способ выделения низкомолекулярных пептидов

Классы МПК:C07K1/12 гидролизом
C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов
C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Волкова Лариса Владимировна (RU),
Казьянин Александр Викторович (RU),
Мальгина Дарья Юрьевна (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-06-05
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций. Способ включает ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. В качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза. Проводят осветление раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин. Изобретение позволяет выделить низкомолекулярные пептиды и повысить их биологическую активность. 2 табл., 1 пр.

Формула изобретения

Способ выделения низкомолекулярных пептидов, включающий ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.

Известно, что естественные низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой до 15 кДа способны поддерживать гомеостаз организма, проявляя разнообразную активность - антибактериальную, противовирусную, антиоксидантную, регенеративную. Пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа имеют повышенную биодоступность при наружном применении. Обзор литературы показывает, что в результате ограниченного протеолиза биологически активного белка - предшественника-гемоглобина образуются пептиды, модулирующие функции иммунной, нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и других систем организма [Малкова Н.В. Р-эндорфинподобный пептид иммунорфин: свойства и механизм действия. Дис.к.б.н., М., 2002. 121 с.].

В качестве прототипа принято описание изобретения «Способ выделения низкомолекулярных пептидов» к патенту RU 2416243, МПК A23J 1/20, опубликовано: 20.04.2011, бюл. № 11.

Способ осуществляют следующим образом. Получают гидролизат ферментативным гидролизом молозивной казеиново-сывороточной массы с использованием 0,3-0,6 г панкреатина на 1 л гидролизуемой смеси в течение 3-4 часов и с коррекцией среды 25%-ным водным раствором аммиака. К полученному гидролизату добавляют 300 г сефадекса G-25, оставляют на 10 мин, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочный раствор удаляют, набухший гель элюируют дистиллированной водой, вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Полученные жидкие фракции стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Из одного литра гидролизата получают 118-123 мл фракции, содержащей низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой от 3 до 15 кДа. Для получения сухой формы фракции подвергают лиофильному высушиванию. Наличие низкомолекулярных пептидов во фракции проверяют электрофорезом в ПААГ. В прототипе дано описание выделенных пептидных фракций (табл.1).

Таблица 1
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате молозивной казеиново-сывороточной массы (электрофорез в ПААГ)
способ выделения низкомолекулярных пептидов, патент № 2510398 %±m
Пептиды с молекулярной массой от 7 до 14 кДа 9,3±4,7
Пептиды с молекулярной массой от 3 до 7 кДа54,3±14,0
Аминокислоты (молекулярная масса менее 3 кДа)36,4±4,2

Данные табл.1 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы позволяет получить пептиды с молекулярной массой от 3 до 14 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 3 до 7 кДа.

Признаки изобретения, общие с прототипом, заключаются в наличии ферментативного гидролиза исходного сырья, центрифугировании с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

Недостатком прототипа является способ выделения пептидов с использованием сефадекса G-25, обладающего высокой селективностью по молекулярной массе и способного удерживать до элюции узкий спектр пептидов с молекулярной массой от 1 до 5 кДа, что приводит к удалению большей части низкомолекулярных пептидов с другой молекулярной массой вместе с надосадочной жидкостью после центрифугирования, снижая тем самым биологическую ценность гидролизата.

Задача, решаемая изобретением, заключается в повышении биологической активности пептидов.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в снижении молекулярной массы пептидов.

Технический результат достигается тем, что в способе выделения низкомолекулярных пептидов, включающем ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин.

Использование в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, включающей в свой состав широкий спектр низкомолекулярных пептидов, обеспечивает дальнейшую возможность их выделения в технологии. Осуществление операций гемолиза, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза и осветления позволяет выделить больший спектр низкомолекулярных пептидов и изготовить необходимую композицию на их основе.

Признаки изобретения, отличающиеся от прототипа, заключаются в использовании в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используют эритромассу крови доноров. Отобранная для переработки эритромасса должна пройти вирусологический контроль (HBS-антиген к вирусу гепатита В, антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ отсутствуют), рН (6,81±0,23), содержание аминного азота (249,90±36,35) мг%. Физико-химические параметры могут варьироваться в зависимости от сезона кроводачи, возраста и пола донора.

Гидролизат получают ферментативным гидролизом предварительно гемолизированной и вирусинактивированной эритромассы крови доноров с 2% пепсина от исходного объема в течение 144 ч и с коррекцией среды (0,01-0,1)М раствором соляной кислоты до рН (1,5-2,0), инактивируют фермент, осветляют гидролизат раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин и осаждают балластные вещества методом центрифугирования при 1,3*10 3 об/мин в течение 15 мин. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Определение молекулярной массы пептидов в гидролизате проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С 1 л исходного сырья эритромассы получают (100-110) г сухого вещества, что соответствует содержанию аминного азота (390-430) мг%, представленного низкомолекулярными пептидами, аминокислотами (табл.2).

Таблица 2
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате эритромассы (метод ВЭЖХ)
способ выделения низкомолекулярных пептидов, патент № 2510398 %±m
Пептиды с молекулярной массой от 4,5 до 6,0 кДа89,00±1,20
Пептиды с молекулярной массой от 2 до 4,5 кДа7,00±0,12
Мелкие пептиды и аминокислоты с молекулярной массой до 1,0 кДа4,10±0,09

Данные таблицы 2 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из эритромассы позволяет получить пептиды с молекулярной массой до 6,0 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 4,5 до 6,0 кДа (до 90%). Нужно отметить, что при хроматографии образцов обнаруживаются пептиды с молекулярной массой от 2,0 до 4,5 кДа и до 1,0 кДа. Способ обеспечивает получение депротеинизированного раствора, содержащего спектр низкомолекулярных пептидов до 6 кДа, без потерь на фракционирование.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2510398

patent-2510398.pdf

Класс C07K1/12 гидролизом

способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) -  патент 2458989 (20.08.2012)
способ получения протеогликана -  патент 2401839 (20.10.2010)
применение пролинспецифичных эндопротеаз для гидролиза пептидов и белков -  патент 2370279 (20.10.2009)
композиция для детоксикации осадков очистных сооружений, способ ее получения и способ детоксикации осадков очистных сооружений -  патент 2291165 (10.01.2007)
способ утилизации отходов, содержащих животные белки, и устройство для его осуществления -  патент 2291164 (10.01.2007)
способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов bfgf (10 - 155) и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2093519 (20.10.1997)
способ получения белкового гидролизата -  патент 2065444 (20.08.1996)
способ получения пептидов с высоким содержанием триптофана -  патент 2043364 (10.09.1995)
способ очистки бычьего сывороточного альбумина -  патент 2014335 (15.06.1994)

Класс C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов

способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии -  патент 2509155 (10.03.2014)
способ выделения рекомбинантных белков -  патент 2499052 (20.11.2013)
способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) -  патент 2458989 (20.08.2012)
дрожжевой экстракт, содержащий двунатриевую соль инозината и двунатриевую соль гуанилата, и способ его получения -  патент 2456347 (20.07.2012)
гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека -  патент 2453604 (20.06.2012)
способы получения симвастатина -  патент 2447152 (10.04.2012)
гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2b человека из этого гибридного белка -  патент 2441072 (27.01.2012)
способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативный гидролизат молочного гриба -  патент 2421513 (20.06.2011)
биологически активный пептид, полученный из молочного белка -  патент 2415943 (10.04.2011)

Класс C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

способ получения нового полимерного соединения, обладающего противовирусной активностью, сополимеризацией 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина с помощью фермента лакказы -  патент 2494119 (27.09.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485133 (20.06.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485132 (20.06.2013)
комбинация пептидов -  патент 2482127 (20.05.2013)
активирующий люминесценцию белка гидридный комплекс -  патент 2475493 (20.02.2013)
способ получения и очистки ингибина-а человека -  патент 2434018 (20.11.2011)
штамм staphylococcus hominis klp-1 - продуцент низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных бактерий -  патент 2428470 (10.09.2011)
очистка белков с помощью катионного поверхностно-активного вещества -  патент 2426738 (20.08.2011)
способ прогнозирования вторичной структуры белка -  патент 2425837 (10.08.2011)
пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках -  патент 2401275 (10.10.2010)
Наверх