рекомбинантная плазмида phistevtsib0821, трансформированный ею штамм escherichia coli rosetta(de3)/phistevtsib0821 и способ получения рекомбинантной пролидазы tsib_0821
Классы МПК: | C12N15/09 метод рекомбинантных ДНК |
Автор(ы): | Попов Владимир Олегович (RU), Фатеева Татьяна Владимировна (RU), Юдкина Ольга Владимировна (RU), Корженевский Дмитрий Андреевич (RU), Ракитина Татьяна Владимировна (RU), Черкашина Анна Сергеевна (RU), Слуцкая Эльвира Семеновна (RU), Липкин Алексей Валерьевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-10-16 публикация патента:
10.03.2014 |
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pHisTevTSIB0821 для экспрессии в клетках Escherichia coli пролидазы TSIB_0821 из археи Thermococcus sibiricus. Заявленная плазмида включает NdeI/SalI-фрагмент плазмиды pET-22b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК размером 1196 пар оснований, содержащий слитый ген, состоящий из следующих структурных элементов: нуклеотидная последовательность, кодирующая шестигистидиновый таг, нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт узнавания/расщепления протеазы TEV, и нуклеотидная последовательность гена TSIB_0821, соединенных так, чтобы при их биосинтезе в клетках Е. coli сохранялась непрерывная рамка считывания. Получен штамм Е. coli Rosetta(DE3), трансформированный указанной плазмидой, - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность пролидазы TSIB_0821 слитую на N-конце с шестигистидиновым тагом и сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV. Разработан способ выращивания и индукции штамма-продуцента и метод выделения и очистки из полученной биомассы функционально-активной рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, включающий следующие технологические процессы: две металлоаффинные хроматографии, гель-фильтрацию, обработку TEV протеазой, диализ, концентрирование. Изобретение позволяет получить рекомбинантную пролидазу, максимально приближенную по структуре к ее природному аналогу с высоким и стабильным выходом, уровнем очистки и функциональной активности. 3 н.п. ф-лы, 3 пр.
Формула изобретения
1. Плазмида pHisTevTSIB0821, определяющая синтез рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, характеризующаяся наличием следующих фрагментов: NdeI/SalI-фрагмента, плазмиды pET-22b(+) (Novagen) размером 5365 п.о., NdeI/NcoI-фрагмента, кодирующего шестигистидиновый таг и сайт узнавания/расщепления протеазы TEV (Seq. 1), и NcoI/SalI-фрагмента, содержащего структурную часть гена TSIB_0821, соответствующую открытой рамке считывания 749419-750516 полного геномного сиквенса археи Thermococcus sibiricus MM 739 (gi:242397997), адаптированную по 5'- и 3'-концам сайтами рестриказ Ncol и Sail (Seq. 2), соединенных так, чтобы при их биосинтезе в клетках E.coli сохранялась непрерывная рамка считывания.
2. Штамм Е. coli Rosetta(DE3), трансформированный плазмидой pHisTevTSIB0821 по п.1, - индуцибельный продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность пролидазы TSIB_0821, слитую на N-конце с шестигистидиновым тагом и сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV.
3. Способ получения рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, характеризующийся тем, что после добавления индуктора экспрессии штамм-продуцент по п.2 инкубируют в жидкой питательной среде LB в течение 20 ч при 18°С, затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буферном растворе, экстракт центрифугируют, а надосадочную жидкость помещают на колонку с металлоаффинной смолой, с которой после удаления продуктов неспецифического связывания элюируют целевой белок, который инкубируют с протеазой TEV, которую вместе c отщепленной ею аминокислотной последовательностью удаляют повторной металлохелатной хроматографией, далее целевой продукт концентрируют и финально доочищают гель-фильтрацией.
Описание изобретения к патенту
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается способа получения функционально активной рекомбинантной пролидазы термостабильной археи Thermococcus sibiricus (TSIB_0821), а также рекомбинантной плазмиды и трансформированного ею штамма Escherichia coli для наработки рекомбинантной пролидазы TSIB_0821. Изобретение позволяет производить функционально активную рекомбинантную пролидазу для использования в биотехнологических процессах, в том числе проводимых при повышенных температурах и рН, а также как модель для изучения молекулярных механизмов термоустойчивости.
Уровень техники
Пролидаза (пролинспецифическая дипептидаза, имидодипептидаза, Е.С. 3.4.13.9., далее именуемая пролидаза) - фермент, гидролизующий дипептиды, в которых пролин находится в С-концевой позиции (Хаа-Рго или X-Pro) [Cunningham, D. & O'connor, В. Proline specific peptidases // Biochim Biophys Acta. -1997. -Vol. 1343. -P. 160-186. и Lowther, W. & Matthews, B. Metalloaminopeptidases: common functional themes in disparate structural surroundings // Chem Rev. -2002. -Vol. 102. - P. 4581-4608]. Пролидазы встречаются в эукариотах, бактериях и археях и являются исключительно перспективными ферментами для использования в медицине и биотехнологии.
У млекопитающих пролидазы участвуют на заключительных этапах катаболизма при расщеплении молекул, богатых пролином, в первую очередь коллагена [Surazynski, A., Miltyk, W., Palka, J. & Phang, J. M. Prolidase-dependent regulation of collagen biosynthesis // Amino Acids. -2008. -Vol. 35. -P. 731-738]. У человека дефицит пролидаз вызывает развитие ряда заболеваний соединительных тканей [Viglio, S., Annovazzi, L., Conti, В., Genta, I., Perugini, P., Zanone, C., Casado, В., Cetta, G. & ladarola, P. The role of emerging techniques in the investigation ofprolidase deficiency: from diagnosis to,the development of a possible therapeutical approach // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. -2006. -Vol. 832. -P. 1-8], для борьбы с которыми в качестве заместительной терапии используют рекомбинантные ферменты [Патент № W002067967. -2002, Патент № KR20050090120. - 2005, Патент № US2006134088. -2006, Патент № W02007110767. -2007., Colonna C., Conti, B Perugini, P., Pavanetto, F., Modena, Т., Dorati, R., ladarola, P. & Genta, I. Ex vivo evaluation ofprolidase loaded chitosan nanoparticles for the enzyme replacement therapy // Eur J Pharm. Biopharm. -2008. -Vol. 70. -P. 58-65. и Colonna, С., Conti, В., Perugini, P., Pavanetto, F., Modena, Т., Dorati, R., ladarola, P. & Genta, I. Site-directed PEGylation as successful approach to improve the enzyme replacement in the case ofprolidase // Int J Pharm. -2008. -Vol. 358. -P. 230-237]. В то же время повышенный уровень пролидазной активности является диагностическим маркером ряда онкологических заболеваний [Kama, E., Surazynski, А. & Palka, J. Collagen metabolism disturbances are accompanied by an increase in prolidase activity in lung carcinoma planoepitheliale // Int J Exp Pathol. -2000. -Vol. 81. -P. 341-347], для таргетной терапии которых создают пролинсодержащие инактивированные формы препаратов, которые превращаются в активные противораковые лекарства после расщепления пролидазами [Патент W09745117. -1997, Mittal, S, Song, X., Vig, В. S. & Amidon, G. L. Proline prodrug of melphalan targeted to prolidase, a prodrug activating enzyme overexpressed in melanoma // Pharm Res. -2007. -Vol. 24.-P.1290-1298].
Пролидазы бактерий и архей также участвуют в деградации белков и пептидов, регулируя рециклинг пролина [Gonzales, Т. & Robert-Baudouy, J. Bacterial aminopeptidases:
properties and functions // FEMS Microbiol. Rev. -1996. -Vol. 18. -P. 319-344. и Ghosh, M., Grunden, A. M., Dunn, D. M., Weiss, R. & Adams, M. W. Characterization of native and recombinant forms of an unusual cobalt-dependent proline dipeptidase (prolidase) from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // J Bacteriol. -1998. -Vol. 180. -P. 4781-4789]. Они используются для удаления горечи при ферментации сыров и в других отраслях пищевой промышленности [Courtin, P., Nardi, M., Wegmann, U, Joutsjoki, V., Ogier, J. C., Gripon, J. C, Palva, A., Henrich, B. & Monnet, V. Accelerating cheese proteolysis by enriching Lactococcus lactis proteolytic system with lactobacilli peptidases // International Dairy Journal. -2002. -P. 447-454, Патент № JP2008I78393. -2008, Патент № US2010317736. -2010.J. Кроме того, большинство изученных на сегодня пролидаз, в первую очередь пролидазы из термофильных архей, активны в отношении токсических фосфорорганических молекул, входящих в состав нервно-паралитических газов и пестицидов [Vyas, N.K, Nickitenko, A., Rastogi, V. К., Shah, S. S. & Quiocho, F. A. Structural insights into the dual activities of the nerve agent degrading organophosphate anhydrolase/prolidase // Biochemistry. -2010. -Vol. 49. -P. 547-559. и Theriot, C.M., Tove, S. R. & Grunden, A. M. (eds.) Biotechnological Applications of Recombinant Microbial Prolidases // New York Academic Press. -2009], поэтому высокая исследовательская активность наблюдается в области разработки технологий, нацеленных на использование пролидаз в качестве биосенсоров для детекции токсических веществ данного класса [Simonian, A. L., Grimsley, J. К., Flounders, A. W, Shoeniger, J. S., Cheng, Т.-С., DeFrank, J. J. & Wild, J. R. Enzyme-based biosensor for the direct detection of fluorine-containing organophosphates // Analytica Chimica Acta. -2001. -P. 15-23], средств биодеконтаминации [Cheng, T.C. & DeFrank, J. J. (eds.) Hydrolysis of organophosphorus compounds by bacterial prolidases // Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. -2000] или компонентов антидотов [Petrikovics, I., Mcguinn, W. D., Sylvester, D., Yuzapavik, P., Jiang, J., Way, J. L., Papahadjopoulos, D., Hong, K., Yin, R., Cheng, T. C. & DeFrank, J. J. In vitro studies on sterically stabilized liposomes (SL) as enzyme carriers in organophosphorus (OP) antagonism // Drug Deliv. -2000. -Vol. 7. -P. 83-89].
На сегодняшний день охарактеризовано немногим более 10 пролидаз из различных организмов, которые перечислены в обзоре [R. Semcer and A. Grunden. Prolidase function in proline metabolism and its medical and biotechnological applications // J. Appl. Microbiol. -2012. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05310]. Перспективность поиска и всестороннего изучения новых ферментов данного класса, особенно из экстремофильных архей, а также клонирование соответствующих генов и получение рекомбинантных протеаз, в том числе с направленно-измененными методами генетической инженерии свойствами, подтверждается публикациями как в периодических научных журналах, так и в патентной литературе:
Патент № US6309868. Cloning of the prolyl-dipeptidyl-peptidase from Aspergillus oryzae.-2001.
Патент № US2003186420. Prolidase and its gene and method for producing prolidase. -2003.
Maher, M. J., Ghosh, M., Grunden, A. M., Menon, A. L., Adams, M. W., Freeman, H. C. & Guss, J. M. Structure of the prolidase from Pyrococcus furiosus // Biochemistry. -2004. -Vol. 43, -P. 2771-2783.
Патент № JP2004105091. Heat-resistant proline-containing dipeptidase. -2004. Du, X., Tove, S., Kast-Hutcheson, K. & Grunden, A. M. Characterization of the dinuclear
metal center of Pyrococcus furiosus prolidase by analysis of targeted mutants // FEBS Lett. -
2005. -Vol. 579. -P. 6140-6146.
Lupi, A., Delia Torie, S Campari, E., Tenni, R., Cetta, G, Rossi, A. & Forlino, A. Human recombinant prolidase from eukaryotic and prokaryotic sources. Expression, purification, characterization and long-term stability studies // FEBS J. -2006. -Vol. 273. -P. 5466-5478.
Патент № JP3819454. New proline dipeptidase and hydrolysis of protein and peptide using the proline dipeptidase. -2006.
Yang, S.I. & Tanaka, T. Characterization of recombinant prolidase from Lactococcus lactis changes in substrate specificity by metal cations, and allosteric behavior of the peptidase //
FEBS J. -2008. -Vol. 275. -P. 271-280.
Besio, R., Alleva, S., Forlino, A., Lupi, A., Meneghini, C., Minicozzi, V., Profumo, A., Stellato, F., Tenni, R. & Morante, S. Identifying the structure of the active sites of human recombinant prolidase // Eur Biophys J. -2010. -Vol. 39. -P. 935-945.
Theriot, C. M., Tove, S. R. & Grunden, A. M. Characterization of two proline dipeptidases (prolidases) from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii // Appi Microbiol Biotechnol. -2010. -Vol. 86. -P. 177-188.
Theriot, C. M., Du, X., Tove, S. R. & Grunden, A. M. Improving the catalytic activity of hyperthermophilic Pyrococcus prolidases for detoxification of organophosphorus nerve agents over a broad range of temperatures // Appi Microbiol Biotechnol, -2010. -Vol. 87. -P. 1715-1726.
Theriot, C. M., Semcer, R. L., Shah, S. S. & Grunden, A. M. Improving the Catalytic Activity of Hyperthermophilic Pyrococcus horikoshii Prolidase for Detoxification of Organophosphorus Nerve Agents over a Broad Range of Temperatures // Archaea. -2011. -Vol. 565127.
Приведенные выше работы демонстрируют, что для более полного использования биотехнологического потенциала пролидаз необходимо комбинировать две стратегии: во первых, изучать новые ферменты, во вторых, направленно оптимизировать свойства природных ферментов согласно требованиям технологического процесса. Особый интерес в этом плане представляют пролидазы из экстремофильных микроорганизмов, так как они обладают широким спектром уникальных свойств, а именно способны работать в экстремальных условиях: повышенная температура, кислый или щелочной рН, высокая ионная сила, присутствие высоких концентраций детергентов. Поэтому для поиска генов, кодирующих новые пролидазы, выбран геном гипертермофильной археи Thermococcus Sibiricus MM739, обитающей в гидротермальных источниках и подземных нефтяных резервуарах Западной Сибири при температуре от 40°С до 88°С. Анализ расшифрованного генома Т. Sibiricus показывает наличие в нем гена TSIB 0821 (GenBank accession number ACS89882.1), кодирующего белок, похожий на ранее изученную термофильную протеазу из Pyrococcus horikoshii OT3 (52% гомологии).
В качестве прототипа выбран способ получения пролидазы TSIB_0821, слитой на N-конце с последовательностью MRGSHHHHHHGS [Trofimov, A. A., Slutskaya, E. А., Polyakov, К. М., Dorovatovskiic, P. V., Gumerov, V. М., Popov, V. О. Influence of intermolecular contacts on the structure ofrecombinant prolidase from Thermococcus sibiricus // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. -2012]. Данный способ включает в себя амплификацию гена TSIB_0821 (GenBank accession number ACS89882.1) на матрице геномной ДНК Т. Sibiricus с помощью полимеразной цепной реакции, его клонирование в экспрессирующий вектор pQE80L (Qiagen), получение штамма Escherichia coli Rosetta-gami (DE3) (Novagen), трансформированного плазмидой pQE80L_TSIB0821, наращивание клеток штамма-продуцента, индукцию экспрессии и выделение из полученной биомассы рекомбинантного белка. Недостатком данного способа является невозможность удаления с N-конца рекомбинантной пролидазы TSIB_0821 аминокислотной последовательности шестигистидинового тага, которая, согласно данным рентгеноструктурного анализа слитого белка MRGSHHHHHHGS-TSIB_0821, активно участвует в формировании пространственной укладки полипептида, отрицательно влияя на его функциональную активность и устойчивость к механическим и температурным воздействиям, что делает рекомбинантную пролидазу TSIB_0821, полученную данным способом, непригодной для использования в биотехнологических процессах.
Раскрытие изобретения
Технической задачей и, соответственно, техническим результатом изобретения является разработка простого и экологически чистого способа получения функционально активной рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, максимально приближенной по структуре к ее природному аналогу.
Поставленная задача решается предлагаемым способом, предусматривающим конструирование плазмиды pHisTevTSIB0821, кодирующей синтез рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, слитой на N-конце с последовательностью шестигистидинового тага и сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV, создание на основе данной плазмиды штамма Е. coli Rosetta(DE3)/pHisTevTSIB0821 - продуцента рекомбинантной пролидазы TSIB_0821 в виде слитого белка и разработку способа выделения и очистки рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, обеспечивающего отделение N-концевой аминокислотной последовательности шестигистидинового тага от целевого полипептида.
Технический результат заявленного изобретения - получение рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, максимально приближенной по структуре к ее природному аналогу с высоким и стабильным выходом, уровнем очистки и функциональной активности.
Реализация технической задачи и получение технического результата обеспечено использованием следующей совокупности существенных признаков:
- плазмида pHisTevTSIB0821, определяющая синтез рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, характеризуется наличием следующих фрагментов: NdeI/SalI-фрагмента плазмиды pET-22b(+) (Novagen) размером 5365 п.о., NdeI/NcoI-фрагмента, кодирующего шестигистидиновый таг и сайт узнавания/расщепления протеазы TEV (Seq. 1), и NcoI/SalI-фрагмента, содержащего структурную часть гена TSIB_0821, соответствующую открытой рамке считывания 749419-750516 полного геномного сиквенса археи Thermococcus sibiricus MM 739 (gi:2423 97997), адаптированную по 5'- и 3'-концам сайтами рестриказ Ncol и Sail (Seq. 2), соединенных так, чтобы при их биосинтезе в клетках E.coli сохранялась непрерывная рамка считывания;
- штамм Е. coli Rosetta(DE3), трансформированный плазмидой pHisTevTSIB0821 по п.1 является индуцибельным продуцентом химерного белка, включающего аминокислотную последовательность пролидазы TSIB_0821, слитую на N-конце с шестигистидиновым тагом и сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV;
- способ получения рекомбинантной пролидазы TSIB_0821, характеризуется тем, что после добавления индуктора экспрессии штамм-продуцент по п.2 инкубируют в жидкой питательной среде LB в течение 20 ч при 18°С, затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буферном растворе, экстракт центрифугируют, а надосадочную жидкость помещают на колонку с металлоаффинной смолой, с которой, после удаления продуктов неспецифического связывания, элюируют целевой белок, который инкубируют с протеазой TEV, которую вместе отщепленной ею аминокислотной последовательностью удаляют повторной металлохелатной хроматографией, далее целевой продукт концентрируют и финально доочищают гель-фильтрацией.
Предложение поясняется следующим.
Рекомбинантная плазмида pHisTevTSIB0821 представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК размером 6561 п.о.
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta(DE3)/pHisTevTSIB0821 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
Клетки штамма образуют крупные круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 5 мм в диаметре, поверхность колоний гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается. Грамотрицательны, спор не образуют, капсулы не имеют. Колонии хорошо растут на простых питательных средах (LB). При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки.
Штамм Е. coli Rosetta(DE3)/pHisTevTSIB0821 видотипичен по своим биохимическим свойствам. Штамм не обладает желатиназной активностью, не ферментирует лизин, расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу до кислоты и газа. Имеет мутацию в гене lac, обеспечивающую контроль уровня экспрессии, а также трансляцию шести редких кодонов. Оптимальной для роста является температура 37°С, а для продукции TSIB_0821 - 20°С.
Устойчивость к антибиотикам
Клетки штамма характеризуются устойчивостью к хлорамфениколу (34 мкг/мл) и ампициллину (до 200 мкг/мл).
Патогенность и токсичность
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta(DE3)/ pHisTevTSIB0821 не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.
Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (25%) при -70°С.
Заявляемый способ получения рекомбинантной пролидазы TSIB_0821 заключается в культивировании клеток Е. coli штамма Rosetta(DE3)/pHisTevTSIB0821 в питательной среде LB, содержащей ампициллин и IPTG, отделении биомассы от культуральной жидкости, разрушении микробных клеток с последующим выделением целевого продукта из фракции растворимых клеточных белков с помощью следующих технологических процессов: две металлоаффинные хроматографии, гель-фильтрация, обработка TEV протеазой, диализ, концентрирование. Выход рекомбинантного белка в результате применения предлагаемого способа выделения и очистки составляет не менее 1 мг с 1 л культуры при чистоте более 97%.
Рекомбинантная пролидаза TSIB_0821, выделенная и очищенная заявленным способом, характеризуется следующими признаками: молекулярная масса 41 кДа;
оптимальные условия работы фермента: температура 85-100°С, рН 7.5-9.5, 1 мМ Мn2+ в инкубационной среде; удельная активность не менее 400 ед/мг белка, при условии проведения гидролиза при 90°С в реакционной смеси, содержащей 50 мМ MOPS, pH 8.2, 100 мМ NaCI, 1 мМ МnСl2, 5 мМ пептидный субстрат Met-Pro и 1 мкг фермента. Данные по физико-химической характеристике и определению ферментативной активности рекомбинантной пролидазы TSIB_0821 свидетельствуют о наличие у исследуемого полипептида дипептидил-пролидазной активности, присущей его природному аналогу. Рекомбинантная пролидаза TSIB_0821 может быть успешно использована в биотехнологических процессах, проводимых при повышенных температурах и pH, a также как модель для изучения молекулярных механизмов термоустойчивости.
Преимуществами заявляемого способа получения пролидазы TSIB 0821 являются:
- использование слитого гена, состоящего из следующих структурных элементов:
- нуклеотидная последовательность, кодирующая шестигистидиновый таг, нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт узнавания/расщепления протеазы TEV, и нуклеотидная последовательность гена TSIB_0821, соединенных так, чтобы при их биосинтезе в клетках E.coli сохранялась непрерывная рамка считывания, что позволяет после выделения слитого рекомбинантного белка методом металлоаффинной хроматографии удалять дополнительные аминокислотные последовательности с помощью сайт-специфической TEV протеазы;
- использование штамма-продуцента на основе штамма E.coli Rosetta(DE3), обеспечивающего трансляцию шести редких кодонов, что позволяет увеличить эффективность биосинтеза и получать полноразмерный рекомбинантный белок;
- использование минимального числа стадий хроматографической очистки, что позволяет получать чистый рекомбинантный белок за короткое время с минимальными потерями самого белка и его функциональной активности.
Осуществление изобретения
Способ получения функционально-активной пролидазы на основе использования гена TSIB_0821 термофильной археи Thermococcus sibiricus, слитого на N-конце с нуклеотидной последовательностью, кодирующей шестигистидиновый таг и сайт узнавания/расщепления протеазы TEV, иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды pHisTevTSIB0821.
Рекомбинантную плазмиду pHisTevTSIB0821, содержащую собранные в единую рамку считывания нуклеотидные последовательности, кодирующие шестигистидиновый , слитый с сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV? и структурный ген TSIB_0821, конструируют на основе коммерческой плазмиды pET-22b(+) (Novagen), в которой фрагмент NdeI/Ncol, кодирующий лидерный пептид ре1В, заменен на фрагмент NdeI/Ncol, кодирующий шестигистидиновый таг, слитый с сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV.
2 мкг плазмидной ДНК рЕТ-22Ь(+) обрабатывают рестриктазами Ndel и Sail (Fermentas) в рекомендуемом буфере в течение 1 часа, векторную часть плазмиды размером 5365 п.о. выделяют электрофоретически из 1% агарозного геля с помощью набора для выделения ДНК (Fermentas) в соответствии с рекомендациями производителя.
Фрагмент ДНК NdeI/Ncol, кодирующий шестигистидиновый таг, слитый с сайтом узнавания/расщепления протеазы TEV, получают путем 30 мин отжига при 75°С с последующим охлаждением во льду олигонуклеотидов NdeHisTev For и NcoHisTev_Rev, смешанных в эквимолярных количествах (100 pMol каждого):
NdeHisTev_For 5'-TATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCC
AACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGC-3'
NcoHisTev_Rev 5'-CATGGCGCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAA
TCGTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACA-3'
Фрагмент ДНК, содержащий полноразмерный структурный ген TSIB_0821, получают при помощи полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы плазмиды pQE80L_TSIB0821, принятой за прототип [Trofimov A.A. et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. -2012], и праймеров XaaP_For и XaaP_Rev, где XaaP_For - праймер, специфичный по отношению к 5'-концу структурной части гена TSIB_0821 и содержащий сайт рестриктазы Ncol, XaaP_Rev - обратный праймер, специфичный по отношению к 3'-концу структурной части гена TSIB_0821 и содержащий сайт рестриктазы Sail:
XaaPJFor: 5'- GC CC ATG GAT TAC AAG AGA AGG ATT CAT AAG -3' XaaP_Rev: 5'-TTT GTC GAC СТА TAG CGT GAT CAA TTC CCT ATC-3' Данную реакцию проводят в следующих условиях: 10х Encycio буфер, 50х смесь полимераз Encycio ("Encycio PCR kit", Евроген, Москва), 50х смесь 10mM dNTP, 100 нг геномной ДНК Thermococcus sibiricus MM 739. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 94°С - 3 мин, 30 циклов ПЦР (20 с - 95°С, 30 с - 58°С, 1 мин - 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. Продукт амплификации очищают электрофоретически в 1% агарозном геле с последующим выделением из агарозы с помощью набора для выделения ДНК из геля (Fermentas). Фрагмент (1 мкг) обрабатывают рестриктазами Ncol и Sail (Fermentas) в рекомендуемом буфере в течение 1 часа, а продукт рестрикции очищают электрофоретически, как описано выше.
Полученные фрагменты и векторную часть плазмиды рЕТ-22Ь(+) сшивают при помощи лигазной реакции, проводимой в объеме 20 мкл с использованнием реакционного буфера и фермента Т4 ДНК лигазы фирмы (Fermentas) согласно инструкции производителя. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli Match 1. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 125 мкг/мл ампициллина. Выросшие после инкубирования в течение 16 ч при 37°С одиночные колонии отсевают в жидкую среду LB. содержащую 125 мкг/мл ампициллина, и выращивают в течение 16 ч при 37°С в орбитальной качалке при интенсивности качания 200 об/мин. Выделенную из полученной биомассы плазмидную ДНК проверяют на отсутствие мутаций, возникших при клонировании при помощи автоматического секвенирования.
Пример 2. Получение штамма Е. coli Rosetta(DE3)/pHisTevTSIB0821
Штамм-продуцент получают путем трансформации клеток штамма Е. coli Rosetta(DES) рекомбинантной плазмидой pHisTevTSIB0821 с использованием традиционной генно-инженерной технологии [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989]. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 34 мкг/мл хлорамфеникола и 125 мкг/мл ампициллина. Выросшую после инкубирования в течение 16 ч при 37°С одиночную колонию отсевают в 0.5 мл жидкой среды LB, содержащей 34 мкг/мл хлорамфеникола и 125 мкг/мл ампициллина и выращивают в течение 16 ч при 37°С, а затем переносят в 500 мл колбу с 100 мл жидкой среды LB, содержащей 1 г бактотриптона, 0.5 г бактодрожжевого экстракта и 1 г Nad в 10 мм Трис НС1 рН 7.0, в присутствии 125 мг/мл ампициллина, и выращивают на шейкере при 200 об/мин и температуре 37°С до оптической плотности 0,7 (ОD600), затем добавляют индуктор экспрессии IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ и инкубируют далее при 18°С в течение 20 часов.
Для определения продуктивности штамма водные экстракты клеток анализируют электрофорезом в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка составляет не менее 1% от всех белков растворимой фракции.
Пример 3. Выделение, очистка и характеристика рекомбинантной пролидазы TSIB_0821
Ночную культуру объемом 10 мл с посевным материалом штамма продуцента стерильно переносят в предварительно подготовленный ферментер RALF PLUS (Bioengineering) с 5 л жидкой среды LB, содержащей на литр 10 г бактотриптона, 5 г бактодрожжевого экстракта и 10 г NaCI в 10 мм Трис НС1, рН 7.0, в присутствии 125 мг/мл ампициллина и противопенного реагента Antifoam 0-60 (Sigma). Культивирование проводят в условиях: температура среды 37±0.1°С, рН 7.0±0.1, аэрация 30 л/ч, частота оборотов мешалки 600 об/мин. Контроль плотности клеток в культуре осуществляют методом выносной пробы на спектрофотометре SmartspectPlus (BioRad) при 600 нм. При достижении оптической плотности 0.7 (ODeoo) проводят индукцию путем добавления IPTG до 0.2 мМ с последующей инкубацией в течение 20 часов при 18°С. Клетки осаждают на центрифуге Beckman при 6000 об/мин в течение 20 мин и замораживают клеточные осадки на -70°С.
Замороженную биомассу (около 40 г), полученную из 5 л бактериальной культуры, лизируют в 100 мл охлажденного буферного раствора А (400 мМ NaCI, 50 мМ Хепес рН 7.4, 5 мМ имидазол), содержащего также 0.2% Тритон Х-100, 5% глицерол и игибиторы протеаз (Sigma), и обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора "Ultrasonic Processor" (Cole Parmer) в течение 5×30 с, охлаждая во льду. Нерастворимые компоненты лизата осаждают центрифугированием при 20000 об/мин, 20 мин, 4°С. Надосадочную жидкость собирают и помещают на колонку с металлоаффинной смолой Ni-NTA Superflow (Quigen), предварительно уравновешенную буфером А. Металлохелатную аффинную хроматографию проводят с использованием хроматографической системы АКТА Prime (GE Healthcare). Элюцию белка проводят буферным раствором А, содержащим 500 мМ имидазол. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и инкубируют с протеазой TEV (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 2 часов с последующим диализом против трех литров буферного раствора А в течении 16 часов при 4°С. Для освобождения от шестигистидинового тага и препарата TEV протеазы проводят повторную металлохелатную хроматографию. Фракцию целевого белка, не связавшегося со смолой, концентрируют на центрифужных концентраторах Amicon Ultra 10k (Millipore) и доочищают гель-фильтрацией на колонке Superdex G-75 (GE Healtcare), уравновешенной буферным раствором (200 мМ NaCI, 20 мМ Трис-НСl, рН 8.0, 5% глицерол, 2 мМ Р-меркаптоэтанол и 0.1% b-октилглюкопиранозид). Выход рекомбинантного белка составляет 1 мг с 1 литра культуры при чистоте не менее 97%, определенной с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с последующим окрашиванием Кумасси R-250 по стандартной методике. Соответствие полученного рекомбинантного белка его природному аналогу также подтверждают с помощью Maldi-TOF-масс-спектрометрии пептидного фингерпринта.
Активность пролидазы определяют по расщеплению различных дипептидных субстратов с остатком пролина в С-концевом положении. Условия проведения реакции:
температура 90°, инкубационная смесь в объеме 500 мкл содержит 50 мМ MOPS, pH 8.2, 100 мМ NaCI, pH 8.2, 1мМ МnСl2 и 5мМ субстрата, 0.1-2 мкг фермента. Протекание реакции контролируют спектрофотометрически при 515 нм по образованию комплекса нингидрин-пролин с коэффициентом экстинкции 4,570 M -1·cм-1, для чего реакцию останавливают добавлением равного объема ледяной уксусной кислоты, затем добавляют 500 мкл нингидринового реагента, содержащего 3% нингидрина вес./об, 60% уксусной кислоты и 40% фосфорной кислоты, и инкубируют 10 мин при 90°С. Для перевода оптических единиц в количество образующегося пролина используют калибровочную кривую. За единицу активности пролидазы принимают количество фермента, катализирующего гидролиз 1 мкмоль пептидного субстрата за 1 мин. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка.
Как следует из приведенных примеров, заявляемое изобретение позволяет получать препаративные количества активной рекомбинантной пролидазы при использовании относительно простых и надежных технологий культивирования клеток штамма-продуцента и выделения белка.
Класс C12N15/09 метод рекомбинантных ДНК