способ анализа транслокаций eml4-alk, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии

Формула изобретения

1. Способ анализа транслокаций EML4-ALK,ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, включает: получение кДНК EML4-ALK с помощью реакции ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице РНК EML4-ALK со специфичными праймерами (SEQ ID NO: 1-2); амплификацию фрагментов гена EML4-ALKметодом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК с наборами специфичных праймеров (SEQ ID NO: 3-20); получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа 6 вариантов транслокаций EML4-ALK(V2, V3, V5, V4, V7, V1), содержащего набор иммобилизованных дифференцирующих зондов (SEQ ID NO: 21-31); гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в ячейках биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.

2. Способ по п.1, в котором для идентификации транслокаций EML4-ALK,амплифицированных с помощью набора специфичных праймеров, используют биочип, представляющий собой пластиковую подложку с гелевыми ячейками, содержащими набор иммобилизованных зондов, комплементарных анализируемым участкам гена EML4-ALK.

3. Способ по п.1, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного устройства, регистрирующего и записывающего сигналы флуоресценции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к генетике, молекулярной биологии, онкологии, и касается способа определения чувствительности рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, современного метода лечения с помощью препаратов, направленных на рецепторы опухолевых клеток.

Известен способ анализа транслокаций EML4-ALK с использованием набора праймеров, позволяющих амплифицировать исследуемый фрагмент и анализировать результат с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, капиллярного или обычного гель-электрофореза и набора антител для иммуногистохимического анализа, позволяющего идентифицировать мутантные белки (международная патентная заявка WO 2011087709).

Недостатки способа: данный способ имеет ограниченное применение ввиду дорогостоящих реактивов и оборудования для его осуществления.

Известен способ анализа транслокаций гена ALK, включая инверсию EML4-ALK, с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и ПЦР в реальном времени (международная патентная заявка WO 2011087709).

Недостатки способа: использование дорогостоящих реактивов и дорогого специфического оборудования, исследование занимает более 24 часов.

Известен способ анализа транслокации EML4-ALK для диагностики и терапии немелкоклеточного рака легких с использованием одностадийной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и набора антител к химерному белку (международная патентная заявка WO 2011095894).

Недостатки способа: осуществление данного способа требует дорогостоящих реактивов и оборудования.

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ анализа транслокации гена ALK, включая EML4-ALK, с использованием флуоресцентной гибридизации с биочипами. Прототип включает следующие приемы: выделение РНК-матрицы из биологического материала; двухэтапную стандартную ОТ-ПЦР; изготовление зондов, представляющих собой амплифицированные последовательности ДНК, комплементарные анализируемому участку гена; гибридизацию флуоресцентно-меченого продукта, полученного в ОТ-ПЦР, с зондом на биочипе; анализ результатов гибридизации с помощью сканера и специальных компьютерных программ (международная патентная заявка WO 2010132888).

Недостатки способа: для осуществления данного способа используют дорогостоящую тест-систему; анализ генетических изменений занимает более суток; не исключена неспецифическая гибридизация ПЦР-продукта с зондом, что снижает чувствительность и точность способа; требуется нефиксированный в формалине биологический материал.

Задачей заявляемого изобретения является создание нового, более точного, простого в исполнении, менее дорогостоящего и занимающего меньше времени способа анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии.

Технический результат. Заявляемый способ прост в исполнении, является экономически оправданным, осуществляется без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционным материалом и опухолевой тканью, заключенной в парафиновые блоки, регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 24 часов.

Сущность заявляемого способа заключается в анализе транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, с использованием технологии мультиплексной ОТ-ПЦР и последующей гибридизации флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с биологическим микрочипом (биочипом), в ячейки которого нанесены высокоспецифичные зонды для дифференцировки сигналов гибридизации. Анализ результатов гибридизации осуществляется с помощью детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал портативным анализатором биочипов, снабженным ПЗС-камерой со специальным программным обеспечением.

Заявляемый способ анализа основан на определении 6 вариантов транслокаций EML4-ALK (V2, V3, V5, V4, V7, V1) с использованием мультиплексной ОТ-ПЦР и биочипа, содержащего набор иммобилизованных дифференцирующих зондов для гибридизации с ПЦР-продуктами.

Способ иллюстрируется фигурами 1-3 и таблицами 1-3.

На фиг.1 представлена схема биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK.

На фиг.2 представлена картина гибридизации экспериментального образца опухоли, не несущей транслокаций EML4-ALK.

На фиг.3 - картина образца опухоли, несущей вариант транслокации EML4-ALK V3.

В табл.1 представлены выбранные последовательности прямого и обратного праймеров для ОТ-ПЦР.

В табл.2 представлены последовательности праймеров для первого этапа мультиплексной ПЦР (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18).

В табл.3 представлены последовательности набора 11 зондов, использованных для изготовления биочипа (SEQ ID NO: 21-31).

Заявляемый способ включает следующие приемы: получение кДНК EML4-ALK с помощью ОТ-ПЦР на матрице РНК гена EML4-ALK с использованием специфичных праймеров; амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК, полученной на первом этапе ОТ-ПЦР, с помощью набора высокоспецифичных праймеров; получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK, содержащего набор иммобилизованных зондов; гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в гелевых ячейках на пластиковой подложке биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. На первом этапе забирали биологический материал - опухолевую ткань, замороженную в жидком азоте или заключенную в парафин в виде блоков. Фрагменты опухолевой ткани измельчали или снимали стерильным скальпелем со стекол путем микродиссекции, суспендировали и выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy FFPE Kit.

Анализируемые последовательности гена EML4-ALK амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. Для амплификации гена EML4-ALK (V3a) использовали праймеры SEQ ID NO: 11, 15. ПЦР-смесь первого этапа общим объемом 25 мкл содержала 1 × ПЦР-буфер (трис-НСl - 67 мМ, рН 8.6, (NH₄ )₂SO₄ - 166 мМ, 0,01% Тритон Х-100), MgCl ₂ - 1,5 мМ, дНТФ - по 0,2 мМ, 2,5 Ед Taq-полимеразы, праймеры - по 0,2 мкМ (SEQ ID NO: 11, 15) и 20 нг ДНК. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при t=94°С в течение 3 мин 30 с и далее 35 циклов амплификации при t=94°C в течение 30 с, при t=62°C в течение 20 с, при t=72°C в течение 10 с и элонгация при t=72°C в течение 3 мин.

Смесь второго этапа ПЦР отличалась составом, концентрацией, температурой отжига праймеров и содержала прямой праймер - 0,2 мкМ (SEQ ID NO: 12), обратный праймер - 2 мкМ (SEQ ID NO: 16). Для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта второго этапа в смесь добавляли флуоресцентно-меченый дУТФ-Су5 - 0,2 нМ, который встраивался в цепь в процессе амплификации. Для этого в стандартную реакционную смесь добавляли избыток одного из пары праймеров и флуоресцентной метки (дезоксинуклеотидтрифосфата Су5-дУТФ), получали избыток флуоресцентно-меченого одноцепочечного ПЦР-продукта - ампликона, способного к гибридизации с аллель-специфичными зондами, иммобилизованными в ячейках биочипа.

Полученную на первом этапе ОТ-ПЦР кДНК использовали как матрицу и проводили амплификацию по схеме: денатурация при t=94°С в течение 3 мин 30 с, далее 35 циклов амплификации при t=94°C в течение 30 с, при t=56°C в течение 20 с, при t=72°C в течение 10 с, затем элонгация при t=72°C в течение 3 мин.

Праймеры и зонды синтезировали с помощью фосфоамидитного метода на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе. В табл.1 представлены выбранные последовательности прямого и обратного праймеров для ОТ-ПЦР. Модификацию зондов для введения активной группы проводили как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра коммерческих модификаторов, так и после синтеза, в ручном режиме. При синтезе зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 на 3'-конец присоединяли последовательность-спейсер со свободной аминогруппой для последующей иммобилизации зонда в ячейке биочипа.

В табл.2 представлены последовательности праймеров для первого этапа мультиплексной ПЦР (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18). На втором этапе использовали праймеры SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 20. Для оптимизации ПЦР использовали только праймеры, которые не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов, и обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта. Отжиг праймеров осуществляли при одинаковой температуре. Оптимизировали такие параметры ПЦР, как концентрацию MgCl ₂ и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации, время элонгации, денатурации и отжига праймеров на первом и втором этапах ПЦР.

Зонды для иммобилизации на биочипе и праймеры подбирали так, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа транслокации EML4-ALK варианты. Затем проводили гибридизацию флуоресцентно-меченых ПЦР-продуктов, полученных после второго этапа ОТ-ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля зондами - участками гена EML4-ALK, комплементарными последовательности гена дикого типа или мутантного гена.

Ампликоны денатурировали путем прогрева гибридизационной смеси при t=95°C в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением на льду 2 мин и затем проводили гибридизацию SSPE-буфере 1X. Состав буфера 20 X: NaCl - 174 г, Na₃C₆ H₅O₇ - 88,2 г, деионизированной Н₂ О - 800 мл, ЭДТА - 7,4 г, доводили рН до 7,0 с помощью 1 ON раствора NaOH (6,5 мл), затем объем буфера доводили Н₂О до 1 л и стерилизовали автоклавированием. Продолжительность гибридизации составляла 12-14 ч при t=37°C.

Анализ генотипов и аллелей в исследуемом образце проводили с учетом расположения зондов на биочипе, схема которого указывала на вариант транслокации. При наличии стабильных совершенных дуплексов между ПЦР-продуктом и зондом получали сигнал флуоресценции. При отсутствии комплементарности между ПЦР-продуктом и зондом сигнал флуоресценции отсутствовал.

Биочипы изготовливали путем последовательного нанесения ячеек акриламидного геля на пластиковую подложку матрицы с иммобилизацией зондов в соответствующих ячейках. Для иммобилизации использовали зонды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу. В табл.3 представлены последовательности набора 11 зондов, использованных для изготовления биочипа (SEQ ID NO: 21-31). Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводили после отмывки биочипа, сравнивая интенсивность сигналов флуоресценции в соответствующих ячейках биочипа. Для этого биочип отмывали в буфере с добавлением соли: SSC 20Х: NaCl - 175, 3 г, Na₃C₆H₅ O₇ - 88,2 г и деионизированной Н₂О - 800 мл, доводили рН до 7,0 с помощью 10 N раствора NaOH и объем до 1 л, затем автоклавировали. Далее анализировали полученную флуоресцентную картину с помощью детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал - портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением производства ООО «Биочип-ИМБ» (Россия), и делали вывод о генотипе опухоли в исследуемом образце.

Наличие транслокации ассоциировалось с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии. Схема биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK представлена на фиг.1. Праймеры в первых двух ячейках верхнего ряда соответствовали контрольной последовательности. В ячейки нижнего ряда нанесли праймеры, соответствующие участку гена ALK, в первом, втором и третьем ряду - праймеры, соответствующие различным вариантам транслокаций EML4-ALK. Картина гибридизации образца опухоли, не несущей транслокаций EML4-ALK, представлена на фиг.2. Флуоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках биочипа с праймерами, контрольными для ОТ-ПЦР, следовательно, анализируемый образец не содержит транслокациий EML4-ALK. Картина образца опухоли, несущей вариант транслокации EML4-ALK V3, представлена на фиг.3. Флуоресцентный сигнал наблюдается в ячейках с праймерами, соответствующими транслокации EML4-ALK (V3a), анализируемый образец содержит этот вариант транслокации. При сравнении картин гибридизации образцов опухолей без транслокаций и образцов опухолей с транслокациями показано, что чувствительность и специфичность заявляемого способа составляет не более 1% клеток с мутацией (транслокацией AML4-ALK) на 99% клеток, не несущих транслокацию.

Таблица 1
Способ анализа транслокаций EML4-ALK,ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии
Название	SEQ	Последовательность,	Длина,	T	Размер
праймеров	ID NO:	5'-3'	пар оснований	отжига,°С	ампликона, пар оснований
EML4-RT	1	GCTGCCCTCTTCAC	14	40	-
ALK-RT	2	CGAATGAGGGTGATG	15	42	-

Таблица 2
Способ анализа транслокаций EML4-ALK,ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии
Вариант	Название	SEQ	Последовательность,	Длина,	Т	Размер
	праймеров	ID NО:	5'-3'	пар оснований	отжига, °С	ампликона, пар оснований
V1	EML13-1	3	GCCAAAATTTGTGCAGTGTTT	21	63	249
	EML13-2	4	GTGGAGTCATGCTTATATGG	20	58	137
V2	EML20-1	5	CACACACCTTGACTGGTCC	19	62	195
	EML20-2	6	CTAACTCGGGAGACTATGAATTG	23	58	101
V4	EML15-1	7	GGGATGTTATTAACTGGAGGA	21	62	167
	EML15-2	8	ATCTGAATCCTGAAAGAGAAG	21	57	59
V7	EML15-1	9	GGGATGTTATTAACTGGAGGA	21	63	191
	EML15-2	10	ATCTGAATCCTGAAAGAGAAAT	22	58	83
V3	EML6-1	11	CACATAATTCTTGGGAAAATTCA	23	62	250
	EML6-2	12	CACCCAAATTAATACCAAAAGT	22	57	137
V5	EML2-1	13	GCTGATGTTTTGAGGCGTCTTG	22	62	197
	EML2-2	14	GAAGATCATGTGGCCTCAG	19	57	114
ALK	ALKR-1	15	CAAAGCAGTAGTTGGGGTTGT	21	62
	ALKR-2	16	GCTCAGCTTGTACTCAGGGC	20	62
EML4	K23F1	17	CCCTGCTCCAAAGCAAAG	18	64	349
	K23R1	18	CACTTGGCTCCACAGTTTGTT	21	63
	K23F2	19	GGTGGAAAAGACATGAGCA	19	56	194
	K23R2	20	CTTATTCTACTTTCCTCTTCAG	20	56

Таблица 3
Способ анализа транслокаций EML4-ALK,ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии
Вариант	SEQ	Последовательность зонда	Длина,
слияния	ID NO:	5'-3'	п.о.
VI	21	CTACTGTAGAGCCCACACCT	20
V2	22	ATGAAATATTGTACTTGTAC	20
V4	23	AAATAGAGATATGCTGGATG	20
V7	24	CACACTTTGTCAGATGAGAA	20
V3	25	GTTACCAAAACTGCAGAC (V3a)	18
	26	CCAAGCAAAAATGTCAACT (V3b)	19
V5	27	GAAAAAATCAGTCTCAAGTA	20
ALK К	28	AGCCATGCAGATGGA	15
	29	CAGGAGCTGCAAGCC	15
EML4K	30	TGAGACTGTAGCGGATAC	18
	31	CACTGAAAGTGTCATCCAAT	20