ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных

Классы МПК:A61P15/08 для лечения расстройств половых желез или увеличения фертильности, например стимуляторы овуляции или сперматогенеза
A61D19/02 для искусственного осеменения
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Кириенко Константин Владимирович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-02-02
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C. Изобретение может быть использовано для диагностических и лечебных целей для размножения или оплодотворения животных. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к андрологии и репродуктологии и к ветеринарии, а именно к способам для размножения или оплодотворения животных. Изобретение также применимо в научных исследованиях.

Из существующего уровня техники известен способ иммобилизации (обездвиживания) сперматозоидов путем механического переламывания или перетирания хвоста сперматозоида микроинъекционной иглой о дно чашки Петри непосредственно перед процедурой ICSI (intracytoplasmic sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида). Данный методический прием является неотъемлемой частью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия (в рамках процедуры ICSI), широко используется и стал классическим (In vitro fertilization: a practial approach / edited by David K, Gardner. Informa Healthcare USA. Inc: ISBN-13: 978-0-8493-3335-4; p.167-169). Аналогично, данный подход к иммобилизации сперматозоидов используется при ICSI яйцеклеток домашних и лабораторных животных (Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720).

Недостатком данного технического решения является тот факт, что иммобилизованные таким образом сперматозоиды нежизнеспособны в связи с нарушением целостности цитоплазматической мембраны клетки и аппарата передвижения - хвоста и должны быть немедленно использованы в процедуре ICSI. То есть данный методический прием иммобилизации является мортальным (смертельным) для сперматозоида, и по истечении короткого промежутка времени такой сперматозоид становится непригодным для искусственного оплодотворения яйцеклетки методом ICSI.

Наиболее близким по принципу действия (но не по целям и задачам) к заявленному техническому решению является Hypo Osmotic Swelling Test (HOS-Test), основанный на способности хвостов живых сперматозоидов набухать в гипоосмолярной среде, который используется для оценки целостности цитоплазматической мембраны сперматозоида и определения, таким образом, его жизнеспособности. Принцип действия HOS-Test основан на гидратировании цитоплазмы сперматозоидов с неповрежденной цитоплазматической мембраной в гипоосмотической среде, что приводит к видимым морфологическим изменениям в его хвосте. Таким образом, принцип действия HOS-Test (эффект воздействия гипоосмотической среды на сперматозоиды) аналогичен принципу действия, заложенному в патентуемом способе, однако служит для решения совершенно иных целей и задач. Непосредственно HOS-Test не предназначен и не пригоден для витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является осуществление витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных для использования их в дальнейшем в диагностических либо лечебных целях.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных характеризуется тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы или центрифугируют эякулят в градиенте плотности, или сперматозоиды отбирают в результате флотации и переносят в среду для иммобилизации на время от 1 мин до 4 часов и характеризующейся пониженной осмоляльностью (100-170 mOsmol/kg), значением рН, находящимся в диапазоне от 7,0 до 8,0, газовой средой, содержащей от 0,1 до 8% углекислого газа, температурой среды от 0 до 39°C для поддержания жизнеспособности иммобилизованных сперматозоидов.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для создания необходимой осмоляльности 100-170 mOsmol/kg содержит химические соединения, преимущественно соли: натрия хлорид (NaCl) - 41-70 mmol/l, калия хлорид (KCl) - 1,25-4,8 mmol/l, калий фосфорнокислый однозамещенный (КН 2РО4) - 0-0,8 mmol/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4) - 0-0,3 mmol/l, сульфат магния семиводный (MgSO4×7H2 O) - 0-0,8 mmol/l, хлорид кальция двуводный (CaCl2 ×2Н2О) - 0,3-1,2 mmol/l, бикарбонат натрия (NaHCO 3) - 0-27,0 mmol/l, натрия пируват - 0-0,25 mmol/l, L-натрия лактат - 0-7,0 mmol/l.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе HEPES (0-15,0 mM/l), бикарбоната натрия (0-27,0 mM/l), фосфатного буфера (калий фосфорнокислый однозамещенный - 0-0,8 mM/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0-0,3 mM/l), цитратного буфера (цитрат натрия - 0-70,0 mM/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват (0-0,25 mmol/l), L-натрия лактат (0-7,0 mmol/l), глюкозу (0-5,0 mmol/l), фруктозу (0-5,0 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин (0-0,05 mmol/l), аспарагиновую кислоту (0-0,05 mmol/l), аспарагин (0-0,05 mmol/l), аргинин (0-0,5 mmol/l), цистин (0-0,07 mmol/l), глутамин (0-0,5 mmol/l), аланил-глутамин (0-1,0 mmol/l), глицин (0-0,05 mmol/l), гистидин (0-0,06 mmol/l), изолейцин (0-0,01 mmol/l), лейцин (0-0,05 mmol/l), лизин (0-0,08 mmol/l), метионин (0-0,02 mmol/l), фенилаланин (0-0,02 mmol/l), пролин (0-0,05 mmol/l), серин (0-0,05 mmol/l), таурин (0-0,05 mmol/l), треонин (0-0,02 mmol/l), триптофан (0-0,002 mmol/l), тирозин (0-0,005 mmol/l), валин (0-0,02 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид (0-0,003 mmol/l), фолиевую кислоту (0-0,002 mmol/l), инозитол (0-0,003 mmol/l), никотинамид (0-0,003 mmol/l), пантотенат (0-0,001 mmol/l), пиридоксаль (0-0,0005 mmol/l), рибофлавин (0-0,0005 mmol/l), тиамин (0-0,002 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в белках или макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), бычий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), заменитель белков сыворотки (0-20,0 mg/ml), поливинилпирролидон (0-10,0 mg/ml), поливинилалкоголь (0-10,0 mg/ml).

Результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является гипоосмотический шок сперматозоидов, находящихся в среде иммобилизации, обусловленный притоком воды из внеклеточного пространства через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму сперматозоида и характеризующийся выключением аппарата передвижения - то есть иммобилизацией сперматозоида без потери последним жизнеспособности в течение от 1 мин до 2 часов.

Изобретение поясняется рецептами сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных (Табл.1), которые не охватывают и тем более не ограничивают весь объем притязаний данного методического решения, а являются лишь поясняющими материалами частного случая исполнения.

Способ иммобилизации сперматозоидов реализуется следующим образом.

Сперматозоиды концентрируют центрифугированием при 400-600 g в среде для культивирования сперматозоидов (например, М2, ТН, TL-HEPES, SOF или DPBS), супернатант удаляют, а 100-200 µl осадка, содержащего сперматозоиды, ресуспендируют в 1-2 ml среды для иммобилизации. Полученную взвесь сперматозоидов вновь осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок, содержащий иммобилизованные сперматозоиды, разбавляют средой для иммобилизации до необходимой концентрации.

Иммобилизованные таким образом сперматозоиды могут быть использованы для процедуры ICSI. оценки и отбору по ультаморфологическим признакам с последующим использованием в процедурах ВРТ.

Таблица 1
Примеры рецептов сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных
Состав: Рецепт № :
1 234 5
NaCl, mmol/l 56,868,464,6 63,368,4
KCl, mmol/l2,86 1,894,30 1,901,34
KH2PO4, mmol/l0,71 -0,71 0,300,74
MgSO4×7H2O, mmol/l 0,71-- 0,32-
L-натрия лактат, mmol/l2,0 62,0- -
Глюкоза, mmol/l 3,03,0- 3,0-
NaHCO 3, mmol/l2,4 1,215,47,1 -
Натрия пируват, mmol/l0,2- 0,20,5 -
CaCl2×2H 2O, mmol/l1,02 1,21,020,30 0,50
HEPES, mmol/l12,66 -- -
Na2HPO4 ×H2O, mmol/l- 0,21-- -
NaH2PO4 , mmol/l-- -0,54 4,05
MgCl2×6H 2O, mmol/l- -0,3- 0,25
Бычий сывороточный альбумин, mg/ml-3 195-
Поливинилпирролидон, mg/ml --- -1,0
Аланин, mmol/l-- -0,05 -
Аспарагиновая кислота, mmol/l -- -0,05-
Аспарагин, mmol/l --- 0,05-
Аргинин, mmol/l-- -0,5 -
Цистин, mmol/l --- 0,07-
Глутамин, mmol/l-- -0,5 -
Аланил-глутамин, mmol/l --- 1,0-
Глицин, mmol/l-- -0,05 -
Гистидин, mmol/l --- 0,06-
Изолейцин, mmol/l-- -0,01 -
Лейцин, mmol/l --- 0,05-
Лизин, mmol/l-- -0,08 -
Метионин, mmol/l --- 0,02-
Фенилаланин, mmol/l-- -0,02 -
Пролин, mmol/l --- 0,05-
Серин, mmol/l-- -0,05 -
Таурин, mmol/l --- 0,05-
Треонин, mmol/l-- -0,02 -
Триптофан, mmol/l --- 0,002-
Тирозин, mmol/l- --0,005 -
Валин, mmol/l --- 0,02-
Холина хлорид, mmol/l- --0,003 -
Фолиевая кислота, mmol/l -- -0,002-
Инозитол, mmol/l --- 0,003-
Никотинамид, mmol/l- --0,003 -
Пантотенат, mmol/l --- 0,001-
Пиридоксаль, mmol/l- --0,0005 -
Рибофлавин, mmol/l-- -0,0005 -
Тиамин, mmol/l --- 0,002-

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающаяся тем, что для создания необходимой осмоляльности 100-170 мОсм/кг содержит следующие химические соединения: натрия хлорид NaCl 56,8-68,4 ммоль/л, калия хлорид KCl 1,89-4,30 ммоль/л, калий фосфорнокислый однозамещенный KH2PO4 0-0,71 ммоль/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный одноводный Na2HPO4×H2O 0-0,21 ммоль/л, сульфат магния семиводный MgSO4×7H2 O - 0-0,71 ммоль/л, хлорид кальция двуводный CaCl2 ×2H2O 1,02-1,2 ммоль/л, бикарбонат натрия NaHCO 3 1,2-15,4 ммоль/л, натрия пируват 0-0,2 ммоль/л, L-натрия лактат 2-6,0 ммоль/л, магния хлорид шестиводный MgCl2 ×6H2O 0-0,3 ммоль/л, бычий сывороточный альбумин BSA 0-19 мг/мл, буфер HEPES 0-15,0 мМ/л, глюкоза 0-3 мМ/л.

2. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе бикарбоната натрия 1,2-15,4 мМ/л, фосфатного буфера - калий фосфорнокислый однозамещенный 0-0,71 мМ/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0-0,21 мМ/л.

3. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват 0-0,25 мМ/л, L-натрия лактат 2,0-6,0 мМ/л, глюкозу 0-3,0 мМ/л.

4. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, аргинин, цистин, глутамин, аланил-глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, таурин, треонин, триптофан, тирозин, валин.

5. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид, фолиевую кислоту, инозитол, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин.

6. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в белках и макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, заменитель белков сыворотки, поливинилпирролидон, поливинилалкоголь.

7. Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающийся тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы, центрифугируют эякулят в градиенте плотности или сперматозоиды отбирают в результате флотации, переносят в среду для иммобилизации по п.1 на время от 1 мин до 2 часов, причем состав газовой среды при культивировании на среде для иммобилизации представляет собой 0,1-8% углекислого газа, а температура - 0-39°C.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2504581

patent-2504581.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61P15/08 для лечения расстройств половых желез или увеличения фертильности, например стимуляторы овуляции или сперматогенеза

Патенты РФ в классе A61P15/08:
способ лечения и профилактики рецидивов внутриматочных синехий -  патент 2525533 (20.08.2014)
способ исследования транспортной функции маточных труб -  патент 2524306 (27.07.2014)
способ лечения мужского бесплодия, обусловленного аутоиммунными реакциями против сперматозоидов -  патент 2517061 (27.05.2014)
способ комплексного лечения патозооспермии у мужчин с надпочечниковой гиперандрогенией -  патент 2510284 (27.03.2014)
(дигидро)пирроло[2,1-а]изохинолины -  патент 2495037 (10.10.2013)
инъекционный препарат для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных и петухов и способ его применения -  патент 2493873 (27.09.2013)
способы созревания фолликулов яичника in vitro -  патент 2492866 (20.09.2013)
средство для улучшения репродуктивной функции -  патент 2489142 (10.08.2013)
средство для улучшения репродуктивной функции -  патент 2487705 (20.07.2013)
способ немедикаментозной коррекции идиопатической астенозооспермии -  патент 2482858 (27.05.2013)

Класс A61D19/02 для искусственного осеменения

Патенты РФ в классе A61D19/02:
способ криоконсервации семени петухов -  патент 2517848 (10.06.2014)
устройство и способ введения и отбора жидкости, содержащей гаметы, эмбрионы или раствор иного типа, в яйцевод свиньи -  патент 2514297 (27.04.2014)
способ получения спермы у баранов-производителей -  патент 2510253 (27.03.2014)
усовершенствования, относящиеся к размножению млекопитающих -  патент 2470610 (27.12.2012)
способ проведения суперовуляции у коров-доноров эмбрионов -  патент 2469738 (20.12.2012)
способ улучшения подвижности сперматозоидов -  патент 2446772 (10.04.2012)
среда для криоконсервации спермы козлов -  патент 2436299 (20.12.2011)
способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка -  патент 2431491 (20.10.2011)
способ стимуляции воспроизводительной функции у животных -  патент 2428144 (10.09.2011)
способ подготовки спермы животных-производителей к ее использованию -  патент 2393816 (10.07.2010)


Наверх