способ прогнозирования сроков формирования абсцесса при остром панкреатите

Формула изобретения

Способ прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма +250 A/G Lt и прогнозируют риск раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита в случае выявления генотипов +250 GG или +250 AG.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита и, как следствие, неблагоприятного течения заболевания.

Проблема острого панкреатита является одной из актуальнейших в экстренной хирургии. Это связано не только с тем, что заболевание очень распространено, но и с тем, что оно сложно в диагностике и в выборе лечебной тактики. Среди неотложных хирургических заболеваний органов брюшной полости острый панкреатит по частоте занимает 2-3-е место [1].

Острый панкреатит - поражение поджелудочной железы собственными активными ферментами - представляет непосредственную угрозу для жизни больного в результате выраженной интоксикации, нарушения гемодинамики и, как следствие, местных и общих осложнений, тяжелых функциональных сдвигов во всех органах и системах. Острый деструктивный панкреатит - первично асептический некроз поджелудочной железы с последующей воспалительной реакцией на очаги сформировавшегося некроза. Данное заболевание имеет фазовое течение: I фаза - ферментативная; II фаза - реактивная; III фаза - секвестрации и расплавления омертвевших участков. Неблагоприятным исходом острого панкреатита является инфицирование очагов некроза, приводящее к осложненному течению заболевания и в том числе к формированию панкреатического абсцесса в фазу секвестрации. Развитие абсцесса отягощает течение и исход заболевания, может приводить к полиорганной недостаточности и сепсису с летальным исходом. Раннее прогнозирование и своевременная диагностика гнойных осложнений при остром деструктивном панкреатите, позволяющая проводить адекватное лечение, является важнейшим звеном в лечении данной патологии.

Известен патент РФ № 2312348 (С1) по заявке № 2006109859/15 от 10.12.2007 (Рукосуева Мария Анатольевна (RU) и др.), где предложен способ прогнозирования риска возникновения, клинического течения и исхода острого алкогольного панкреатита, путем выделения ДНК из периферической венозной крови, исследования мутаций генов GSTM1 и GSTT1. При обнаружении «нулевого» генотипа GSTM1 или «нулевого» генотипа GSTT1 прогнозируют развитие деструктивной формы алкогольного панкреатита, а при обнаружении сочетания «нулевых» генотипов по генам GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие тотального поражения поджелудочной железы. Способ позволяет выделить группу больных с высоким риском развития осложнений и обоснованно рекомендовать им проведение полномасштабной специализированной интенсивной терапии на ранних сроках; и определить оптимальную стратегию при лечении заболевания с точки зрения предикативной медицины и снизить или полностью исключить летальность у больных.

Недостатком прототипа является то, что исследование мутаций генов GSTM1 и GSTT1 не позволяет осуществить прогнозирование сроков формирования абсцесса при остром панкреатите.

Известно, что в ответ на формирование абсцесса происходит синтез таких провоспалительных медиаторов, как факторы некроза опухоли, в частности лимфотоксина [2,3].

Согласно данным литературы лимфотоксин , известный также как фактор некроза опухоли , синтезируется в клетке в виде предшественника, построенного из 247 аминокислотных остатков. Зрелая форма состоит из 171 аминокислоты и имеет молекулярную массу 18,66 кД. Ген Lt локализуется на 6 хромосоме в регионе р21.33. [4].

Можно выделить несколько биологических эффектов при действии лимфотоксина :

1) цитотоксическое действие. Lt обладает способностью индуцировать апоптоз, а также вызывает генерацию в клеточной мембране активных форм кислорода, оксидрадикалов, окиси азота, приводящих к цитолизу опухолевых клеток;

2) влияние на развитие иммунного ответа, инициируя пролиферацию Т и В-лимфоцитов и препятствуя тем самым возникновению иммунологической толерантности;

3) регуляция иммуновоспалительного ответа, обусловленного активацией нейтрофилов, эндотелиальных клеток;

4) метаболические влияния через стимулирование катаболических процессов [5].

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования сроков формирования абсцесса при остром панкреатите по данным о генетическом полиморфизме +250 A/G Lt .

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования сроков формирования абсцесса в III фазу заболевания, т.е. в фазу секвестрации острого панкреатита включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена лимфотоксина ;

- прогнозирование риска раннего формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита в случае выявления генотипов +250 GG или +250 AG Lt .

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза сроков формирования абсцесса в III фазе острого панкреатита по данным полиморфизма гена лимфотоксина а (полиморфизм +250 A/G Lt ).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных острым панкреатитом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Изучение полиморфного локуса лимфотоксина в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (табл.1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl ₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 мМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°С; денатурация - 15 сек при 95°С.

Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемого ДНК-маркера
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
Lt	+250A/G (1 интрон)	F: 5'-CAGTCTCATTGTCTCTGTCACACATT-3'	(Т. Kim et al., 2003)
		R: 5'-ACAGAGAGAGACAGG AAGGGAACA-3'
		5' -FAM:CCATGGTTCCTCTC-RTQ1-3'
		5' -ROX:CTGCCATGATTCC-RTQ1-3'

Изобретение характеризуется на следующих графических материалах.

На Фиг.1 представлена дискриминация аллелей по локусу +250 A/G Lt , где - гомозиготы +250GG, - гомозиготы +250АА, - гетерозиготы +250AG, которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G.

На Фиг.2 иллюстрируются сроки формирования абсцесса в фазу секвестрации у больных острым панкреатитом в зависимости от генотипических вариантов локуса +250 A/G лимфотоксина .

На фиг.1 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора (на оси x) относительно УОФ для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (AG).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю А (УОФ аллеля А отложены по оси у).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси x).

Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученного ДНК-маркера со сроками формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита оценивали с помощью непараметрического метода - критерия Манна-Уитни. Для описания рассматриваемых количественных показателей применяли медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75) [7].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска раннего формирования абсцесса в III фазе острого панкреатита подтверждает анализ результатов наблюдений 195 больных острым панкреатитом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что у пациентов с генотипами +250 GG или +250 AG лимфотоксина в фазу секвестрации острого панкреатита абсцесс формируется на 14,50 сутки от начала заболевания (нижний квартиль 14,00 суток; верхний квартиль 18,00 суток), тогда как у индивидуумов с генотипом +250 АА Lt абсцесс формируется лишь на 18,00 сутки (интерквартильный размах 14, 00-23,00 сутки, p=0,02). (фиг.2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генетические варианты +250 GG или +250 AG лимфотоксина ассоциированы с ранним формированием панкреатического абсцесса в III фазу секвестрации заболевания.

Больным с острым панкреатитом при выявлении генетических факторов риска раннего образования панкреатических абсцессов (+250 GG или +250 AG лимфотоксина ) следует проводить ранний диагностический поиск данного осложнения острого панкреатита (клинико-лабораторный, ультразвуковой, методы компьютерной томографии) с целью своевременной диагностики и лечения панкреатических абсцессов при остром панкреатите.

Литература

1. Багненко, С.Ф., Толстой, А.Д. Острый панкреатит. Протоколы диагностики и лечения // Анналы хирургической гепатологии. 2006. Т.11. № 1. С.60-66.

2. Dugernier, Т, Reynaert, М, Laterre, PF. Early multi-system organ failure associated with acute pancreatitis: a plea for a conservative therapeutic strategy // Acta Gastroenterol Belg. 2003. № 66(2). P.177-183.

3. Zhang, XP, Wang, L, Zhang, J. Study progress on mechanism of severe acute pancreatitis complicated with hepatic injury // J Zhejiang Univ Sci B. 2007. № 8(4). P.228-236.

4. Царегородцева T.M. Цитокины при гастроэнтерологической патологии // Медицинская газета. - 2005. - № 63. - С.17-24.

5. Баранов B.C. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) / B.C. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Е. Иващенко // СПБ: «Интермедика», 2000 - 272 с.

6. Polymorphisms of tumor necrosis factor (TNF) and genes in Korean patients with psoriasis / T. Kim [et al.] // Arch. Dermatol. Res. - 2003. - V.295. - P.8-13.

7. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.