Полосы 5107/pYD5prev (приблизительно 300 п.о.) очищали в геле как выше для фрагментов геля с VH или VK. Сходные образцы объединяли для использования в SOE ПЦР с scFv селезенки.

scFv+300 ПЦР (смесь для 16×100 мкл реакционной смеси)
162 мкл	10× буфера для Plat Taq Hi Fi
16,2 мкл	dNTP (10 мМ)
64,8 мкл	MgSO4 (50 мМ)
16,2 мкл	5107 (20 мкМ)
16,2 мкл	scFv For (20 мкМ)
32,4 мкл	VH/VK scFv ДНК
16,2 мкл	5107/pYDprev5 ДНК
16,2 мкл	Platinum Taq HiFi
1279,8 мкл	бидистиллированной воды
100 мкл/реакционную ссмесь

Реакции ПЦР проводили как для реакции с scFv выше. ScFv+300 п.о. (приблизительно 1100 п.о.) очищали в геле, как выше для фрагментов геля с VH или VK. Сходные образцы объединяли для использования в реакциях электропорации.

Пример 5: Способ трансформации дрожжевой библиотеки из предшествующей области техники

Нижеследующее представляет собой способ трансформации дрожжей из предшествующей области техники. Пять мл среды YPD инокулируют колонией EBY100 (свежепосеянной штрихом на чашке с YPD) и выращивают в течение ночи при 30°C. 50 мл культуры инокулируют в среду YPD до оптической плотности 0,1 при 600 нм с использованием ночной культуры, и клетки выращивали при 30°C до поглощения приблизительно 1,3-1,5 при 600 нм в течение приблизительно 6 часов. Клетки должны находиться в начальной - средней логарифмической фазе роста. Использование клеток в поздней логарифмической или стационарной фазе значительно уменьшает эффективность трансформации. Во время роста клеток ДНК преципитируют для трансформации с использованием PelletPaint согласно способу производителя. Как правило, ДНК для помещения в четыре кюветы для электропорации, каждая с 5 мг вставки и 1 мг разрезанного вектора, используют для получения библиотеки приблизительно 5 × 10⁷. Также получают контроль из одного остова. ДНК оставляют в форме осадка. Соотношения вставка:остов можно менять от 5:1 до 1:1 с по меньшей мере 1 мг остова на кювету.

При достижении клетками оптической плотности приблизительно 1,3-1,5 при 600 нм, 500 мкл Трис-DTT буфера добавляют к культуре и инкубируют в встряхивателе при 30°C в течение 15 минут. Эффективность трансформации является относительно постоянной для времени инкубации с DTT 10-20 минут, но значительно уменьшается при инкубации более 20 минут. Клетки осаждают при 2500 g в течение 3 минут при 4°C и промывают с помощью 25 мл ледяного буфера E (10 мМ Трис pH 7,5, 270 мМ сахароза, 1 мМ MgCl₂) (например, промывают, заново осаждают и отсасывают супернатант). Клетки снова промывают 1 мл ледяного буфера E и ресуспедируют в буфере E в общем объеме 300 мкл. Контрольные осадки ДНК ресуспендируют в подходящем объеме суспензии клеток (50 мкл на кювету). Клетки сохраняют на льду. Аликвоту 50 мкл ресуспендированной смеси клетки-ДНК отбирают в предварительно охлажденную кювету для электропорации, и кюветы для электропорации сохраняют на льду до обработки импульсами.

Кюветы загружают в gene pulser и подвергают электропорации при 0,54 кВ и 25 мкФ без контроллера импульсов. 1 мл теплой (30°C) среды YPD немедленно добавляют в кювету. Типичные константы времени для электропорации лежат в диапазоне от приблизительно 15 мс до 40 мс без большого влияния на эффективность трансформации.

Клетки переносят из подвергнутых воздействию импульса кювет в 15-мл пробирку Фалькон. Каждую кювету промывают дополнительным 1 мл среды YPD для извлечения оставшихся клеток из кюветы. Клетки встряхивают в течение 1 часа при 30°C. Клетки осаждают при 2500 g в течение 5 минут, супернатант удаляют и ресуспендируют в 10 мл среды SDCAA. Серийные разведения рассевают на чашки SDCAA для определения эффективности трансформации. Контроль с одним остовом должен обладать эффективностью менее 1% эффективности трансформации остов-плюс-вставка. Суспензию клеток переносят во флакон с 100-1000 мл среды SDCAA плюс пенициллин-стрептомицин (разведение 1:100) и инкубируют при 30°C в течение 24-48 часов. Этот способ использовали для получения библиотеки 8 × 10⁷, и он соответствует обработке 7, описанной в таблице 3 с эффективностью 0,4% по сравнению с оптимизированным способом по изобретению (смотри пример 6).

Пример 6: Протокол трансформации дрожжевой библиотеки из способа 2 по изобретению

Изобретение относится к высокоэффективным и быстрым способам трансформации клеток дрожжей, например, к получению библиотек клеток дрожжей размером вплоть до 2 × 10¹⁰. Множество компонентов и условий, включая использование CaCl₂, MgCl₂, сахарозы, сорбита, ацетата лития, дитиотреитола (DTT), напряжение электропорации, нагрузку ДНК и объем клеток, тестировали и титровали для идентификации оптимальных условий.

Способ электропорации по изобретению представляет собой вариант способов Suga and Hatakeyama (2003) Curr. Genet. 43:206-211; Neumann et al. (1996) Biophys. J. (1996) 71:868-877; Thompson et al. (1998) Yeast 14:565-571; Becker and Guarente (1991) Methods Enzymol. 194, 182-187; Melihon et al. (1990) Biotechnology 8:223-227; Helmuth et al. (2001) Analytical Biochem. 293:149-152; и способа, представленного в примере 5.

Подготовка клеток дрожжей: S. cerevisiae выращивали в течение ночи до стационарной фазы. Аликвоту культуры инокулировали в 100 мл среды YPD до достижения OD₆₀₀ приблизительно 0,3. Клетки выращивали до достижения OD₆₀₀ приблизительно 1,6 до сбора центрифугированием. Осадок клеток промывали дважды холодной водой, один раз 50 мл буфера для электропорации (1 M Сорбит/1 мМ CaCl₂) и инкубировали в 20 мл 0,1 M LiAc/10 мМ DTT при 30°C в течение 30 минут. Клетки снова промывали 50 мл буфера для электропорации, затем суспендировали в 100-200 мкл буфера для электропорации для достижения объема 1 мл. Это соответствует приблизительно 1-10 × 10⁹ клеток/мл.

Электропорация: для электропорации использовали 100, 200, 300 или 400 мкл суспензии клеток на кювету и использовали 1, 2, 3 или 4 мкг линеаризованного вектора с соответствующими 3, 6, 9 или 12 мкг ДНК вставки (соотношение вектора к вставке = 1:3). Клетки подвергали электропорации при 2,5 кВ и 25 мкФ в кювете GenePulser BioRad (просвет между электродами 0,2 см). Типичные константы времени электропорации лежали в диапазоне от 3,0 до 4,5 миллисекунд. После электропорации клетки суспендировали в 10 мл смеси 1:1 1 M сорбит:среда YPD и инкубировали при 30°C в течение 1 часа. Затем клетки собирали и культивировали в среде SD-UT (-ura, -trp), содержащей 20 г/л глюкозы, 6,7 г/л азотной основы среды для дрожжей без аминокислот, 5,4 г/л Na₂ HPO₄, 8,6 г/л NaH₂PO₄ H ₂O и 5 г/л казаминокислот. Число трансформантов определяли рассевом 10-кратных серийных разведений трансформированных клеток на селективных чашках SD-UT. Ссылаясь на фигуру 3, через 72 часа колонии подсчитывали и эффективность трансформации (A) выражали как среднее от числа трансформантов/мкг ДНК вектора ± стандартное отклонение; и выходы (B) выражали как среднее от общего числа трансформантов на кювету ± стандартное отклонение.

Комбинация LiAc, DTT, CaCl₂ и сорбита постоянно приводила к эффективности трансформации 3 ± 1 × 10⁷ трансформантов на мкг ДНК вектора для 1 мкг ДНК вектора и 100 мкл клеток дрожжей при плотности 1,6×10 клеток/мл (как определяли по оптической плотности при 600 нм, принимая 1 OD эквивалентной 10⁷ клеток) (Фигура 3). Это позволяет предполагать, что приблизительно 2% клеток дрожжей являлись успешно трансформированными, и размер библиотеки 3±1×10⁷ можно ожидать из одной кюветы для электропорации. Для получения библиотек даже большего размера оценивали оптимальный объем клеток на отдельную кювету. Неожиданно эффективность трансформации являлась значительно увеличенной до 1×10⁸ трансформантов на мкг ДНК вектора, когда объем клеток увеличивали от 100 мкл до 200 мкл на кювету. При максимальном объеме клеток 400 мкл на кювету с просветом 0,2 см, размеры библиотек, настолько большие, как 5×10 ⁸, можно было легко получить из одной кюветы с использованием такой же плотности и соотношения клеток к ДНК (фигура 3).

Этот способ электропорации является высоко воспроизводимым, поскольку сходную эффективность трансформации получали два различных оператора и на двух различных электропораторах (BioRad Gene Pulser модель # 1652076 и Gene Pulser^® II модель # 1652108).

Пример 7: Увеличенная эффективность электропорации S. Cerevisiae при сравнении использования LiAc, DTT, сорбита и CaCl₂

В таблице 3 показаны эффективность электропорации, выход на кювету, % эффективности и максимальный размер библиотеки для способа из примера 6, так же как вариантов способа.

Таблица 3
Обработка	Эффективность электропорации a ×107	Выход на кюветуb ×107	% эффективностиc	Максимальный размер библиотекиd
1. Комбинированный способ	18,3±2,5	73,2±9,7	100	2×1010
2. Без LiAc	1,7±0,1	6,7±0,4	9	1,4×109
3. Без DTT	0,81±0,017	3,3±0,07	4	8×108
4. Сорбит/MgCl 2	11,4±0,9	45,5±3,5	62	9×109
5. Только сорбит	9±1,8	36±7,1	49	8×109
6. Сахароза/CaCl 2	0,4±0,3	1,6±1,5	2	3,8×108
7. Сахароза/MgCl 2	0,09±0,01	0,4±0,07	0,4	8×107
aЧисло трансформантов на мкг ДНК вектора
bОбщее число трансформантов на реакцию в кювете для электропорации
cПринимая эффективность трансформации, полученную с использованием способа, равной 100%
dПринимая проведение 25 реакций в кювете для электропорации за одни сутки

Комбинированный способ представляет собой описанный в примере 6 способ электропорации 400 мкл суспензии дрожжей (1,6×10⁹/мл) с 4 мкг вектора и 12 мкг ДНК вставки. Для других обработок комбинированный способ следовал примеру 6 за исключением следующих изменений: (2) Клетки предварительно обрабатывали только DTT; (3) Клетки предварительно обрабатывали только LiAc; (4) MgCl₂ использовали вместо CaCl₂. (5) CaCl₂ исключали из буфера для электропорации; (6) 270 мМ сахарозу использовали вместо 1М сорбита; и (7) 270 мМ сахарозу/1 мМ MgCl₂ использовали в качестве буфера для электропорации.

Как показано в таблице 2, исключение предварительной обработки DTT или LiAc приводило к соответствующему уменьшению эффективности на 93,3% и 85,7%. Сходным образом, исключение сорбита или замена его сахарозой приводили к потере более 96% эффективности (Таблица 2 и не представленные данные). Это соответствует предыдущим обнаружениям, что способность сорбита стабилизировать осмотическое давление и поддерживать целостность мембраны дрожжей после электропорации являлась по меньшей мере частично ответственной за достижение высокой эффективности трансформации (Becker, D.M. and Guarente, L. (1991) Methods Enzymol. 194:182-7; Weaver, J. С.et al. (1988) FEBS Lett. 229:30-4). Присутствие CaCl₂ во время электропорации, предположительно облегчающее связывание ДНК с мембраной клеток (Neumann, Е. et al. (1996) Biophys. J. 71:868-77), по-видимому является наименее критическим параметром, поскольку его исключение только умеренно уменьшает эффективность трансформации на 30% и его замена на MgCl₂ приводит только к небольшому 11% уменьшению.

Пример 8: Эффект напряжения на эффективность электропорации

Эксперимент проводили для определения эффекта напряжения на эффективность электропорации и для определения наилучшего соотношения вектор:вставка. Эксперимент проводили дважды. Способ из примера 6 осуществляли с использованием нескольких напряжений в диапазоне 0,5-2,5 кВ и с несколькими соотношениями вектор:вставка в диапазоне от 1:1 до 1:10 (масс./масс.), где количество ДНК вектора поддерживали постоянным при 1 мкг. Все реакционные смеси концентрировали и преципитировали с использованием SureClean и ресуспендированием осадка ДНК в ddH₂O перед добавлением суспензии клеток, как описано выше.

В каждом эксперименте клетки дрожжей подготавливали, как описано выше. Объем вектора/вставки фиксировали на 11,6 мкл для 5 реакций.

Эксперимент #1

Таблица 4 График, описывающий число колоний как функцию от вектора:вставки и силы поля 1
	2,5 кВ/см		5 кВ/см	7,5 кВ/см		10 кВ/см		12,5 кВ/см
1:1	0		0	2		83		21
1:2	0		2	26		170		160
1:3	0		1	84		212		104
1:4	6		1	104		362		139
1:5	0		1	61		179		68
1:10	0		3	52		182		126
1 Электропорацию проводили в кювете с просветом 0,2 см при напряжении в диапазоне от 0,5 до 2,5 кВ
Таблица 5 Эффективность трансфекции как функция от вектора:вставки и силы поля1
Эффективность трансфекции		7,5 кВ/см			10 кВ/см		12,5 кВ/см
1:1		2,00E+06			8,30E+07		2,10E+07
1:2		2,60E+07			1,70E+08		1,60E+08
1:3		8,40E+07			2,12E+08		1,04E+08
1:4		1,04E+08			3,62E+08		1,39E+08
1:5		6,10E+07			1,79E+08		6,80E+07
1:10		5,20E+07			1,82E+08		1,26E+08
1 Электропорацию проводили в кювете с просветом 0,2 см при напряжении в диапазоне от 0,5 до 2,5 кВ

Результаты: Трансформацию детектировали с соотношением вектор:вставка 1:1 в диапазоне напряжений 1,5-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:2 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:3 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:4 0,5-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:5 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; и с соотношением вектор:вставка 1:10 в диапазоне напряжений 1,0-2,5. Для всех соотношений вектор:вставка пика числа колоний достигали с использованием напряжения 2,0 кВ. Оптимальными условиями, по-видимому, являлись соотношение вектор:вставка 1:4 и напряжение 2,0 кВ, где достигали эффективности трансфекции 3,62 × 10 ⁸.

Эксперимент #2

Таблица 6 График, описывающий число колоний как функцию от вектора:вставки и силы поля 1
Набор данных 2	2,5 кВ/см	5 кВ/см	7,5 кВ/см	10 кВ/см	12,5кВ/см
1:1	0	1	19	65	44
1:2	0	0	45	110	154
1:3	0	1	37	92	152
1:4	0	1	50	136	160
1:5	0	1	51	116	163
1:10	0	1	0	123	167
1 Электропорацию проводили в кювете с просветом 0,2 см при напряжении в диапазоне от 0,5 до 2,5 кВ

Таблица 7 Эффективность трансфекции как функция от вектора: вставки и силы поля 1
Эффективность трансфекции	7,5 кВ/см	10 кВ/см	12,5 кВ/см
1:1	1,90E+07	6,50E+07	4,40E+07
1:2	4,50E+07	1,10E+08	1,54E+08
1:3	3,70E+07	9,20E+07	1,52E+08
1:4	5,00E+07	1,36E+08	1,60E+08
1:5	5,10E+07	1,16E+08	1,63E+08
1:10	0,00E+00	1,23E+08	1,67E+08
1 Электропорацию проводили в кювете с просветом 0,2 см при напряжении в диапазоне от 0,5 до 2,5 кВ

Результаты: Трансформацию детектировали с соотношением вектор:вставка 1:1 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:2 в диапазоне напряжений 1,5-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:3 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:4 в диапазоне напряжений 0,5-2,5; с соотношением вектор:вставка 1:5 в диапазоне напряжений 1,0-2,5; и с соотношением вектор:вставка 1:10 в диапазоне напряжений 1,0-2,5, с отсутствием колоний при 1,5 кВ. Для соотношения вектор:вставка 1:1 пика числа колоний достигали с использованием напряжения 2,0 кВ. Для всех других соотношений вектор:вставка 2,5 кВ напряжение являлось оптимальным. Оптимальными условиями, по-видимому, являлись соотношение вектор:вставка 1:10 и напряжение 2,5 кВ. Результаты этого эксперимента показывают, что оптимальное напряжение составляет 2-2,5 кВ, с увеличенными количествами вставки относительно вектора, не обеспечивающими значительного преимущества над соотношением 1:2.

Эксперимент #3: Увеличенная нагрузка ДНК и высокое напряжение, но не соотношение вектор:вставка являются критическими для максимальной эффективности трансформации.

Эффект количества ДНК на эффективность трансформации исследовали посредством электропорации 400 мкл суспензии дрожжей 1, 2, 3, 4, или 8 мкг ДНК вектора при поддержании одинакового соотношения вектор: вставка 1:3. S. cerevisiae обрабатывали, как описано в примере 7. 400 мкл суспензии клеток дрожжей (1,6 × 10 ⁹ клеток/мл) подвергали электропорации с использованием 1, 2, 3, или 4 мкг вектора на кювету (при поддержании соотношения вектор: вставка = 1:3). Ссылаясь на фигуру 4, через 72 часа число колоний определяли и представляли как (A) эффективность трансформации (среднее количество трансформантов на мкг ДНК вектора ± стандартное отклонение) и (B) выход трансформации (общее число трансформантов на кювету ± стандартное отклонение). Кроме того, (C) 400 мкл суспензии дрожжей подвергали электропорации при 2 или 2,5 кВ и различных соотношениях ДНК вектора и вставки. Эффективность трансформации выражали как среднее количество трансформантов на мкг ДНК вектора.

Интересно, что эффективность трансформации значительно не изменялась, когда вплоть до 4 мкг ДНК вектора использовали для каждой трансформации, и только слабо уменьшалась при нагрузке 8 мкг ДНК вектора (Фигура 4A). Как ожидалось, выход размера трансформированной библиотеки соответствующим образом увеличивался при увеличении количества нагрузки ДНК (Фигура 4B). В общем, использование 4 мкг линеаризованного вектора оказалось наиболее подходящим и эффективным условием. Для исследования, можно ли уменьшить 12 мкг ДНК вставки (для достижения соотношения вектор:вставка 1:3), тестировали различные соотношения вектор:вставка. Результаты показывают, что соотношение может являться настолько низким, как 1:1,5 без отрицательного влияния на эффективность трансформации (Фигура 4C). Однако наблюдали более низкую эффективность трансформации, когда соотношение вектор:вставка составляло менее 1:1 или более 1:5 (данные не представлены). Кроме того, обнаружили, что установка напряжения электропорации является критической, поскольку уменьшение напряжения электропорации от 2,5 кВ до 2 кВ или ниже приводило к значительной потере эффективности трансформации (Фигура 4C и не представленные данные).

Пример 9: Разнообразие и продуктивность библиотеки антител наивной селезенки человека

Способ электропорации по изобретению использовали для получения большой библиотеки антител человека. Фрагменты кДНК VH и VK человека из коммерчески доступной поли-A РНК селезенки по отдельности амплифицировали с использованием полимеразных цепных реакций (ПЦР) и ранее опубликованных праймеров (Sblattero, D. and Bradbury, A. (1998) Immunotechnology 3:271-8). Фрагменты V пропорционально объединяли вместе так, чтобы каждое зародышевое семейство было в равной степени представлено в библиотеке. Фрагменты ScFv по отдельности получали из фрагментов VH и объединенных фрагментов V посредством перекрывающегося ПЦР. Множество дрожжевых библиотек получали из этих фрагментов scFv, смешанных с линейной ДНК вектора, посредством электропорации и пропорционально объединяли вместе для поддержания эквивалентного представления всех зародышевых последовательностей VH. Большое число колоний дрожжей секвенировали для анализа состава зародышевых scFv, и результаты подтвердили высокое разнообразие. За исключением редких зародышевых генов VH7, все другие семейства зародышевых генов идентифицировали, и их представление являлось приблизительно пропорциональным числу их зародышевых генов в библиотеке авторов настоящего изобретения (смотри таблицу 8). Поскольку не идентифицировали идентичных последовательностей VH, оценили, что разнообразие библиотеки имеет 95% вероятность являться настолько большим, как 10 ¹², принимая максимальное теоретическое разнообразие 10 ⁴ для V и разнообразие 10⁸ для VH (приблизительно 10 ⁸ B-клеток донора), и ограничено только размером библиотеки. С использованием этого высокоэффективного способа электропорации дрожжей в настоящее время является возможным конструировать дрожжевые библиотеки с размерами, приближающимися к типичным фаговым библиотекам (Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Sblattero, D. and Bradbury, A. (2000) Nat. Biotechnol. 18:75-80). Действительно, занимает только одни сутки получение дрожжевой библиотеки 2 × 10¹⁰ просто масштабированием электропорации до двадцати кювет, и дрожжевые библиотеки 10⁹ в настоящее время возможно общепринятым образом получать для аффинного созревания или других целей оптимизации.

Таблица 8 Разнообразие библиотеки антител наивной селезенки человека
Зародышевые семейства VH	Теоретическое распределение (%)	Наблюдаемое разнообразие библиотеки наивной селезенки человека (%) (n=347)
VH1	21	15
VH2	7	5
VH3	50	62
VH4	16	16
VH4(DP63)	2,5	3,2
VH5	0,5	0,3
VH6	2,5	1,5
VH7	0,5	0

Чтобы показать, что сконструированные библиотеки продуцируют антитела с разумно хорошей аффинностью, проводили отбор библиотеки антител селезенки человека против фактора некроза опухоли человека (TNF ), сначала посредством сортировки активированных магнитным полем клеток для уменьшения размера библиотеки до приблизительно 10⁷ клеток, затем посредством многих циклов FACS, в основном, как описано ранее (Chao, G. et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-68; Feldhaus, M. J. et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:163-70). Идентифицировали множество связывающих TNF членов, и их VH происходят из зародышевых последовательностей VH1, VH3 и VH4 человека, а V из зародышевых последовательностей V 1 и V 2 человека, что указывает на то, что библиотека действительно продуцирует связывающие антиген члены из разнообразного пула антител. Для одного из scFv показали аффинность к TNF 4 нМ, а для другого показали аффинность к TNF 40 нМ. При превращении в IgG связывающий с 4 нМ член сохранял сходную аффинность связывания (1,5 нМ по ELISA), в то время как для связывающего с 40 нМ члена показали значительное увеличение аффинности (0,3 нМ по ELISA). Это увеличение кажущейся аффинности может быть обусловлено авидностью превращенных IgG, взаимодействующих с двумя TNF в одном и том же гомотримерном белке TNF . Дополнительными отборами библиотеки также идентифицировали антитела с низкой наномолярной аффинностью против IL-18 человека из этой библиотеки (данные не представлены).

С использованием наиболее оптимального условия электропорации можно общепринятым образом достигать эффективности трансформации дрожжей 1 × 10⁸ трансформантов дрожжей/мкг ДНК вектора. Поскольку этой эффективности трансформации достигают в минимальном объеме клеток (100 мкл), это хорошо подходит для автоматизации и многолуночных устройств для электропорации. Например, можно предусматривать, что посредством наладки электропорации в 96-луночном планшете для электропорации можно достигать размера библиотеки 9,6 × 10⁹. При повторении этой многолуночной электропорации 10-11 раз вручную или автоматически, можно легко сконструировать дрожжевую библиотеку из более 10¹¹ трансформантов за одни сутки. Эта эффективность и возможный размер сконструированной библиотеки приближается к эффективности и размеру типичной фаговой библиотеки, и является очень желательной для максимизации доли успешных попыток с использованием сконструированной дрожжевой библиотеки для различных применений, которые можно прилагать к библиотеке, таких как дрожжевой дисплей антител и дрожжевой двугибридный скрининг взаимодействий.

Список литературы

Включение в качестве ссылки

Содержание всех процитированных ссылок (включая литературные источники, патенты, патентные заявки и интернет-узлы), которые могут быть процитированы на протяжении этой заявки, таким образом, являются в прямой форме приведенными в качестве ссылки. В практическом осуществлении изобретения можно применять, если нет иных указаний, общепринятые способы электропорации клеток и биологии клеток дрожжей, хорошо известные в данной области.

Эквиваленты

Изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отклонения от его содержания или существенных характеристик. Вышеизложенные варианты осуществления, таким образом, следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие изобретение, описанное в настоящем документе. Объем изобретения, таким образом, указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в предшествующем описании, и все изменения, находящиеся в пределах значения и диапазона эквивалентности пунктов формулы изобретения, таким образом, предназначены для включения в него.