средство для лечения мастита в ветеринарии на основе соли фосфония

Формула изобретения

Средство для лечения и профилактики субклинического, клинического, острого и хронического мастита в ветеринарии, включающее действующее вещество и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что действующим веществом является трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромид, а фармацевтически приемлемым носителем вазелин при соотношении 1:2000.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится преимущественно к ветеринарии, а именно к акушерству и гинекологии, предназначено для лечения и профилактики субклинического, клинического, острого и хронического мастита у коров и других сельскохозяйственных и домашних животных, вызванного экзогенными или эндогенными инфекционными факторами, приводящими к болезненному воспалению, покраснению, отечности сосков; у коров и других дойных сельскохозяйственных животных молоко при этом заболевании выдаивается с большим трудом; выдоенное молоко в зависимости от вида мастита водянистое; содержит хлопья или же кровянистые сгустки.

Заявляемое средство может быть использовано для лечения мастита у человека.

Задачей заявленного технического решения является разработка средства на основе вазелиновой мази и соли фосфония для лечения и профилактики субклинического, клинического и острого мастита у коров и других сельскохозяйственных и домашних животных с выраженным антибактериальным, антимикотическим и антиоксидантным действием, обладающего низкими лечебными дозами (при соотношении действующего вещества - соли четвертичного фосфония и вазелиновой основы 1:2000).

Клинические проявления всех видов маститов обусловлены экзогенными и эндогенными инфекционными факторами [Данилевская Н.В., Коробов А.В., Старченков С.В., Щербаков Г.Г. Справочник ветеринарного терапевта. 4-е изд., СПб.: Лань, 2005, - 384 с.]. Заболевание сопровождается покраснением, болезненностью (застойными явлениями) и отечностью в области сосков и вымени животных. У больных дойных животных молоко выдаивается с большим трудом, животное к себе не подпускает - брыкается. Выдоенное молоко в зависимости от вида мастита водянистое, содержит хлопья и кровянистые сгустки. Проба маститным тестом [Уша Б.В., Фельдштейн М.А. Клиническое обследование животных. - М.: Агропромиздат, 1986. - 303 с.] показывает наличие мастита (по наличию хлопьев и слизи в пробе молока при соединении с реактивом). Заболевание отелочных коров острым маститом в тяжелом случае может привести к летальному исходу как взрослого животного, так и приплода.

Повышение эффективности лечения маститов у коров и других дойных сельскохозяйственных животных является задачей, важной для обеспечения высокой продуктивности дойных животных и качества молока [Васильев, В.В. Экономический ущерб от молока при маститах у коров // Ветеринария. - 2008. - № 1. - С.32-34]. Поэтому разработка нового отечественного лекарственного средства для лечения и профилактики всех видов мастита, воздействующих на различные звенья патологического процесса, сочетающего в себе одновременно антибактериальное, антимикотическое и антиоксидантное действие, является актуальной задачей как ветеринарии, так и фармации, позволяет эффективно проводить лечение животных на разных стадиях патологического процесса, вызванного воздействием патогенной микрофлоры, приводящей к покраснению, отечности и болезненности при доении, к непригодности молока для кормления молодняка и в крайне тяжелом случае острого мастита к летальному исходу.

Известно, что для лечения клинического мастита коров предложено использование антимикробных лекарственных средств, которые вводят интрацистернально (внутривыменно) [Сиренко, С.В. Лечение коров больных маститом / Сиренко С.В., Сафронов С.Л. // Аграрный вестник Урала. - 2006. - № 1. - С.55-56; Соколов В.Д. Клиническая фармакологияю М.: Колос. - 2002. - 227 с.].

Известен способ лечения маститов у коров лекарственным препаратом Дифумаст, содержащим в своем составе диоксидин (2%), фурацилин (0,04%), воск пчелиный и масло вазелиновое. По внешнему виду это маслянистая суспензия желтого цвета, которую выпускают во флаконах из нейтрального стекла по 100 мл (20 доз) и шприцах по 10 мл (2 дозы). Вводят интрацистернально: при субклиническом, серозном и катаральном мастите по 5 мл 1 раз в сутки в течение 3-4 дней; при гнойно-катаральном мастите производят первое введение 10 мл, далее по 5 мл с интервалом 24 часа в течение 5-6 дней. Перед введением препарата из больной четверти вымени секрет выдаивают, а сосок дезинфицируют 70% этиловым спиртом. Препарат перед применением подогревают до 36-39°C и взбалтывают, затем набирают из флакона стерильным шприцем и вводят через сосок пораженной четверти вымени при помощи катетера [http://www.veterinar.ru/pharmacy/52/11/].

Недостатком данного способа являются:

- дороговизна, обусловленная высоким содержанием лекарственных средств в препарате;

- необходимость специальных устройств для введения (шприцев) и предварительной обработки соска этиловым спиртом;

- сложность внутривымянного (интрацестирнального) введения, которое осуществляется специалистами-ветеринарами и является очень болезненной процедурой для животного;

- длительный срок лечения - до 1-2-х месяцев [Червяков Д.К. Лекарственные средства в ветеринарии. М.: Колос, 1977].

Известен способ лечения мастита у коров [патент RU 2230571, опубликован 20.06.2004]. Способ включает внутрицистернальное введение стафилококкового и стрептококкового анатоксинов в смеси с 25% раствором анальгина в дозе соответственно 2 мл и 4 мл. Способ высокоэффективен при лечении маститов у коров только кокковой этиологии.

Недостатками данного способа является;

- узкий спектр антимикробной активности (только в отношении кокковых бактерий), тогда как причиной маститов являются не только стрептококки и стафилококки, но и бактерии группы кишечной палочки, псевдомонады, коринебактерии, микоплазмы, грибы рода Кандида, нокардии и др., а также возбудители специфических инфекций [Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров. Минсельхозпрод России, Департамент ветеринарии, № 13-5-2/1948, 30.03.2000 г. http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/371.html];

- дороговизна вследствие высокого содержания анальгина в лекарственном препарате;

- сложность и болезненность введения, требующая специальных устройств и участия ветеринарных специалистов.

Наиболее близким (прототипом) к заявляемому средству является препарат для лечения маститов у животных [патент RU 2200546, опубликован 20.03.2003]. Препарат в форме мази содержит компоненты при следующем соотношении, мас.%: колларгол 1,5-2,0, салициловая кислота 1,0-1,5, тримекаин 0,45-0,55, хемофарм или левамизол 0,03-0,5, углекислотный экстракт ромашки аптечной 2,0-2,5, сок чистотела большого 1,5-2,0, димексид 29,0-33,0, ланолин безводный 46,9-47,65, вода дистиллированная - остальное.

Недостатком указанного препарата являются:

- многоингредиентность;

- высокая стоимость,

- риск развития побочных реакций на компоненты препарата (левамизол может вызывать появление возбуждения, усиление саливации, учащение дефекации и мочеиспускания, атаксию [http://www.vetlek.ru/directions/?id=223], ланолин может оказывать аллергизирующее и сенсибилизирующее действие [Технология лекарственных форм: Учебник в 2 томах. Том 1 / Т.С. Кондратьева, Л.А. Иванова, Ю.И. Зеликсон и др.; под ред. Т.С. Кондратьевой. - М.: Медицина, 1991. - С.285]. При смешивании с солями тяжелых металлов (в данном примере - с серебром, содержащимся в препарате «колларгол») ланолин омыляется и образующиеся металлические мыла повышают токсичность мазей [Справочник фармацевта / Под ред. А.И. Тенцовой. - М.: Медицина, 1981. - С.14]).

Таким образом, для применяемых лекарственных препаратов (в том числе и прототипа), как правило, характерны:

- дороговизна;

- многоингредиентность;

- болезненность внутрицистернального введения;

- необходимость специальных устройств для введения (шприцев) и наличие специалиста;

- ограниченный спектр активности в отношении паразитарной и патогенной микрофлоры;

- длительный срок лечения;

- токсичность.

Следовательно, создание новых эффективных и простых в использовании отечественных препаратов для лечения маститов у коров и других сельскохозяйственных и домашних животных является актуальным.

Анализ уровня техники, проведенный заявителем, показал, что структурных аналогов предлагаемого фармацевтического средства для лечения маститов на основе четвертичной соли фосфония из выявленного уровня техники на дату подачи заявки не существует.

Однако известны их антибактериальные, противогрибковые, противомикробные и антиоксидантные свойства как таковые [Galkina I.V. Synthesis and antibacterial activities of phosphonium salts on basis of triphenylphosphine and 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl bromide / I.V. Galkina, Y.V. Bakhtiarova, V.V. Andriashin, V.I. Galkin, R.A. Cherkasov // Phosphoms, Sulfur, and Silicon and Related Elements. - 2013. - V. 188. N 1. - P.97-101. DOI: 10.1080/10426507.2012.740694.], при этом из исследованного уровня техники не выявлены специфические свойства этих соединений, показывающие их эффективность в отношении возможности лечения животных, больных маститом, вызванным воздействием патогенной микрофлоры - экзогенными или эндогенными инфекционными факторами.

Задачей заявленного технического решения является разработка нового, неизвестного из уровня техники поколения противомаститных мазей средства, преимущественно для ветеринарии, характеризующихся:

- простой технологией изготовления (состоит из двух ингредиентов), и как следствие обладающего низкой себестоимостью в производстве;

- более низкой стоимостью (недорогие ингредиенты и производство);

- меньшей болезненностью и травматичностью для животных;

- низкими лечебными дозами (0,05% действующего вещества - четвертичной соли фосфония);

- простотой применения (не требуются специальные приспособления и специалисты);

- антибактериальными, антимикотическими и антиоксидантными свойствами в отношении широкого спектра патогенной и условно-патогенной микрофлоры;

- коротким сроком излечения животных;

- относительно низкой токсичностью.

Сущность заявленного технического решения заключается в создании фармацевтической композиции - средства для лечения и профилактики субклинического, клинического, острого и хронического мастита в ветеринарии в виде мази, включающей действующее вещество и фармацевтически приемлемый носитель, характеризующейся тем, что действующим веществом является трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромид формулы I в качестве активного компонента, а фармацевтически приемлемым носителем - вазелин при их соотношении 1:2000.

Данная фармацевтическая композиция обладает высокой бактерицидной, антимикотической и антиоксидантной активностью при низких концентрациях и может найти применение в области ветеринарии и медицины.

Поставленная задача решается созданием противовоспалительного средства для профилактики и лечения субклинического, клинического и острого мастита в виде вазелиновой мази, состоящей из соли трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромида формулы I в фармацевтически приемлемом носителе:

Для целей синтеза заявленного противовоспалительного средства заявителем использован усовершенствованный способ получения соли фосфония формулы I, состоящий из двух стадий, который был частично воспроизведен по известной из литературы методике, описанной в [Stames W.H., Lauff J.J. Reactions of a Quinone Methide with Tri-n-butylphosphosphine. J. Org. Chem.Vol.35, N6, 1970. - P.1978-1986].

Следует отметить, что в работах американских авторов не изучались антибактериальные, антимикотические и антиоксидантные свойства этих соединений, а исследовались лишь их свойства для целей применения в качестве сжигателей жира для снижения веса, при этом следует отметить, что их опыты оказались отрицательными.

Далее приводится способ синтеза заявленного противовоспалительного средства.

Первой стадией синтеза соединения формулы I явилось бромирование 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола (ионол) в четыреххлористом углероде, приводящее к количественному выходу 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилбромида в виде желтого кристаллического продукта с температурой плавления 55-56°C.

Второй стадией получения продукта формулы I была кватернизация трифенилфосфина синтезированным бензилбромидом.

Реакция кватернизации проводилась в ацетонитриле после отгонки большей части (2/3) растворителя, продукт формулы I осаждался эфиром. Получен бесцветный мелкокристаллический порошок с высокой температурой плавления, в ³¹Р ЯМР спектрах которого фиксируется лишь один сигнал ядра фосфора в районе 23,47 м.д. поля.

Исходный 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (торговые марки «ионол», «агидол-1», «алкофен») является дешевым многотоннажным широко известным препаратом, применяется в качестве антиоксиданта в производстве пищевых продуктов (пищевая добавка Е-321), смазочных масел, пластмасс (производится технический «ионол» ГОСТ 10894-76). Благодаря возможности нейтрализовывать свободные радикалы и прерывать цепные реакции с участием свободных радикалов 5%-ный линимент «Дибунола» широко применялся в качестве наружного противоожогового и противовоспалительного средства. «Дибунол» также успешно применялся для лечения некоторых видов рака, лучевых и трофических поражений кожи и слизистых оболочек [В.В. Ершов, Г.А. Никифоров, А.А. Володькин. «Пространственно-затрудненные фенолы». М.: Химия, 1972. 352 с.; Эмануэль Н.М. «Кинетика экспериментальных опухолевых процессов». М.: Наука, 1977; Машковский М.Д. Лекарственные средства. Издание 16. М.: Новая волна, 2010. С.721]. Трифенилфосфин, а также бром - относительно дешевые доступные отечественные коммерческие препараты.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами конкретного осуществления, но не исчерпывается ими. В примере 1 приведен способ синтеза основного действующего вещества мази - соли фосфония формулы I, в примере 2 приведен способ получения вазелиновой мази, в примере 3 приведены способы и методы определения острой токсичности и раздражающего действия четвертичной соли фосфония - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфония бромида, в примере 4 приведен способ лечения мастита у коров, в примере 5 проведено изучение биологической активности соли фосфония формулы I, изучено антимикробное (антибактериальное и антимикотическое) и антиоксидантное действие.

Пример 1

Этап 1.

Синтез 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилбромида.

К раствору 2.20 г (0.01 моль) 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола в 20 мл четыреххлористого углерода прибавляют по каплям раствор 1.60 г (0.01 моль) брома в 20 мл четыреххлористого углерода с такой скоростью, чтобы он обесцвечивался по мере прибавления. После окончания реакции смесь кипятят с обратным холодильником в течение часа, растворитель удаляли в вакууме. Выпавший маслообразный продукт кристаллизуется при замораживании. Выход 2.75 г (92%). Т.пл. 54-56°C.

Элементный анализ C₁₅ H₂₃BrO. Найдено, %: С 60.54; Н 8.01. Вычислено, %: С 60.21; Н 7.75.

Этап 2.

Синтез трифенил-(3,5-ди-трет.-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромида формулы I.

К 0.299 г (0.001 моль) 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил бромида в 5 мл ацетонитрила добавляют раствор 0.262 г (0.001 моль) трифенилфосфина в 5 мл ацетонитрила. Реакционную смесь оставляют на 10 минут. Растворитель удаляют в вакууме на 2/3, после чего продукт осаждают эфиром. Выпавший осадок продукта I отфильтровывают и промывают небольшим количеством эфира. Выход 0.533 г (95%). Т.пл. 225°C (разл.), р³¹ м.д. 23.47.

Элементный анализ C₃₃H₃₈OBrP. Найдено, %: С 70.70; Н 7.00; Р 5.62. Вычислено, %: С 70.58; Н 6.82; Р 5.52.

Пример 2

Способ получения вазелиновой мази.

Все работы проводят в стерильных условиях. В фарфоровую ступку отвешивают 1 г соли - трифенил-(3,5-дитретбутил-4-гидроксибензил)фосфония бромид формулы (I), растирают и смешивают с 100 г вазелина до получения однородной массы (концентрата). В емкость маземешалки отвешивают 1900 г вазелина, нагревают до 40°C, перемешивают и постепенно, небольшими порциями при включенной мешалке добавляют из ступки концентрат. Мазь перемешивают в течение 20 минут и фасуют в стерильные стеклянные банки.

Заключение. Разработан состав и технология изготовления средства для профилактики и лечения острого мастита у коров и других сельскохозяйственных и домашних животных, содержащего активнодействующее вещество формулы I и вазелин. Преимуществами предлагаемой фармацевтической композиции в форме мази является то, что она проста в изготовлении, применении и обладает терапевтической активностью при низкой концентрации (0,05%), что делает ее перспективным лекарственным средством в ветеринарии для лечения мастита.

Пример 3

Определение острой токсичности и раздражающего действия четвертичной соли фосфония - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфония бромида.

Заявленное техническое решение было исследовано посредством проведения экспериментов с получением результатов, соответствующих поставленным целям (задачам) по разработке нового поколения противомаститной вазелиновой мази на основе соли четвертичного фосфония с низкими лечебными дозами.

Метод определения токсичности

Работа по изучению острой токсичности проводилась на базе кафедры паразитологии и радиобиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана в сентябре 2011 года. В опыте использовались 70 белых мышей, самцов и самок, массой тела 18-21 г. Соль фосфония формулы (I) в виде водной суспензии вводили в желудок однократно с помощью зонда. Лабораторные животные, учитывая пол, возраст, массу тела, были разделены на 7 групп: 6 опытных и одну контрольную (по 10 голов в каждой). Мышам опытных групп вводили суспензию соли в возрастающих дозах 50, 100, 150, 200, 250 и 300 мг/кг массы тела по действующему веществу (ДВ) соответственно. Мышам контрольной группы в желудок вводили дистиллированную воду. За состоянием здоровья лабораторных животных наблюдали в течение 14 дней после введения, учитывая внешний вид, подвижность, прием корма. Случаи гибели регистрировали, павших животных вскрывали. Результаты приведены в таблице 1.

Однократное пероральное введение препарата в 1 группе мышей в дозе 50 мг/кг массы тела по действующему веществу не вызвало изменений в поведении и общем состоянии животных. До конца эксперимента не было отмечено падежа животных. Эта доза была определена как максимально переносимая. Во 2 группе, в которой вводили 100 мг/кг массы тела, наблюдалось угнетение двигательной активности и аппетита животных, которое продолжалось до 5 дней. Три из десяти мышей пали на вторые и третьи сутки. В группе 3 также наблюдалось угнетение двигательной активности и аппетита животных. До конца эксперимента погибли 4 из 10 мышей. В группе 4 произошел падеж 7 из 10 мышей в период с первых по седьмые сутки после введения. В группе 5 наблюдалось значительное ухудшение общего состояния животных, уменьшение двигательной активности и потребления корма. 9 из 10 мышей пали в течение первых пяти суток. В группе 6, в которой вводили препарат в дозе 300 мг/кг массы тела, наблюдался кратковременный период двигательной активности, который затем сменялся периодом глубокого угнетения и отказом от корма. Все мыши погибли в течение первых и вторых суток после введения. При вскрытии у всех животных 6 группы отмечено вздутие желудочно-кишечного тракта газами на всем протяжении, застой содержимого в желудке, венозный застой в сосудах брюшной полости.

Таблица 1
Результаты изучения острой токсичности соли - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфония бромида формулы I на белых мышах
№ группы	Доза препарата, мг/кг	Количество животных в группе на начало опыта	Пало животных (голов)	Выжило животных (голов)	Летальность, %
1	50	10	0	10	0
2	100	10	3	7	30
3	150	10	4	6	40
4	200	10	7	3	70
5	250	10	9	1	90
6	300	10	10	0	100

Расчет среднесмертельной дозы произведен по методу Кербера [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.], с использованием формулы:

LD₅₀ =LD₁₀₀-( (Z×D))/m, где

D - интервал между каждыми двумя смежными дозами;

Z - среднее арифметическое число животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция под влиянием каждых двух смежных доз;

m - число животных в каждой группе.

При пероральном введении LD ₅₀ препарата формулы I составила 160 мг/кг массы тела по действующему веществу.

Таким образом, установлено, что соль фосфония формулы I при пероральном введении, в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 [Заугольников С.Д., Кочанов М.М., Лойт А.О., Ставчанский И.И. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. Экспериментальные методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.; Медицина, 1978. - 184 с.] по своим токсикологическим характеристикам относится к III классу опасности - веществам, умеренно опасным для теплокровных животных.

Изучение раздражающего действия соли фосфония формулы (I) проводили на пяти кроликах в возрасте 12 месяцев, одного пола, и примерно одинаковой массы тела (2,5-3 кг). Препарат в виде водной суспензии с помощью глазной пипетки вводили под правое веко по одной капле.

Для контроля под левое веко аналогично вводили дистиллированную воду. За животными наблюдали в течение часа. За это время не было выявлено покраснения конъюнктивы глаз ни у одного из кроликов. Через 12 и 24 часа не было замечено видимых различий левых и правых глаз у опытных кроликов. Это позволило сделать вывод что лекарственная субстанция суппозиториев, включающая соль формулы (I), не обладает выраженным раздражающим действием.

Пример 4

Способ лечения острого мастита у коров.

Исследования проводились в ООО АПК «Чистое Поле» т.о. а/ «Юлдуз» Чистопольского района Республики Татарстан на 5 коровах черно-пестрой породы в возрасте от 3 до 8 лет.

Содержание в хозяйстве привязное, в дневное время коровы выпускаются для прогулки на карду. Осеменение искусственное, сперму поставляют из плем. хозяйства «Чистопольское». По острым инфекционным заболеваниям хозяйство считается благополучным.

В исследования были взяты коровы, больные клиническим маститом. Болезнь проявлялась покраснением и отечностью вымени, затрудненным сдаиванием молока, в котором визуализировались кровяные сгустки и свернутое молоко в виде хлопьев. Температура тела колебалась от субфебрильной до 39-40°C. Пульс, дыхание учащены. Начало болезни, в основном, было связано с болезненным доением, которое осуществлялось вручную. Испытание эффективности мази - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфония бромида формулы (I) и вазелина (1:2000) проводили при лечении клинических форм мастита у 5 коров.

Мазь втирали в вымя 2 раза в день после доения в течение 5 минут, в сочетании с массажем вымени. Приводятся результаты исследования:

День первый: Вымя воспаленное, красное, болезненное, при прикосновении к нему коровы лягаются, не подпускают к себе, сосок отечный. Молоко выдаивается с большим трудом. Выдоенное молоко в зависимости от вида мастита водянистое; содержит хлопья или/и кровянистые сгустки. Проведена проба маститным тестом, выявлено наличие мастита (по наличию хлопьев и слизи в пробе молока при соединении с реактивом) [Уша Б.В., Фельдштейн М.А. Клиническое обследование животных. - М.: Агропромиздат, 1986. - 303 с.].

День второй: Вымя по-прежнему воспаленное, красное, сосок отечен, болезненность при дотрагивании. Молоко выдаивается с трудом, первые струи содержат небольшое количество хлопьев.

День третий: Вымя нормального размера, краснота практически отсутствует, сосок менее отечен, болезненность незначительная. Животное подпускает к себе. Молоко выдаивается с некоторым затруднением, молоко содержит небольшое количество хлопьев. Проба с маститным тестом показывает наличие мастита; проба молока по-прежнему слизистая.

День четвертый: Вымя нормальных размеров, безболезненное, сосок нормальных размеров, гиперемия отсутствует. Молоко выдаивается легко и свободно. Выдоенное молоко из пораженной четверти ничем не отличается от молока из здоровых четвертей. Проба с маститным тестом показывает наличие мастита; проба молока, содержит небольшое количество слизи.

День пятый: Вымя нормальных размеров, безболезненное, местная температура не повышена, сосок нормальных размеров. Молоко выдаивается легко, выдоенное молоко, по внешнему виду и консистенции ничем не отличается от молока из здоровых четвертей. Провели пробу с маститным тестом - тест на мастит отрицательный.

Заключение. Полное клиническое выздоровление происходит в течение 5 дней. Расход фармацевтической композиции, состоящей из соли фосфония-трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфония бромида формулы (I) и вазелина (1:2000), - 100 г мази на лечение 1 коровы.

Пример 5

Исследование биологической активности: бактерицидной, фунгицидной и антиоксидантной.

Фунгицидную и бактерицидную активность соединения формулы I исследовали на тест-культурах патогенной и условно-патогенной микрофлоры человека. В работе использовали музейные штаммы кафедры микробиологии Казанской государственной медицинской академии: Escherichia coli, Salmonella paratyphi В, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans. [Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии. - М.: Медицина, 1971. - 245 с.]. Для оценки активности непосредственно перед исследованием готовили 0.01% растворы исследуемого соединения формулы I в спирте. Суточные культуры музейных штаммов стандартизовали до оптической плотности 0.5 по МакФарланду (1,5×10⁸ КОЕ/мл). Чашки Петри с питательной средой Сабуро (для Candida albicans) и Мюллера-Хинтона для всех остальных микроорганизмов засевали стандартизованными взвесями тест-культур, используя тампон. Через 5 минут на поверхность агара бактериологической петлей наносили каплю исследуемого вещества. В одну чашку помещали 5 химических соединений, в центр чашки наносили растворитель (для контроля возможного антибактериального эффекта) или стандартное лекарственное вещество сравнения. Через 24-48 часов при инкубации 37°C оценивали величину зоны задержки роста микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антимикотическая и бактерицидная активность соли фосфония формулы I (1% растворы в этаноле)
Соединение	Микроорганизмы, зона ингибирования роста, (диаметр, мм)
	Staphylococcus aureus	Escherichia coli	Pseudomonas aeruginosa	Salmonella p.B	Candida albicans
	43	18	16	16	46
Chlorhexidine	19	15	13	14	16.5
Penicillin	23	-	8	10	-
Griseofulvin	-	-	-	-	19

Антиоксидантную активность определяли методом кулонометрического титрования электрогенерированным бромом [Ziyatdinova G.K., Budnikov G.K., Pogorel'tzev V.I., Ganeev T.S. The application of coulometry for total antioxidant capacity determination of human blood. Talanta. 2006. V.68. No. 3. P.800-805]. Электрогенерацию брома осуществляли на потенциометре П-5827М при постоянной силе тока 5,0 мА из 0,2 М KBr в H₂SO₄. Конец титрования определяли амперометрически в ячейке с двумя поляризованными платиновыми электродами ( Е=300 мВ). Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Антиоксидантная емкость соли фосфония формулы I
№	Соединение (растворы в этаноле)	АОА, кл/мл	Sr
I		286±6	1.7
Контроль 1	Аскорбиновая кислота	185±3	2.2
Контроль 2	-токоферол	195±4	1.4

Таким образом, предложено эффективное средство для лечения мастита в ветеринарии на основе соли фосфония и соответствующий способ лечения и профилактики субклинического, клинического и острого мастита у коров посредством втирания мази в вымя с последующим массажем на основе соли фосфония, обладающей широким спектром антибактериального, антимикотического и антиоксидантного действия, что обуславливает излечение животных на пятый день. Преимуществами заявляемого соединения формулы I является и то, что оно обладает одновременной высокой бактерицидной и антимикотической активностью а также высокой антиоксидантной активностью (что не является характерным для антибиотиков), данный эффект проявляется при низких концентрациях на фоне относительно низкой токсичности предлагаемого соединения, оно термически стойко (по данным метода термогравиметрии и сканирующей калориметрии) до 225°C (I) и не разрушаются под действием мыльного раствора, что делает его перспективным лекарственным, противовоспалительным и дезинфицирующим средством в ветеринарии и медицине.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, характеризующиеся указанными признаками, приводящими к реализации заявленных технических результатов заявленного технического решения, которыми является создание средства в виде мази для лечения мастита в ветеринарии, обладающего как бактерицидной, фунгицидной, так и антиоксидантной активностью, при низких дозах действующего вещества (0,05%) на фоне относительно низкой токсичности.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень» предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалистов в данной области техники вследствие того, что заявленное техническое решение обеспечивает практическую реализацию объективно существующих в науке и технике противоречий, не разрешимых посредством обычного проектирования, а именно из исследованного уровня техники известно получение солей фосфония для создания препаратов - сжигателей жира для похудания, и не изучались антибактериальные, антимикотические и антиоксидантные свойства этих соединений, а полученное соединение формулы I по заявленному техническому решению, обладающее антибактериальным, антимикотическим и антиоксидантным свойствами, отличается высокой 9эффективностью при лечении и профилактике субклинического, клинического, острого и хронического мастита у коров и других сельскохозяйственных и домашних животных, таким образом, можно сделать вывод о том, что полученные результаты не являются очевидными для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. может быть реализовано на любом отечественном специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных материалов и промышленных технологий.