Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

нонапептид с противоопухолевой активностью

Классы МПК:C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот
A61K35/00 Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):ЛИТИКС БИОФАРМА АС (NO)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-09-11
публикация патента:

Настоящее изобретение относится к пептидам или пептидоподобным молекулам формулы: CCLLCCLLC (I) (SEQ ID NO:1) или CLLCCLLCC (III) (SEQ ID NO:3), где C представляет собой катионную аминокислоту и L представляет собой аминокислоту с липофильной группой R, в котором одна из аминокислот, имеющая липофильную группу R, представляет собой не кодируемую генетически аминокислоту, причем это соединение возможно находится в форме фармацевтически приемлемой соли, эфира или амида, и к их применениям в терапии, в частности, в качестве противоопухолевых агентов. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 12 табл., 9 пр. нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Рисунки к патенту РФ 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Настоящее изобретение относится к пептидам или пептидоподобным молекулам и к их применениям в терапии, в частности, в качестве противоопухолевых агентов, а также в качестве адъювантов для вакцин, включая противоопухолевые вакцины.

Пептиды и их производные давно признаны молекулами, представляющими терапевтический интерес. Широко разнообразные организмы используют пептиды как часть своего механизма иммунной защиты. Антимикробные пептиды выделены из столь различающихся видов, как бактерии и млекопитающие. Как правило, эти пептиды имеют суммарный положительный заряд и склонность к образованию амфифильных нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -спиральных или нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -складчатых структур при взаимодействии с наружным фосфолипидным бислоем в мембранах бактериальных клеток. В большинстве случаев детальные молекулярные механизмы антибиотического действия неизвестны, хотя считают, что некоторые пептиды, выделенные в категорию класса L (литические), взаимодействуют с мембранами бактериальных клеток, образуя ионные каналы, поры или другие структуры, способные к дестабилизации мембраны.

Показано, что среди общего класса литических антимикробных пептидов некоторые обладают противоопухолевой активностью. Эукариотические клеточные мембраны опухолевых клеток развивают свойства, подобные свойствам клеточных мембран прокариот, и установлено, что это может обеспечивать степень селективности этих литических пептидов для опухолевых клеток in vivo. Некоторая противоопухолевая активность пептидов, обладающих амфифильным характером и суммарным положительным зарядом, описана в WO 00/12542, WO 01/66147, WO 01/19852 и авторами Yang et al. в Journal of Peptide Science [2004], 10, pp 37-46 (PMID: 14959890). Как правило, противоопухолевая активность требует пептидов большего размера, чем может быть предназначено для антибактериальных применений. Уравновешивание необходимости в хорошей цитотоксичности для клеток-мишеней и селективности in vivo представляет конкретные проблемы в создании полезных противоопухолевых пептидов, отчасти в связи с тем, что сохраняется высокая степень подобия между клеточной мембраной опухолевых клеток и нетрансформированных клеток. Тем не менее, частота встречаемости рака в популяциях людей и животных и его роль в смертности означает, что продолжает существовать необходимость в новых лекарствах, которые эффективны против опухолей. Устранение опухоли, либо уменьшение ее в размерах, либо уменьшение числа раковых клеток, циркулирующих в кровеносной или лимфатической системе, может быть полезно при ряде путей: уменьшении боли или дискомфорта, предупреждении метастазов, облегчении оперативного вмешательства, продлении жизни.

В процессе исследований биологической активности пептидов авторы настоящего изобретения идентифицировали небольшую группу молекул, которые проявляют особенно хорошую активность против ряда типов рака и хорошую селективность в отношении раковых клеток по сравнению с нормальными клетками.

Как подробно описано ниже, одна молекула (LTX-315) особенно предпочтительна, и, следовательно, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложено соединение, имеющее формулу SEQ ID NO: 23, или его соль, эфир или амид.

В одном аспекте в настоящем изобретении предложено соединение, предпочтительно пептид, обладающий следующими характеристиками:

a) состоит из 9 аминокислот в линейном порядке;

b) из этих 9 аминокислот 5 являются катионными, и 4 имеют липофильную группу R;

c) по меньшей мере одна из этих 9 аминокислот представляет собой генетически некодируемую аминокислоту или модифицированное производное генетически кодируемой аминокислоты; и необязательно

d) липофильные и катионные остатки расположены таким образом, что не более чем два из любого типа остатков являются смежными друг с другом; и, кроме того, необязательно

e) молекула содержит две пары смежных катионных аминокислот и одну или две пары смежных липофильных остатков.

Катионные аминокислоты, которые могут быть одинаковыми или разными, предпочтительно представляют собой лизин или аргинин, но могут представлять собой гистидин или любую генетически некодируемую или модифицированную аминокислоту, несущую положительный заряд при pH 7,0.

Пригодные генетически некодируемые катионные аминокислоты и модифицированные катионные аминокислоты включают аналоги лизина, аргинина и гистидина, такие как гомолизин, орнитин, диаминомасляная кислота, диаминопимелиновая кислота, диаминопропионовая кислота и гомоаргинин, а также триметиллизин и триметилорнитин, 4-аминопиперидин-4-карбоновая кислота, 4-амино-1-карбамимидоилпеперидин-4-карбоновая кислота и 4-гуанидинофенилаланин.

Липофильные аминокислоты (то есть аминокислоты с липофильной группой R), которые могут быть одинаковыми или разными, все имеют группу R по меньшей мере с 7, предпочтительно по меньшей мере с 8 или 9, более предпочтительно по меньшей мере с 10 атомами не водорода. Аминокислота с липофильной группой R в данной заявке названа липофильной аминокислотой. Типично липофильная группа R имеет по меньшей мере одну, предпочтительно две циклические группы, которые могут быть конденсированы или соединены.

Липофильная группа R может содержать гетероатомы, такие как О, N или S, но типично имеется не более одного гетероатома, предпочтительно он представляет собой атом азота. Эта группа R предпочтительно будет иметь менее 2 полярных групп, более предпочтительно ни одной или одну, наиболее предпочтительно ни одной.

Триптофан является предпочтительной липофильной аминокислотой, и молекулы предпочтительно содержат от 1 до 3, более предпочтительно 2 или 3, наиболее предпочтительно 3 остатка триптофана. Дополнительными генетически кодируемыми аминокислотами, которые могут быть включены, являются фенилаланин и тирозин.

Предпочтительно одна из липофильных аминокислот представляет собой не кодируемую генетически аминокислоту. Наиболее предпочтительно молекула состоит из 3 генетически кодируемых липофильных аминокислот, 5 генетически кодируемых катионных аминокислот и 1 не кодируемой генетически липофильной аминокислоты. В данном контексте D аминокислоту, хотя она строго не кодируется генетически, не рассматривают как "не кодируемую генетически аминокислоту", которая должна структурно, не только стереоспецифично, отличаться от 20 генетически кодируемых L аминокислот. Молекулы по изобретению могут иметь некоторые или все аминокислоты, присутствующие в D форме, однако предпочтительно все аминокислоты находятся в L форме.

Когда молекулы включают генетически некодируемую липофильную аминокислоту (или производное аминокислоты), группа R этой аминокислоты предпочтительно содержит не более чем 35 не водородных атомов, более предпочтительно не более 30, наиболее предпочтительно не более 25 не водородных атомов.

Предпочтительно генетически некодируемые аминокислоты включают: 2-амино-3-(бифенил-4-ил)пропановую кислоту (бифенилаланин), 2-амино-3,3-дифенилпропановую кислоту (дифенилаланин), 2-амино-3-(антрацен-9-ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(нафталин-2-ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-(нафталин-1 -ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-[1,1':4',1''-терфенил-4-ил]-пропионовую кислоту, 2-амино-3-(2,5,7-три-трет-бутил-1Н-индол-3-ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-[1,1':3',1''-терфенил-4-ил]-пропионовую кислоту, 2-амино-3-[1,1':2',1''-терфенил-4-ил]-пропионовую кислоту, 2-амино-3-(4-нафталин-2-илфенил)-пропионовую кислоту, 2-амино-3-(4'-бутилбифенил-4-ил)пропановую кислоту, 2-амино-3-[1,1':3',1''-терфенил-5'-ил]-пропионовую кислоту и 2-амино-3-(4-(2,2-дифенилэтил)фенил)пропановую кислоту.

В предпочтительной форме осуществления соединения по изобретению имеют одну из формул I-V, приведенных ниже, в которых С представляет собой катионную аминокислоту, как определено выше, и L представляет собой липофильную аминокислоту, как определено выше. Аминокислоты связаны ковалентной связью, предпочтительно пептидными связями с получением в результате настоящего пептида или другими связями с получением в результате пептидомиметика. Свободные амино- или карбокси-концы этих молекул могут быть модифицированы, карбокси-конец предпочтительно модифицирован для удаления отрицательного заряда, наиболее предпочтительно карбокси-конец амидирован, и эта амидная группа может быть замещенной.

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Пептидомиметик типично характеризуется сохранением полярности, трехмерным размером и функциональностью (биологической активностью) его пептидного эквивалента, но где пептидные связи заменены, часто более стабильными связями. Под 'стабильным' подразумевают более устойчивый к ферментативному расщеплению гидролитическими ферментами. Как правило, связь, которая заменяет амидную связь (суррогат амидной связи), сохраняет многие из свойств амидной связи, например, конформацию, стерический объем, электростатический характер, возможность водородного связывания и т.д. В главе 14 книги "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors и Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pub, приведено общее обсуждение методов дизайна и синтеза пептидомиметиков. В настоящем случае, где молекула вероятнее подвергается взаимодействию с мембраной, чем с активным центром специфичного фермента, некоторые из описанных проблем точной имитации сродства и эффективности или функции субстрата не являются релевантными, и пептидомиметик может быть легко получен на основании данной структуры пептида или мотива необходимых функциональных групп. Подходящие суррогаты амидной связи включают приведенные ниже группы: N-алкилирование (Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47), ретро-инверсный амид (Chorev, M and Goodman, M., Асе. Chem. Res, 1993, 26, 266), тиоамид (Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), тиоэфир, фосфонат, кетометилен (Hoffman, R.V. and Kirn, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), гидроксиметилен, фторвинил (Allmendinger, Т. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), винил, метиленамино (Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), метилентио (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), алкан (Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) и сульфонамидо (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).

Соединения-пептидомиметики по настоящему изобретению могут иметь 9 идентифицируемых субъединиц, которые примерно эквиваленты по размеру и функции 9 катионным и липофильным аминокислотам. Термин 'аминокислота' можно, следовательно, удобно использовать в данной заявке для отнесения к эквивалентным субъединицам соединения-пептидомиметика. Кроме того, пептидомиметики могут иметь группы, эквивалентные R группами аминокислот, и обсуждение в данной заявке подходящих R групп и N- и С-концевых модифицирующих групп применимо, с соответствующими поправками, к соединениям-пептидомиметикам.

Как обсуждено в "Drug Design and Development", Krogsgaard et al., 1996, наряду с заменой амидных связей пептидомиметики могут включать замену структурных группировок большего размера ди- или трипептидомиметическими структурами, и в этом случае миметические группировки, включающие пептидную связь, такие как миметики, образованные от азола, можно использовать как заменители дипептидов. Предпочтительны, однако, пептидомиметики и, следовательно, пептидомиметические каркасы, где только амидные связи заменены, как обсуждено выше.

Подходящие пептидомиметики включают восстановленные пептиды, где амидная связь восстановлена до метиленамина путем обработки восстанавливающим агентом, например, бораном или гидридным реагентом, таким как алюмогидрид лития. Такое восстановление имеет дополнительное преимущество повышения общей катионности молекулы.

Другие пептидомиметики включают пептоиды, образованные, например, путем ступенчатого синтеза полиглицинов с присоединенной амидной функциональной группой. Некоторые каркасы пептидомиметиков могут быть легко получены из их пептидов-предшественников, таких как пептиды, которые являются перметилированными, подходящие методы описаны Ostresh, J.M. et al. в Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 11138-11142. Сильные основные условия способствуют преобладанию N-метилирования над O-метилированием и приводят в результате к метилированию некоторых или всех атомов азота в пептидных связях и N-концевого атома азота.

Предпочтительные каркасы пептидомиметиков включают полиэфиры, полиамины и их производные, а также замещенные алканы и алкены. Пептидомиметики будут предпочтительно иметь N- и С-концы, которые могут быть модифицированы, как описано в данной заявке.

Как нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 - и нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -аминокислоты, так и нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -аминокислоты включены в термин 'аминокислоты', поскольку являются N-замещенными глицинами. Соединения по изобретению включают бета-пептиды и депсипептиды.

Как обсуждено выше, соединения по изобретению включают по меньшей мере одну, и предпочтительно одну, генетически некодируемую аминокислоту. Когда этот остаток обозначен как L', предпочтительные соединения представлены приведенными ниже формулами:

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Особенно предпочтительны пептиды формулы I и II, и из этих пептидов особенно предпочтительна формула I''.

Предпочтительно пептид представляет собой не LTX-302 (SEQ ID NO:11) (ниже).

Приведенные ниже пептиды, которые представлены в таблице 1 (за исключением LTX-302), наиболее предпочтительны.

Таблица 1
НазваниеSEQ ID NO Последовательность
LTX-301 10Dip-K-K-W-W-K-K-W-K-NH 2
LTX-302 11W-K-K-W-Dip-K-K-W-K-NH2
LTX-30312 W-K-K-W-W-K-K-Dip-K-NH2
LTX-30413 Bip-K-K-W-W-K-K-W-K-NH2
LTX-30514 W-K-K-Bip-W-K-K-W-K-NH2
LTX-30615 w-k-k-w-dip-k-k-w-k-NH2
LTX-30716 K-K-W-Dip-K-K-W-W-K-NH2
LTX-30817 k-k-W-Dip-k-k-W-W-k-NH2
LTX-30918 K-K-W-Dip-K-K-W-Dip-K-NH2
LTX-31019 K-K-W-Bip-K-K-W-W-K-NH2
LTX-31220 K-Bip-K-K-W-W-K-K-W-NH2
LTX-31321 K-K-Bip-W-K-K-W-W-K-NH2
LTX-31422 K-K-W-W-K-K-Dip-W-K-NH2
LTX-31523 K-K-W-W-K-K-W-Dip-K-NH2
LTX-31624 K-W-Dip-K-K-W-W-K-K-NH2
LTX-31725 K-K-W-W-K-W-Dip-K-K-NH2
LTX-31826 Orn-Orn-W-Dip-Orn-Orn-W-W-Orn-NH2
LTX-319 27Dap-Dap-W-Dip-Dap-Dap-W-W-Dap-NH 2
LTX-320 28R-R-W-Dip-R-R-W-W-R-NH2
LTX-32129 K-W-W-K-K-Dip-W-K-K-NH2
LTX-32330 K-Dip-K-K-W-W-K-K-W-NH2
LTX-32431 K-K-Dip-W-K-K-W-W-K-NH2
LTX-32532 k-w-w-k-k-dip-w-k-k-NH2
LTX-32633 R-R-Bip-W-R-R-W-W-R-NH2
LTX-32734 R-R-Dip-W-R-R-W-W-R-NH2
LTX-32935 k-k-bip-w-k-k-w-w-k-NH2
LTX-33136 k-k-Bip-w-k-k-w-w-k-NH2
LTX-33237 K-K-bip-W-K-K-W-W-K-NH2
LTX-33338 Dab-Dab-W-Dip-Dab-Dab-W-W-Dab-NH2
LTX-334 39K-K-W-1-Nal-K-K-W-W-K-NH2
LTX-335 40K-K-W-2-Nal-K-K-W-W-K-NH2
LTX-336 41K-K-W-Ath-K-K-W-W-K-NH2
LTX-33842 K-K-W-Phe(4-4'Bip)-K-K-W-W-K-NH2

В которой:

- стандартный однобуквенный код использован для генетически кодируемых аминокислот

- строчными буквами обозначены D аминокислоты

- Dip представляет собой дифенилаланин

- Bip представляет собой бифенилаланин

- От представляет собой орнитин

- Dap представляет собой 2,3-диаминопропионовую кислоту

- Dab представляет собой 2,4-диаминомасляную кислоту

- 1-Nal представляет собой 1-нафтилаланин

- 2-Nal представляет собой 2-нафтилаланин

- Ath представляет собой 2-амино-3-(антрацен-9-ил)пропановую кислоту

- Phe(4,4'Bip) представляет собой 2-амино-3-[1,1':4',1''-терфенил-4-ил]пропионовую кислоту

Все молекулы, описанные в данной заявке, могут находиться в форме соли, эфира или амида.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением также предложено соединение, выбранное из группы, состоящей из: LTX-301, LTX-303-LTX-310, LTX-312-LTX-321, LTX-323-LTX-327, LTX-329, LTX-331-LTX-336 и LTX-338, или его соль, эфир или амид. Таким образом, в настоящем изобретении предложено соединение, имеющее формулу, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10 и 12-42, или его соль, эфир или амид.

Молекулы предпочтительно представляют собой пептиды и предпочтительно имеют модифицированный, в частности, амидированный С-конец. Амидированные пептиды могут сами находиться в форме соли, и предпочтительны ацетатные формы. Подходящие физиологические приемлемые соли хорошо известны в данной области техники и включают соли неорганических или органических кислот, и включают как трифторацетат, так и ацетат и соли, образованные с HCl.

Молекулы, описанные в данной заявке, являются амфипатическими по природе, их 2° структура, которая может иметь или не иметь склонность к образованию нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -спирали, дает амфипатическую молекулу в физиологических условиях.

В следующем аспекте предложены соединения по изобретению, в частности, соединения формул I-V, в частности, пептиды таблицы 1, для применения в терапии, в частности, для применения в качестве противоопухолевого или противоракового агента, где эти термины в данной заявке используют как синонимы.

Соединения проявляют противоопухолевую активность; в частности, они оказывают цитотоксический эффект посредством прямого механизма, влияющего на мембрану. Эти молекулы являются литическими, дестабилизирующими или даже перфорирующими клеточную мембрану. Это обеспечивает особое терапевтическое преимущество по сравнению с агентами, которые действуют на белковые компоненты клеток-мишеней или взаимодействуют с ними, например, с рецепторами клеточной поверхности. Если в результате мутаций могут образоваться новые формы белков-мишеней, что приводит к химиотерапевтической устойчивости, намного менее вероятно, что могут произойти радикальные изменения липидных мембран, которые предотвращают цитотоксический эффект.

Таким образом, в следующем аспекте предложены соединения по изобретению для применения при дестабилизации и/или пермеабилизации мембран опухолевых клеток. Под 'дестабилизацией' подразумевают нарушение нормальной трехмерной конфигурации липидного бислоя, включающее, но не ограниченное этим, утончение мембраны, повышенную мембранную проницаемость (типично без вовлеченности каналов) для воды, ионов или метаболитов и т.д.

В изобретении предложены способы лечения опухолей, как солидных, так и несолидных опухолей, путем введения различных соединений, описанных в данной заявке. Вводимое количество должно быть эффективным для уничтожения всех клеток или доли клеток-мишеней, либо для предотвращения или уменьшения скорости их размножения, либо для ингибирования метастазов, либо для иного уменьшения вредного эффекта опухоли на пациента. Врач или пациент должен наблюдать улучшение одного или более чем одного параметра или симптома, связанного с опухолью. Введение также может быть профилактическим. Пациент типично будет представлять собой пациента-человека, но можно также лечить животных, не являющихся человеком, таких как домашние животные или домашний скот.

В отличие от большинства агентов, которые имеют белковые мишени, молекулы по настоящему изобретению могут быть направлены на широкий ряд раков, как показано в Примерах, приведенных в данной заявке. Предпочтительные раковые мишени включают лимфомы, лейкозы, нейробластомы и глиобластомы (например, головного мозга), карциномы и аденокарциномы (в частности, молочной железы, ободочной кишки, почек, печени, легких, яичника, поджелудочной железы, простаты и кожи) и меланомы. Рак молочной железы является особенно предпочтительной мишенью.

Пептиды по изобретению можно синтезировать любым удобным путем. Как правило, присутствующие реакционные группы (например, амино, тиол и/или карбоксил) будут защищены на протяжении всего синтеза. Конечная стадия в синтезе, таким образом, будет состоять в удалении защиты защищенного производного по изобретению.

При построении пептида можно, в принципе, начать либо с С-конца, либо с N-конца, хотя метод С-концевого начала предпочтителен.

Способы пептидного синтеза хорошо известны в данной области техники, но для настоящего изобретения особенно удобным может быть осуществление синтеза на твердофазном носителе, где такие носители хорошо известны в данной области техники.

Известен широкий выбор защитных групп для аминокислот, и подходящие защитные группы амина могут включать карбобензилокси (также обозначенный Z) трет-бутоксикарбонил (также обозначенный Вос), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил (Mtr) и 9-флуоренилметоксикарбонил (также обозначенный Fmoc). Также понятно, что, когда пептид строят с С-конца, защитная группа амина будет находиться на нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -аминогруппе каждого нового добавленного остатка, и ее будет необходимо селективно удалить перед следующей стадией сочетания.

Защитные группы карбоксила, которые можно, например, использовать, включают легко расщепляемые эфирные группы, такие как бензильная (Bzl), пара-нитробензильная (ONb) или трет-бутильная (OtBu) группы, а также сочетающие группы на твердых носителях, например, амид Ринка, связанный с полистиролом.

Защитные группы тиола включают пара-метоксибензил (Mob), тритил (Trt)и ацетамидометил (Acm).

Предпочтительные пептиды по изобретению могут быть удобно получены с использованием защитной группы трет-бутоксикарбонил (Boc) для аминных боковых цепей Lys, Orn, Dab и Dap, а также для защиты индольного атома азота остатков триптофана. Fmoc можно использовать для защиты альфа-аминогрупп. Для пептидов, содержащих Arg, можно использовать 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил для защиты гуанидина боковой цепи.

Существует широкий ряд методов для удаления защитных групп амина и карбоксила. Они должны быть, однако, согласованы с используемой стратегией синтеза. Защитные группы боковой цепи должны быть стабильны по отношению к условиям, используемым для удаления временных защитных групп нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 -аминогруппы перед следующей стадией сочетания.

Защитные группы амина, такие как Вое, и защитные группы карбоксила, такие как tBu, можно удалять одновременно путем обработки кислотой, например, трифторуксусной кислотой. Защитные группы тиола, такие как Trt, можно удалять селективно, используя агент окисления, такой как йод.

Ссылки и методы синтеза пептидомиметических соединений и других биоактивных молекул по изобретению описаны в данной заявке и, таким образом, хорошо известны в данной области техники.

Препараты, содержащие одно или более чем одно соединение по изобретению в смеси с подходящим разбавителем, носителем или эксципиентом, составляют следующий аспект настоящего изобретения. Такие препараты могут быть предназначены среди прочего для фармацевтических (включая ветеринарные) целей. Подходящие разбавители, эксципиенты и носители известны специалисту в данной области техники.

Хотя для соединений по настоящему изобретению (или их солей, эфиров или амидов) возможно их введение в виде чистых соединений, предпочтительно представлять их в виде фармацевтических препаратов. Таким образом, препараты в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержат по меньшей мере одно соединение, его соль, эфир или амид, как определено выше, вместе по меньшей мере с одним другим терапевтическим ингредиентом. Таким образом, настоящее изобретение распространяется на комбинированные препараты, включающие соединение по настоящему изобретению (или его соль, эфир или амид) и по меньшей мере один другой терапевтический ингредиент.

Способы лечения опухолей, которые включают введение пациенту-человеку или животному одного или более чем одного соединения, как описано в данной заявке, составляют следующий аспект настоящего изобретения.

Композиции в соответствии с изобретением могут быть представлены, например, в форме, пригодной для перорального, местного, назального, парентерального, внутривенного, внутриопухолевого, ректального или регионарного (например, изолированная перфузия конечностей) введения. Введение типично осуществляют парентеральным путем, предпочтительно путем инъекции подкожно, внутримышечно, интракапсулярно, интраспинально, интратуморально или внутривенно.

Активные соединения, определенные в данной заявке, могут быть представлены в общепринятых фармакологических формах введения, таких как таблетки, таблетки с покрытием, назальные спреи, растворы, эмульсии, липосомы, порошки, капсулы или формы пролонгированного высвобождения. Для приготовления этих форм можно использовать общепринятые фармацевтические эксципиенты, а также обычные способы получения.

Можно также использовать органоспецифические системы носителей.

Инъекционные растворы могут быть получены общепринятым способом, как, например, путем добавления консервирующих агентов, таких как пара-гид роксибензоаты, или стабилизаторов, таких как ЭДТА. Затем растворы заполняют во флаконы или ампулы для инъекций.

Предпочтительными препаратами являются те, в которых пептиды растворены в физиологическом растворе. Такие препараты пригодны для применения в предпочтительных способах введения, в частности, при локальном введении, то есть внутриопухолевом, например, путем инъекции или предпочтительно изолированной перфузии/инфузии (включая частичную изоляцию) конечности, области тела или органа.

Лекарственные формы, содержащие активные молекулы, предпочтительно содержат 0,1-10 мг, например, 1-5 мг противоопухолевого агента. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать дополнительные активные ингредиенты, включая другие цитотоксические агенты, такие как другие противоопухолевые пептиды. Другие активные ингредиенты могут включать различные типы цитокинов, например, IFN-нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 , TNF, CSF, а также факторы роста, иммуномодуляторы, химиотерапевтические агенты, например, цисплатин, либо антитела или противораковые вакцины.

При применении таких композиций системно активная молекула присутствует в таком количестве, чтобы достичь сывороточного уровня биоактивной молекулы по меньшей мере примерно 5 мкг/мл. Как правило, сывороточный уровень не должен превышать 500 мкг/мл. Предпочтительный сывороточный уровень составляет примерно 100 мкг/мл. Такие сывороточные уровни могут быть достигнуты путем включения биоактивной молекулы в композицию, которую нужно вводить системно в дозе от 1 до примерно 10 мг/кг. Как правило, молекулу(ы) не следует вводить в дозе, превышающей 100 мг/кг.

В соответствии с настоящим изобретением также предложено соединение, его соль, эфир или амид в соответствии с настоящим изобретением в комбинации по меньшей мере с одной вакциной.

Как подробно описано ниже, эксперименты показали, что профилактическая вакцинация опухолевыми клетками, лизированными LTX-315, приводит в результате к ингибированию опухолевого роста, и показано, что соединения по настоящему изобретению высокоэффективны в качестве вакцинных адъювантов, и, следовательно, настоящее изобретение распространяется на применение соединений (или их солей, эфиров или амидов) в комбинации по меньшей мере с одной вакциной. Предпочтительные вакцины включают, но не ограничены ими, противораковые вакцины, содержащие по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности (последовательностям) из опухолевого антигена(ов) (ТАА), где предпочтительными ТАА, но не ограниченными ими, являются теломераза, сурвивин, онкогенный р21, ras, abl, gip, gsp, ret, terk, и антивирусные вакцины, содержащие по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотной последовательностью (последовательностями), соответствующей иммуногенным последовательностям из вирусного белка(ов). Кроме того, можно использовать лизат опухоли. Примеры предпочтительных вакцин включают вакцины, пептиды, пептидные фрагменты и иммуногены, заявленные WO 92/14756, WO 00/66153 (NO 309798), WO 00/02581, WO 02/051994, WO 02/070679, WO 02/094312, WO 99/58552 и WO 99/58564.

В соответствии с настоящим изобретением также предложено применение соединения, его соли, эфира или амида или комбинации в соответствии с настоящим изобретением при изготовлении лекарства, в частности, при изготовлении лекарства для лечения рака и/или при изготовлении вакцины.

Предпочтительно лекарство предназначено для лечения опухолей с множественной лекарственной устойчивостью (MDR, multidrug resistant tumours).

В соответствии с настоящим изобретением также предложена фармацевтическая упаковка, содержащая:

(i) по меньшей мере одну вакцину; и

(ii) соединение, соль, эфир или амид в соответствии с настоящим изобретением.

С помощью фармацевтических упаковок вакцину и соединение, соль, эфир или амид можно вводить отдельно (например, с задержкой по времени по меньшей мере примерно или не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90 или 120 минут). Фармацевтическая упаковка может, конечно, также включать инструкции по введению.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения опухоли, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества соединения, соли, эфира или амида или комбинации в соответствии с настоящим изобретением пациенту, нуждающемуся в этом.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ вакцинации, включающий стадию введения пациенту фармацевтически эффективного количества соединения, соли, эфира или амида или комбинации в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ изготовления лекарства, включающий смешивание соединения, имеющего формулу SEQ ID NO: 23 (LTX-315), или его соли, эфира или амида с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

В соответствии с настоящим изобретением также предложен способ изготовления лекарства, включающий смешивание соединения, имеющего формулу SEQ ID NO: 23 (LTX-315), или его соли, эфира или амида с опухолевыми клетками.

Теперь изобретение будет дополнительно описано в приведенных ниже Примерах и со ссылкой на графические материалы, в которых:

Фиг.1 представляет собой график, показывающий процент гибели эритроцитов в серии экспериментов по тестированию пептида LTX-315 при варьирующих концентрациях. На оси Х показана концентрация пептида (мкг/мл). На оси Y показан % гибели клеток;

На фиг.2 показан опухолевый рост у мышей, повторно инокулированных клетками А20 В-кпеточной лимфомы мыши по сравнению с ростом у контрольных животных из первоначального исследования. Ромбиками показаны контроли из первоначальных исследований. Сплошными квадратами показаны повторно инокулированные мыши;

На фиг.3 показан опухолевый рост у индивидуальных мышей, повторно инокулированных клетками В-клеточной лимфомы мыши А20, которые были первоначально обработаны LTX-315. Квадратами показана мышь 1. Треугольниками (основанием вниз) показана мышь 2. Треугольниками (основанием вверх) показана мышь 3. Ромбиками показана мышь 4;

На фиг.4 показан опухолевый рост у индивидуальных мышей, повторно инокулированных клетками карциномы ободочной кишки мыши CT26WT по сравнению с ростом у контрольных животных. Ромбиками показаны контроли из первоначальных исследований. Сплошными квадратами показаны неоднократно инокулированные мыши;

На фиг.5 показан опухолевый рост у индивидуальных мышей, повторно инокулированных клетками карциномы ободочной кишки мыши CT26WT, которые были первоначально обработаны LTX-315. Маленькими квадратиками показана мышь 1. Маленькими треугольниками (основанием вниз) показана мышь 2. Маленькими треугольниками (основанием вверх) показана мышь 3. Маленькими ромбиками показана мышь 4. Кружками показана мышь 5. Большими квадратами показана мышь 6. Большими треугольниками (основанием вниз) показана мышь 7. Большими треугольниками (основанием вверх) показана мышь 8. Большими ромбиками показана мышь 9;

На фиг.6 показан рост клеток В-клеточных лимфом А20 у облученных мышей, которые получили спленоциты от донорных мышей, проявляющих полную регрессию опухоли после обработки LTX-315 (группа 1), или контрольных мышей (группа 2), которые получили спленоциты от донорных мышей, ранее не подверженных экспериментам. Квадратами показана группа 1 (мыши, которые получили спленоциты от доноров, проявляющих полную регрессию). Ромбиками показана группа 2 (мыши, которые получили спленоциты от доноров, ранее не подверженных экспериментам);

На фиг.7 показан противораковый эффект двух различных режимов обработки на солидных опухолях мышей А20 (группы 1 и 2) по сравнению с необработанными контролями (группа 3). Перевернутыми сплошными треугольниками (основанием вверх) показана группа 1 (обработка). Пустыми квадратами показана группа 2 (обработка + адъювант). Пустыми треугольниками (основанием вниз) показана группа 3 (контроль). Порядок по размеру опухоли (мм2) на сутки 21 является следующим (от наибольшего к наименьшему): группа 3, группа 1, группа 2.

В итоге, в приведенных ниже Примерах показано:

Пример 1 - что LTX-315 является самым эффективным из 5 протестированных соединений в исследовании цитотоксической активности in vitro против панели из 37 раковых клеточных линий человека.

Пример 2 - что LTX-315 является самым эффективным из 5 протестированных соединений в исследовании цитотоксической активности in vitro против панели из 10 клеточных линий лимфомы.

Пример 3 - что LTX 315 имеет среднее значение ЕС 50 более чем 1200 мкг/мл (833 мкМ) против эритроцитов человека.

Пример 4 - что противоопухолевая активность LTX-315 приводила в результате к полному ответу опухоли у 3 из 7 обработанных мышей на группу, получающую оптимальную дозу (группа 1) в исследовании на эффект LTX-315 при различных уровнях дозы на клетках В-клеточной лимфомы мыши А20 у мышей.

Пример 5 - что четыре различных режима обработки LTX-315 продемонстрировали сильный противоопухолевый эффект против опухолей CT26WT мыши (с множественной лекарственной устойчивостью).

Пример 6 - что LTX-315 обладает широким спектром активности против различных раковых клеточных линий с множественной лекарственной устойчивостью и значимо намного более слабый цитотоксический эффект на нормальные клетки человека.

Пример 7 - что полная регрессия опухоли вследствие первоначальной обработки солидных опухолей мышей LTX-315 привела в результате к формированию долговременной эндогенной защиты против роста тех же опухолей после повторной инокуляции.

Пример 8 - что обработка LTX-315 может придавать долговременную защиту против специфичных опухолей путем вызова иммунного ответа.

Пример 9 - что иммунный ответ против клеток А20 индуцирован инъекцией смеси LTX-315 и лизированных клеток А20.

Пример 1

Исследование цитотоксической активности in vitro 5 тестируемых соединений против панели из 37 раковых клеточных линий человека

1. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

- Определить концентрации пяти новых соединений для получения 50% ингибирования пролиферации (IC50) против панели из 37 раковых клеточных линий человека.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Тестируемые вещества

2.1.1. Тестируемые вещества

- Тестируемые вещества, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 и LTX-329 (см. таблицу 1) представлены в порошкообразной форме.

2.1.2. Положительный контроль

- В качестве положительного контроля использовали Тритон Х-100, поставляемый фирмой Oncodesing (Дижон, Франция) от Sigma (Сен-Кантен-Фалавье, Франция).

2.1.3. Растворитель лекарства и условия хранения

- Соединения хранили при 4°С. Сначала порошок растворяли в культуральной среде без сыворотки (RPMI 1640, Lonza, Вервье, Бельгия) и дополнительно разводили, используя культуральную среду без сыворотки, до достижения соответствующих разведении. Исходный раствор не хранили и готовили свежий на сутки эксперимента.

- 1% (конечная концентрация) Тритон Х-100 был получен путем разведения с использованием культуральной среды.

2.2. Опухолевые клеточные линии и условия культивирования

2.2.1. Опухолевые клеточные линии

Раковые клеточные линии и культуральные среды были приобретены и поставлены фирмой Oncodesign.

Клеточные линии ПроисхождениеИсточник
КРОВЬ
CCRF-CEM острый лимфобластный лейкоз, Т клетки Pharmacella
CCRF-CEM/VLB острый лимфобластный лейкоз, Т клетки Pharmacell
HL-60острый промиелоцитарный лейкоз, ОПЛ, плюрипотентная дифференциацияATCC b
HL-60/ADR острый промиелоцитарный лейкоз, ОПЛPharmacell
К-562хронический миелоидный лейкоз, метастаз плеврального выпота АТСС

K-562/Gleevec хронический миелоидный лейкоз, метастаз плеврального выпота Oncodesign
RPMI 8226миелома, В клетки, IgI-типа Pharmacell
ГОЛОВНОЙ МОЗГ
SH-SY5Y нейробластома, метастаз костного мозга АТСС
SK-N-AS нейробластома, метастаз костного мозга АТСС
U-87 MG глиобластома, астроцитомаАТСС
МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА
MCF-7инвазивный протоковый рак, метастаз плеврального выпотаPharmacell
MCF7/mdr аденокарцинома, метастаз плеврального выпота Pharmacell
MDA-MB-231 инвазивный протоковый рак, метастаз плеврального выпота Pharmacell
MDA-MB-435S инвазивный протоковый рак, метастаз плеврального выпота АТСС
T-47D инвазивный протоковый рак, метастаз плеврального выпота АТСС
ОБОДОЧНАЯ КИШКА
COLO 205 колоректальная аденокарцинома, асцитный метастаз АТСС
НСТ 116 колоректальная карциномаАТСС
НСТ-15колоректальная аденокарциномаАТСС
НТ-29колоректальная аденокарцинома АТСС
ЭНДОТЕЛИИ
HUV-EC-C нормальныйАТСС
ПОЧКА
786-0 почечно-клеточная аденокарциномаАТСС
А-498карцинома АТСС
ПЕЧЕНЬ
Hep G2 печеночно-клеточная карциномаАТСС

SK-HEP-1аденокарцинома, асцитныи метастазATCC
ЛЕГКОЕ
A549 карциномаPharmacell
Calu-6анаплазированный рак ATCC
NCl-H460 карцинома, метастаз плеврального выпота ATCC
ЯИЧНИК
IGROV-1карцинома Pharmacell
IGROV-1/CDDPкарцинома Pharmacell
NIH:OVCAR-3 аденокарцинома, асцитныи метастазPharmacell
SK-OV-3аденокарцинома, асцитныи метастазPharmacell
ПОДЖЕЛУДОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА
BxPC-3аденокарцинома ATCC
PANC-1 карциномаATCC
ПРОСТАТА
DU 145карцинома, метастаз головного мозгаPharmacell
PC-3аденокарцинома, метастаз костиATCC
КОЖА
A-431 плоскоклеточная карциномаATCC
Malme-3Мзлокачественная меланомаATCC
SK-MEL-2злокачественная меланома, метастаз кожиATCC
a - Pharmacell, Париж
b - ATCC, Манассас, Виргиния, США

2.2.2. Условия культивирования

Опухолевые клетки выращивали в виде прикрепленных монослоев или в виде суспензий при 37°С в увлажненной атмосфере (5% CO 2, 95% воздух). Культуральная среда представляла собой среду RPMI 1640, содержащую 2 мМ L-глутамина (Lonza, Бельгия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Lonza). Для использования в эксперименте прикрепленные клетки отделяли от культурального флакона 5-минутной обработкой трипсином-версеном (Lonza), разводили в среде Хэнкса без кальция или магния (Lonza) и нейтрализовали добавлением полной культуральной среды. Клетки считали в гемоцитометре, и их жизнеспособность оценивали по исключению 0,25% трипанового синего.

Обнаружение микоплазмы осуществляли, используя набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert (RTM) Mycoplasma Detection Kit (Lonza) в соответствии с инструкциями изготовителя. Было обнаружено, что все тестируемые клетки отрицательны по заражению микоплазмой.

3. СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ

3.1. Амплификация и посев клеточных линий

Опухолевые клетки высевали в 96-луночные микротитрационные планшеты с плоским дном (Nunc, Dutscher, Брюмат, Франция) и инкубировали при 37°С в течение 24 часов перед обработкой 190 мкл культуральной среды без лекарства с добавлением или без добавления 10% FBS для прикрепленных или растущих в суспензии клеточных линий соответственно.

Плотности перевивания для каждой клеточной линии суммированы ниже в таблице 2:

Таблица 2
Клеточные линииПлотности перевивания (число клеток/лунка)Клеточные линии Плотности перевивания (клеток/лунка)
CCRF-CEM25000 HUV-EC-C20000
CCRF-CEM/VLB 25000786-O15000
HL-6020000 A-49815000
HL-60/ADR20000 Hep G215000
К-56220000 SK-HEP-115000
K-562/IMR 20000A54915000
RPMI 8226 20000Calu-615000
SH-SY5Y20000 NCl-H46015000
SK-N-AS15000 IGROV-115000
U-87 MG15000 IGROV-1/CDDP15000
MCF-720000 NIH:OVCAR-315000
MCF7/mdr 20000SK-OV-3 15000
MDA-MB-231 15000ВхРС-315000
MDA-MB-435S 20000PANC-115000
T-47D15000 DU 14515000
COLO 20515000 PC-315000
HCT 11615000 A-43115000
НСТ-1515000 Malme-3М15000
НТ-2920000 SK-MEL-215000

3.2. Определение IC50

Прикрепленные клеточные линии промывали один раз 200 мкл культуральной среды без FBS перед обработкой. Опухолевые клетки инкубировали в течение 4 часов с 10 концентрациями соединений с шагом разведения ¼ с высшей дозой 400 мкМ (диапазон 4×10 -4-4×10-10 М), с 1% (конечная концентрация) Тритон Х-100 в качестве положительного контроля и с культуральной средой без FBS в качестве отрицательного контроля. Клетки (190 мкл) инкубировали в конечном объеме 200 мкл культуральной среды без FBS, содержащей тестируемые вещества, при 37°С в атмосфере 5% CO2.

Было проведено три (3) независимых эксперимента, где каждую концентрацию тестировали в четырех повторах. Контрольные клетки обрабатывали одним растворителем. В конце обработок цитотоксическую активность оценивали с помощью анализа MTS (см. §3.3).

Разведения тестируемого соединения, а также распределение по планшетам, содержащим клетки, проводили, используя систему транспортировки жидкостей Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences S.A.). В соответствии с автоматическим применением тестировали единый диапазон концентраций для любых тестируемых клеточных линий. Диапазон не адаптировали для каждой клеточной линии.

3.3. Анализ MTS

Цитотоксическую активность тестируемого вещества in vitro выявляли путем анализа MTS (BALTROP J.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614), используя новое тетразолиевое соединение (MTS, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) и реагент спаривания электронов, называемый PMS (феназина метосульфат). Подобно МТТ, MTS биологически восстанавливается клетками до продукта формазана, который непосредственно растворим в культуральной среде без обработки, в отличие от МТТ.

По окончании обработки клеток в каждую лунку добавляли 40 мкп фильтрованного через 0,22 мкм фильтр, свежесобранного раствора MTS (20 мл при 2 мг/мл, Ref G1111, Batch 235897, Exp 03/2009, Promega, Шарбонье, Франция) и PMS (1 мл при 0,92 мг/мл, Ref P9625, партия 065К0961, Sigma) в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS, Ref 17-513Q, партия 6МВ0152, Cambrex). Культуральные планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Поглощение (OD) измеряли при 490 нм в каждой лунке, используя множественно меченый счетчик VICTOR3TM 1420 (Wallac, PerkinElmer, Куртабеф, Франция).

4. ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

4.1. Определение IC50

- Дозозависимое ингибирование пролиферации (IC) выражали, как показано ниже:

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Значения OD являются средними значениями 4 экспериментальных измерений.

- IC50 : концентрация лекарства для получения 50% ингибирования клеточной пролиферации.

Кривые доза-ответ строили, используя XLFit 3 (IDBS, Великобритания). Значения определения IC50 вычисляли, используя программное обеспечение XLFit 3 на основании полулогарифмических кривых. Были получены как индивидуальные значения определения IC50, так и значения среднего и СО (стандартного отклонения).

4.2. Индекс устойчивости (RI)

Индекс устойчивости вычисляли, используя следующую формулу:

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685

Индекс устойчивости вычисляли для каждого соединения для каждой пары чувствительных и устойчивых клеточных линий. Индивидуальный индекс устойчивости вычисляли, когда значения IC50 обеих линий, чувствительной и соответствующей устойчивой, определяли в пределах одного и того же эксперимента. Кроме того, также вычисляли индекс устойчивости как отношение средних значений IC50, полученных в трех независимых экспериментах.

5. Результаты

5.1.LTX-302

Все тридцать семь (37) протестированных опухолевых клеточных линий человека были чувствительны к соединению LTX-302 при значениях IC50 в диапазоне от 4,83±0,96 мкМ до 20,09±4,07 мкМ для клеточных линий T-47D и Нер G2 соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-302, полученное на 37 опухолевых клеточных линиях, составляло 12,05±4,27 мкМ при медианном значении 11,70 мкМ. Среднее значение IC50, полученное для нормальной клеточной линии (HUV-EC-C), было выше, чем для любой из опухолевых клеточных линий.

Клеточные линии гематологических раков и раков легкого были наиболее чувствительны к соединению LTX-302 (медианные значения IC50 7,96 мкМ (n=7) и 9,02 мкМ (n=3) для клеточных линий гематологических раков и раков легкого, соответственно), тогда как клеточные линии раков печени были наиболее устойчивы (медианное значение IC 50 17,84 мкМ, n=2).

Активность соединения LTX-302 оказалась несколько сниженной за счет приобретенной устойчивости к доксорубицину, что проявлялось в значениях RI обеих клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr (1,31 и 1,23 для клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr соответственно). Напротив, активность соединения LTX-302 оказалась повышенной за счет приобретенной устойчивости к цисплатину, что проявлялось в значении RI 0,33 для клеточной линии IGROV-1/CDDP.

5.2. LTX-313

Все тридцать семь (37) протестированных опухолевых клеточных линий человека были чувствительны к соединению LTX-313 при значениях IC50 в диапазоне от 4,01±0,39 мкМ до 18,49±4,86 мкМ для клеточных линий RPMI 8226 и U-87 MG соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-313, полученное на 37 опухолевых клеточных линиях, составляло 9,60±3,73 мкМ при медианном значении 8,83 мкМ. Среднее значение IC50, полученное для нормальной клеточной линии (HUV-EC-C), было выше, чем для любой из опухолевых клеточных линий.

Клеточные линии гематологических раков были наиболее чувствительны к соединению LTX-313 (медианное значение IC50 7,04 мкМ, n=7), тогда как клеточные линии раков печени были наиболее устойчивы (медианное значение IC50 13,71 мкМ, n=2).

Активность LTX-313 оказалась не модифицированной за счет приобретенной устойчивости к доксорубицину, что проявлялось значениями RI клеточных линий CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR и MCF-7/mdr (0,76, 1,16 и 1,24 для клеточных линий CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR и MCF-7/mdr соответственно). Напротив, активность соединения LTX-313 оказалась повышенной за счет приобретенной устойчивости к цисплатину, что проявлялось в значении RI 0,49 для клеточной линии IGROV-1/CDDP.

5.3. LTX-315

Все тридцать семь (37) протестированных опухолевых клеточных линий человека были чувствительны к соединению LTX-315 при значениях IC50 в диапазоне от 1,18±0,25 мкМ до 7,16±0,99 мкМ для клеточных линий T-47D и SK-OV-3 соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-315, полученное на 37 опухолевых клеточных линиях, составляло 3,63±1,45 мкМ при медианном значении 3,27 мкМ. Среднее значение IC 50, полученное для нормальной клеточной линии (HUV-EC-C), было выше, чем для любой из опухолевых клеточных линий.

Клеточные линии раков молочной железы, гематологических раков и раков легкого были наиболее чувствительны к соединению LTX-315 (медианные значения IC50 2,45 мкМ (n=5), 2,60 мкМ (n=7) и 2,83 мкМ (n=3) для клеточных линий раков молочной железы, гематологических раков и раков легкого соответственно), тогда как клеточные линии раков печени были наиболее устойчивы (медианное значение IC50 5,86 мкМ, n=2).

Активность соединения LTX-315 оказалась несколько сниженной за счет приобретенной устойчивости к доксорубицину, что проявлялось значениями RI клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr (1,45 и 1,12 для клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr соответственно). Напротив, активность соединения LTX-315 оказалась повышенной за счет приобретенной устойчивости к цисплатину, что проявлялось в значении RI 0,50 для клеточной линии IGROV-1/CDDP.

5.4. LTX-320

Все тридцать семь (37) протестированных опухолевых клеточных линий человека были чувствительны к соединению LTX-320 при значениях IC50 в диапазоне от 3,46±0,22 мкМ до 16,64±3,15 мкМ для клеточных линий T-47D и Нер G2 соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-320, полученное на 37 опухолевых клеточных линиях, составляло 7,58±2,79 мкМ при медианном значении 6,92 мкМ. Среднее значение IC 50, полученное для нормальной клеточной линии (HUV-EC-C), было выше, чем для любой из опухолевых клеточных линий.

Клеточные линии гематологических раков, раков молочной железы, почки и головного мозга были наиболее чувствительны к соединению LTX-320 (медианные значения IC50 6,04 мкМ (n=7), 6,60 мкМ (n=5), 6,60 мкМ (n=2) и 6,92 мкМ (n=3) для клеточных линий гематологических раков, раков молочной железы, почки и головного мозга соответственно), тогда как клеточные линии раков печени были наиболее устойчивы (медианное значение IC50 11,46 мкМ, n=2).

Активность соединения LTX-320 оказалась не модифицированной за счет приобретенной устойчивости к доксорубицину, что проявлялось значениями RI клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr (0,90 и 1,19 для клеточных линий HL-60/ADR и MCF-7/mdr соответственно). Напротив, активность соединения LTX-320 оказалась повышенной за счет приобретенной устойчивости к цисплатину, что проявлялось в значении RI 0,49 для клеточной линии IGROV-1/CDDP.

5.5. LTX-329

Все тридцать семь (37) протестированных опухолевых клеточных линий человека были чувствительны к соединению LTX-329 при значениях IC50 в диапазоне от 2,43±0,34 мкМ до 16,90±1,18 мкМ для клеточных линий T-47D и U-87 MG соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-329, полученное на 37 опухолевых клеточных линиях, составляло 8,17±3,20 мкМ при медианном значении 7,89 мкМ. Среднее значение IC50, полученное для нормальной клеточной линии (HUV-EC-C), было выше, чем для любой из опухолевых клеточных линий.

Клеточные линии раков молочной железы и гематологических раков были наиболее чувствительны к соединению LTX-329 (медианные значения IC50 4,92 мкМ (n=5) и 5,26 мкМ (n=7) для клеточных линий раков молочной железы и гематологических раков), где клеточные линии раков яичника были наиболее устойчивы (медианное значение IC50 13,37 мкМ, n=4).

Активность LTX-329 оказалась не модифицированной за счет приобретенной устойчивости к доксорубицину, что проявлялось значениями RI клеточных линий CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR и MCF-7/mdr (0,76, 0,80 и 1,07 для клеточных линий CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR и MCF-7/mdr соответственно). Напротив, активность соединения LTX-329 оказалась повышенной за счет приобретенной устойчивости к цисплатину, что проявлялось в значении RI 0,46 для клеточной линии IGROV-1/CDDP.

5.6. Общие комментарии

Клеточная линия рака молочной железы T-47D является наиболее чувствительной клеточной линией для любого тестируемого соединения LTX.

Клеточные линии гематологических раков являются наиболее чувствительным гистологическим типом для всех пяти протестированных соединений, тогда как клеточные линии раков печени и яичника находятся среди наиболее устойчивых клеточных линий.

Все пять протестированных соединений проявляли самую высокую активность на клеточной линии IGROV-1/CDDP (устойчивой к цисплатину), большую, чем на родительской клеточной линии рака яичника IGROV-1. Устойчивость к доксорубицину, по-видимому, несколько снижает активность соединений LTX.

Соединение LTX-315 является наиболее эффективным соединением из пяти протестированных соединений.

6. ВЫВОДЫ

- Все пять протестированных соединений (то есть LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 и LTX-329) проявляли цитолитическую активность против 37 протестированных раковых клеточных линий человека при значениях IC50 в диапазоне от микромолярного до десятых долей микромоль.

- Соединение LTX-315 является наиболее эффективным протестированным соединением со значениями IC50 от 1 до 5 микромоль на всех 37 протестированных раковых клеточных линиях человека.

Пример 2

Исследование цитотоксической активности in vitro 5 тестируемых соединений против панели из 10 клеточных линий лимфомы

1. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

- Определить концентрации пяти новых соединений для получения 50% ингибирования пролиферации (IC50) против панели из 10 клеточных линий лимфомы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Тестируемые вещества

2.1.1. Тестируемые вещества

- Тестируемые вещества, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 и LTX-329 (см. таблицу 1) представлены в порошкообразной форме.

2.1.2. Положительный контроль

- В качестве положительного контроля использовали Тритон Х-100, поставляемый фирмой Oncodesign (Дижон, Франция) от Sigma (Сен-Кантен-Фалавье, Франция).

2.1.3. Растворитель лекарства и условия хранения

- Соединения хранили при 4°С. Сначала порошок растворяли в культуральной среде без сыворотки (RPMI 1640, Lonza, Вервье, Бельгия) и дополнительно разводили, используя культуральную среду без сыворотки, до достижения соответствующих разведении. Исходный раствор не хранили и готовили свежий на сутки эксперимента.

- 1% (конечная концентрация) Тритон Х-100 был получен путем разведения с использованием культуральной среды.

2.2. Опухолевые клеточные линии и условия культивирования

2.2.1. Опухолевые клеточные линии

Раковые клеточные линии и культуральные среды были приобретены и поставлены фирмой Oncodesign.

Клеточные линии ПроисхождениеИсточник нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
КРОВЬ
1Daudi Лимфосаркома Беркитта, В клетки, периферическая кровьATCCa нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
2 Hs 445Лимфома Ходжкина, лимфатический узелАТСС нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
3 KARPAS-299Анапластическая крупнокпеточная лимфома, Т клетки, периферическая кровь DSMZbнонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
4 MinoЛимфома из клеток мантийной зоны, периферическая кровьАТСС нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
5 NAMALWAЛимфосаркома Беркитта, В клетки, периферическая кровьАТСС нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
6 RajiЛимфосаркома Беркитта, В клетки, периферическая кровьDSMZ нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
7 RamosЛимфосаркома Беркитта, В клетки, периферическая кровьАТСС нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
8 SU-DHL-1Анапластическая крупнокпеточная лимфома, плевральный выпот DSMZнонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
9 ToledoНеходжкинская лимфома В клеток, периферическая кровьАТСС нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
10 U-937Лимфома, гистиоцитарная, макрофагальная дифференциация, плевральный выпот АТССнонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
а Американская коллекция типовых культур, Манассас, Виргиния, США
b Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen Gmbh, Брауншвейг, Германия

2.2.2. Условия культивирования

Опухолевые клетки выращивали в виде суспензий при 37°С в увлажненной атмосфере (5% CO 2, 95% воздух). Культуральная среда для каждой клеточной линии описана ниже в таблице 3. Для использования в эксперименте клетки подсчитывали в гемоцитометре, и их жизнеспособность оценивали на основании исключения 0,25% трипанового синего.

Таблица 3
Клеточные линииКультуральная средаДобавки
FBS (%)Глюкоза (г/л) Глутамин (мМ)NaPyr (мМ)ГЭПЭС (мМ)
DaudiRPMI 1640 10-2 110
Hs 445RPMI 1640 204,52 110
KARPAS-299RPMI 1640 20-2 --
Mino RPMI 164015 4,521 10
NAMALWA RPMI 1640102,5 21 10
Raji RPMI 164010- 21 10
Ramos RPMI 164010- 21 10
SU-DHL-1 RPMI 164010- 2- -
Toledo RPMI 1640154,5 21 10
U-937 RPMI 164010- 2- -

Обнаружение микоплазмы осуществляли, используя набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert (RTM) Mycoplasma Detection Kit (Lonza) в соответствии с инструкциями изготовителя. Было обнаружено, что все тестируемые клетки отрицательны по заражению микоплазмой.

Опухолевые клетки высевали в 96-луночные микротитрационные планшеты с плоским дном (Nunc, Dutscher, Брюмат, Франция) и инкубировали при 37°С в течение 24 часов перед обработкой 190 мкл культуральной среды без лекарства с добавлением или без добавления 10% FBS.

Плотности перевивания для каждой клеточной линии суммированы ниже в таблице 4:

Таблица 4
Клеточные линии Плотности перевивания (число клеток/лунка)Клеточные линии Плотности перевивания (число клеток/лунка)
1Daudi25000 6Raji 20000
2 Hs445250007 Ramos20000
3KARPAS-299 250008 SU-DHL-125000
4Mino25000 9Toledo 25000
5 NAMALWA1500010 U-93715000

3.2. Определение IC50

Опухолевые клетки инкубировали в течение 4 часов с 10 концентрациями соединений с шагом разведения ¼ с высшей дозой 400 мкМ (диапазон 4×10-4-4×10 -10 М), с 1% (конечная концентрация) Тритон Х-100 в качестве положительного контроля и с культуральной средой без FBS в качестве отрицательного контроля. Клетки (190 мкл) инкубировали в конечном объеме 200 мкл культуральной среды без FBS, содержащей тестируемые вещества, при 37°С в атмосфере 5% CO2.

Было проведено три независимых эксперимента, где каждую концентрацию исследовали в четырех повторах. Контрольные клетки обрабатывали одним растворителем. В конце обработок цитотоксическую активность оценивали с помощью анализа MTS (см. §3.3).

Разведения тестируемого соединения, а также распределение по планшетам, содержащим клетки, проводили, используя систему транспортировки жидкостей Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences S.A.). В соответствии с автоматическим применением тестировали единый диапазон концентраций для любых тестируемых клеточных линий. Диапазон не адаптировали для каждой клеточной линии.

3.3. Анализ MTS

Цитотоксическую активность тестируемого вещества in vitro выявляли путем анализа MTS (BALTROP J.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614), используя новое тетразолиевое соединение (MTS, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) и реагент спаривания электронов, называемый PMS (феназина метосульфат). Подобно МТТ, MTS биологически восстанавливается клетками до продукта формазана, который непосредственно растворим в культуральной среде без обработки, в отличие от МТТ.

По окончании обработки клеток в каждую лунку добавляли 40 мкл фильтрованного через 0,22 мкм фильтр, свежесобранного раствора MTS (20 мл при 2 мг/мл, Ref G1111, Batch 235897, Exp 03/2009, Promega, Шарбонье, Франция) и PMS (1 мл при 0,92 мг/мл, Ref P9625, партия 065К0961, Sigma) в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS, Ref 17-513Q, партия 6МВ0152, Cambrex). Культуральные планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Поглощение (OD) измеряли при 490 нм в каждой лунке, используя множественно меченый счетчик VICTOR3TM 1420 (Wallac, PerkinElmer, Куртабеф, Франция).

4. ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

4.1. Данные IC50 определяли, как в Примере 1

5. РЕЗУЛЬТАТЫ

5.1. LTX-302

Все десять (10) протестированных клеточных линий лимфомы человека были чувствительны к соединению LTX-302 при значениях IC50 в диапазоне от 5,30±2,02 мкМ до 12,54±3,52 мкМ для клеточных линий U-937 и Raji соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-302, полученное на 10 чувствительных клеточных линиях, составляло 8,11±2,44 мкМ при медианном значении 7,53 мкМ.

5.2. LTX-313

Все десять (10) протестированных клеточных линий лимфомы человека были чувствительны к соединению LTX-313 при значениях IC 50 в диапазоне от 3,21±2,81 мкМ до 16,08±4,86 мкМ для клеточных линий Ramos и Raji соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-313, полученное на 10

чувствительных клеточных линиях, составляло 7,05±3,91 мкМ при медианном значении 5,89 мкМ.

5.3. LTX-315

Все десять (10) протестированных клеточных линий лимфомы человека были чувствительны к соединению LTX-315 при значениях IC50 в диапазоне от 1,15±0,42 мкМ до 4,93±1,03 мкМ для клеточных линий U-937 и Raji соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-315, полученное на 10 чувствительных клеточных линиях, составляло 3,01±1,36 мкМ при медианном значении 2,93 мкМ.

5.4. LTX-320

Все десять (10) протестированных клеточных линий лимфомы человека были чувствительны к соединению LTX-320 при значениях IC50 в диапазоне от 2,22±NA мкМ до 11,26±3,42 мкМ для клеточных линий Hs 445 и Raji соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-320, полученное на 10 чувствительных клеточных линиях, составляло 5,03±2,82 мкМ при медианном значении 4,84 мкМ.

5.5. LTX-329

Все десять (10) протестированных клеточных линий лимфомы человека были чувствительны к соединению LTX-329 при значениях IC50 в диапазоне от 2,46±NA мкМ до 8,70±1,70 мкМ для клеточных линий Hs 445 и Raji соответственно.

Среднее значение IC50 для соединения LTX-329, полученное на 10 чувствительных клеточных линиях, составляло 5,76±2,27 мкМ при медианном значении 5,72 мкМ.

5.6. Общие комментарии

Клеточные линии KARPAS-299 и Raji являются наиболее устойчивыми клеточными линиями для любого тестируемого соединения LTX.

Клеточные линии Hs 445, Ramos и U-937 являются наиболее чувствительными клеточными линиями для любого тестируемого соединения LTX.

Соединение LTX-315 является наиболее эффективным соединением из пяти протестированных соединений.

6. ВЫВОДЫ

- Все пять протестированных соединений (то есть LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 и LTX-329) проявляли цитолитическую активность против 10 протестированных клеточных линий лимфомы человека при значениях IC50 в микромолярном диапазоне.

- Соединение LTX-315 является наиболее эффективным протестированным соединением со значениями IC50 от 1 до 5 микромоль на всех 10 протестированных клеточных линиях лимфомы человека.

Пример 3

Гемолитическая активность in vitro

Принцип теста

Измеряли гемолитическую активность пептида LTX-315 против эритроцитов человека.

Материалы и методы

Свежесобранную кровь человека центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут с целью выделения эритроцитов. Эритроциты (RBC) промывали три раза ФСБ [35 мМ фосфатный буфер с 150 мМ NaCl, pH 7,4] путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и доводили до 10% гематокрита ФСБ. Растворы LTX-315 добавляли до получения диапазона конечной концентрации пептида от 1200 мкг/мл до 1 мкг/мл и концентрации RBC 1%. Полученную в результате суспензию инкубировали при встряхивании в течение одного часа при 37°С. После инкубации суспензию центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 минут, и мониторинг высвобожденного гемоглобина проводили путем измерения поглощения супернатанта при 405 нм. ФСБ использовали в качестве отрицательного контроля и принимали как не вызывающий гемолиз. 0,1% Тритон использовали в качестве положительного контроля и принимали как вызывающий полный гемолиз.

Тестируемое вещество: LTX-315

Референсные вещества: ФСБ (отрицательный контроль) и Тритон Х-100 (положительный контроль)

Компоненты реакционных смесей: LTX-315, 10% Тритон Х-100, ФСБ и RBC (10% гематокрит)

КонцентрацияФСБ (мкл)RBC (мкл) LTX-315/Тритон Х-100 (мкл)
Отрицательный контроль63070 -
Положительный контроль62370 7
1200 15050 300 (исходный раствор 2 мг/мл)
100020050 250 (исходный раствор 2 мг/мл)
500325 50125 (исходный раствор 2 мг/мл)
100595 7035 (исходный раствор 2 мг/мл)
50 612,57017,5 (исходный раствор 2 мг/мл)
10 5607070 (исходный раствор 0,1 мг/мл)
1 623707 (исходный раствор 0,1 мг/мл)

Способ оценки:

Мониторинг высвобожденного гемоглобина проводили по поглощению супернатанта при 405 нм, и процент гемолиза вычисляли по уравнению:

% Гемолиза=[(А405 LTX-315-A 405 ФСБ)/(А405 0,1% Тритон Х-100-А405 ФСБ)]×100

Концентрацию LTX-315, соответствующую 50% гемолизу (EC50), определяли на основании кривой доза-ответ.

Результаты

Среднее значение пяти различных экспериментов со стандартным отклонением представлено ниже. Эти данные также представлены на фиг.1. На фиг.1 показано, что LTX-315 имеет среднее значение EC50 выше 1200 мкг/мл (833 мкМ).

Концентрация LTX-315 (мкг/мл) Средняя гибель клеток (%)Стандартное отклонениеЧисло параллелей
120037,7 8,14453
100038,29,5760 5
500 20,47,8613 5
100 3,61,14025
501,6 0,54775
100,6 0,89445
10,0 0,0005

Пример 4

Фармакодинамические эффекты относительно опухолей лимфомы В-клеток мыши у мышей

Принцип теста

Целью исследования было изучение эффекта LTX-315 при различных уровнях дозы на лимфому В-клеток мыши А20 у мышей.

Материалы и методы

Введение осуществляли путем интратуморальной инъекции LTX-315, растворенного в стерильном физиологическом растворе.

Самок мышей инокулировали подкожно в живот 5 миллионами клеток А20 мыши (АТСС, LGC Promochem AB, Миддлсекс, Англия) в объеме 50 мкл. Мышей делили на четыре группы (подробности см. в таблице 5 ниже). Интратуморальную обработку начинали, когда опухоли достигли желаемого размера 5 мм в диаметре (минимум 20 мм2).

Было исследовано три уровня дозы LTX-315, 1 мг (группа 1), 0,5 мг (группа 2) и 0,25 мг (группа 3) на инъекцию. Объем составлял 50 мкл для всех инъекций. LTX-315 растворяли в стерильном 0,9% водном растворе NaCl. Этот растворитель использовали в качестве контроля (группа 4). Все четыре группы получали три инъекции.

Мониторинг мышей в процессе исследования проводили путем измерения опухолей и взвешивания животных регулярно. Мышей наблюдали до достижения максимального опухолевого груза 125 мм 2 или до появления серьезных вредных эффектов (то есть образования ран при повторных обработках в течение периода наблюдения), затем мышей умерщвляли. Для измерений размера опухоли использовали цифровой калибр, а взвешивание и физическое обследование использовали в качестве контроля состояния здоровья.

Животные: Самки мышей Balb/c без специфичных патогенов, возраст 6-8 недель, поставляемые Harlan (Англия, ОК)

Условия содержания животных: Животных держали на стандартном лабораторном корме и воде.

Средняя масса тела, доза, путь и режим обработки приведены в таблице 5 ниже.

Таблица 5
ГруппаЧисло животных Исходная масса тела (г; среднее ±СО) ОбработкаДоза ПутьРежим (Сутки*)
1720,36±0,56 Один раз в сутки1 мг в 50 мкл (20 мг/мл)Интратуморально 1, 2, 3
2 719,96±0,38 Один раз в сутки0,5 в 50 мкл (10 мг/мл)Интратуморально 1, 2, 3
3 920,11±0,33 Один раз в сутки0,25 в 50 мкл (5 мг/мл)Интратуморально 1, 2, 3
4 719,73±0,40 Один раз в сутки50 мкл 0,9% NaCl в H2OИнтратуморально 1, 2, 3
* Сутки 1 являются первыми сутками обработки

Результаты:

Противоопухолевый эффект различных обработок представлен в виде среднего размера опухоли в таблице 6 ниже.

Таблица 6
ОбработкаСредний размер опухоли (мм 2) на сутки 1*Средний размер опухоли (мм2) на сутки 4Средний размер опухоли (мм2) на сутки 9Средний размер опухоли (мм2) на сутки 14
Группа 125,82±0,80 03,70±2,40 12,43±7,87
Группа 2 22,03±0,630 11,41±4,6961,08±23,84
Группа 321,25±0,64 20,60±5,7168,49±12,74 69,42±17,70
Группа 422,79±0,68 45,51±5,2757,79±4,39 84,70±7,35
* Размер опухоли перед началом обработки на первые сутки обработки

Степень противоопухолевого ответа в различных группах обработки суммирована в таблице 7 ниже.

Таблица 7
Группа животныхОтвет опухоли Рецидив опухоли Отсутствие опухоли по окончании наблюдения
нет ответачастичный ответ полный ответ
1 042,8%57,2% 25% (1/4)42,8% (3/7)
20 71,42%28,57%0% (0/2)28,57% (2/7)
377,77%22,22% 0% (0/9)NA 0
4100% NANA NANA

Обсуждение/Выводы

В группе 3, получающей самую низкую дозу LTX-315 (0,25 мг/доза) наблюдают небольшой ингибиторный эффект в течение первых суток. В группе 1 и группе 2, получающих дозы LTX-315 1,0 мг/доза и 0,5 мг/доза соответственно, все животные проявляли частичный или полный ответ опухоли. Было обнаружено, что противоопухолевая активность приводит в результате к полному ответу опухоли у 3 из 7 обработанных мышей на группу, получающую оптимальную дозу (группа 1).

В целом более сильный некроз и большее образование ран наблюдали в группе 1 по сравнению с двумя другими группами. Кроме образования ран, никаких других вредных эффектов или токсических эффектов не наблюдали ни в одной из групп животных.

Как 1 мг, так и 0,5 мг LTX-315 демонстрировали сильный и быстрый противоопухолевый эффект в первый период исследования. Однако по мере продвижения исследования рецидив наступает у большего количества животных в группе 2, чем в группе 1.

Пример 5

Эффект LTX-315 на опухоли карциномы ободочной кишки мыши CT26WT у мышей

Материалы и методы

Введение осуществляли путем интратуморальной инъекции LTX-315, растворенного в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl в стерильной воде).

Каждую из всего 40 самок мышей инокулировали пятью миллионами клеток CT26WT мыши (АТСС, LGC Promochem AB, Борас, Швеция) подкожно на поверхности живота в объеме 50 мкл. Мышей делили на пять групп, по 8 мышей в каждой группе. Когда опухоли достигали желаемого размера 20 мм2, начинали обработку интратуморальной инъекцией. Группу 1 обрабатывали один раз на первые сутки, группу два на сутки 1 и 2, группу три на сутки 1 и 3 и группу четыре на сутки 1, 2 и 3. Все ежесуточные обработки представляли собой одну однократную инъекцию 1,0 мг LTX-315, растворенного в 50 мкл (20 мг/мл). Группу пять обрабатывали 50 мкл растворителя для LTX-315 (группа 5).

Мониторинг мышей проводили в течение исследования путем измерения опухолей (с помощью цифрового калибра) и регулярно взвешивали животных. Мышей наблюдали до достижения максимального опухолевого груза 125 мм2 или до появления серьезных вредных эффектов (то есть образования ран в результате повторных инъекций), затем мышей умерщвляли. Взвешивание и физическое обследование использовали в качестве контроля состояния здоровья.

Животные: Самки мышей Balb/c без специфичных патогенов, возраст 6-8 недель, поставляемые Harlan (Англия, ОК)

Условия содержания животных: Стандартные условия вивария.

Средняя масса тела, доза, путь и режим обработки приведены в таблице 8 ниже.

Таблица 8
ГруппаЧисло животных Исходная масса тела (г; среднее ±СО) ОбработкаДоза ПутьРежим (Сутки*)
1819,00±1,087 Один раз в сутки1 мг в 50 мкл (20 мг/мл)Интратуморально 1
2 819,56±1,087 Один раз в сутки1 мг в 50 мкл (20 мг/мл) Интратуморально1, 2
38 19,41±0,8999Один раз в сутки1 мг в 50 мкл (20 мг/мл) Интратуморально1, 3
48 19,00±0,9396Один раз в сутки1 мг в 50 мкл (20 мг/мл) Интратуморально1, 2, 3
5 (контроль) 818,71±0,7868 Один раз в сутки50 мкл 0,9% NaCl в H 2OИнтратуморально 1, 2, 3
* Сутки 1 являются первыми сутками обработки

Результаты:

Противоопухолевый эффект различных обработок представлен в виде среднего размера опухоли в таблице 9 ниже.

Таблица 9
ОбработкаСредний размер опухоли (мм 2) на сутки 1*Средний размер опухоли (мм2) на сутки 6Средний размер опухоли (мм2) на сутки 10Средний размер опухоли (мм2) на сутки 17
Группа 122,69±0,4070 4,343±2,2957,171±4,035 3,712±3,712
Группа 222,90±1,155 1,458±1,4585,058±4,014 6,644±3,430
Группа 321,43±1,141 2,983±2,98310,85±7,553 0,00±0,00
Группа 424,09±1,653 0,00±0,000,00±0,00 1,308±1,308
Группа 5 21,39±1,68333,77±3,168 48,37±7,03540,64±19,77
* Размер опухоли перед началом обработки на первые сутки обработки

Полный ответ опухоли наблюдали у подавляющего большинства всех животных, обработанных LTX-315. Степень противоопухолевого ответа в различных группах обработки суммирована в таблице 10 ниже.

Таблица 10
Группа животныхОтвет опухоли Рецидив опухоли Отсутствие опухоли по окончании наблюдения
нет ответачастичный ответ полный ответ
1 027,5%62,5% 20% (1/5)50% (4/8)
20 12,5%87,5%71% (5/7)25% (2/8)
312,5%0 87,5%29% (2/7) 62,5% (5/8)
4 00100% 37,5% (3/8)62,5% (5/8)
5100%NA NANANA

Обсуждение/Выводы

Обработку начинали, когда опухоли достигали желаемого размера минимум 20 мм2, и животных умерщвляли, когда опухоли достигали максимального опухолевого груза 125 мм2.

Окончание исследования определяли как сутки 17, когда шесть из восьми контрольных животных (группа 5) были умерщвлены.

Все режимы обработки LTX-315 привели в результате к сильному противоопухолевому эффекту против CT26WT.

Наблюдали суммарно 27 из 32 обработанных животных с полным ответом опухоли и четырех с частичным ответом. Только одно животное (в группе 3) не реагировало на обработку. Представленные результаты показывают, что все четыре обработанных группы имели очень сходный общий противоопухолевый ответ, и данные также указывают на то, что степень рецидива опухоли была выше в группе 2, чем в группе 1, 3 и 4. Кроме того, меньшее количество животных без опухоли по окончании исследования наблюдали в группе 2 (фиг.2).

Некроз и полный ответ опухоли наблюдали во всех обработанных группах. В группе 1 четверо из восьми животных, в группе 2 двое из восьми животных, в группе 3 пять из восьми животных и в группе 4 пять из восьми животных показали полный ответ опухоли. На этой стадии опухоль была полностью некротической, и раневая корка образовалась на месте опухоли.

Некроз в сайте опухоли был виден во всех группах обработки. В целом животные в группе 2, 3 и 4 показали больший некроз, образование раны и корки, чем животные в группе 1, которые получили только одну инъекцию LTX-315. Животные группы 4, которые получили три инъекции, показали наибольший некроз, образование раны и корки. Различие в некрозе в группе 1 и в группе 4 было достаточно большим, но животные, получившие большее число обработок, оказались хорошо защищенными. Никаких токсических или других вредных эффектов, кроме локальной некротической ткани и образования раны, не наблюдали ни в одной из обработанных групп животных.

Все четыре протестированных режима обработки LTX-315 продемонстрировали сильный противоопухолевый эффект против опухолей CT26WT мыши.

Количество некроза, образования раны и корки было пропорционально числу проведенных обработок LTX-315.

Пример 6

Активность LTX-315 против чувствительных раковых клеток и раковых клеток с множественной лекарственной устойчивостью и нормальных клеток человека

Клеточная линия Чувствительность к лекарствуПроисхождение IC50 мкМ
HL-60Чувствительна Острый промиелоцитарный лейкоз2,07
HL-60/ADR УстойчиваОстрый промиелоцитарный 3,01
нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 лейкознонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685
MCF-7 ЧувствительнаКарцинома молочной железы 1,94
MCF-7/mdr УстойчиваКарцинома молочной железы1,96
IGROV-1Чувствительна Карцинома яичника6,37
IGROV-1/CDDPУстойчива Карцинома яичника3,19
K-562Чувствительна Хронический миелоидный лейкоз3,27
K5627/Gleevec УстойчиваХронический миелоидный лейкоз 2,98
HUV-EC-C -Нормальные эндотелиальные клетки23
RBC-Эритроциты 833

Приведенные выше данные показывают широкий спектр активности LTX-315 против различных раковых клеточных линий и, что важно, значительно более слабый цитотоксический эффект на нормальные клетки человека.

Пример 7

Повторная провокация клетками лимфомы В-клеток мыши А20 и клетками карциномы ободочной кишки мыши CT26WT у мышей с полной регрессией опухоли

В данном исследовании подразумевали изучить эффекты опухолевого роста у животных, которые ранее показали полную регрессию опухоли, после обработки LTX-315.

Методы: Самок мышей Balb-c (n=4), ранее обработанных LTX-315, 1 мг, или (n=9); ранее обработанных LTX-315 0,5 или 1 мг, повторно инокулировали (s.c. В области живота) либо клетками лимфомы В-клеток мыши А20, либо клетками карциномы ободочной кишки мыши CT26WT (5 миллионов) соответственно, через 6 недель после первоначальной обработки LTX-315. Мониторинг опухолевого роста осуществляли вплоть до 36 суток после повторной инокуляции.

Значимое ингибирование (Р<0,006) опухолевого роста наблюдали у всех 4 мышей, ранее обработанных LTX-315 (1 мг) в исследовании R315-03, по сравнению с контрольными животными (фиг.2), и, хотя рецидив наблюдали у 1 животного 3 недели спустя, полную регрессию опухоли наблюдали у других 3 мышей (фиг.3).

У 9 мышей, ранее обработанных LTX-315 (0,5 или 1 мг), ингибирование (Р<0,01) опухолевого роста наблюдали по сравнению с контрольными животными (фиг.3). Резкое падение размера опухоли на фиг.20 после суток 18 объясняется гибелью 6 животных, несущих большие опухоли. Ингибирование наблюдали у 7 мышей, и полную регрессию у 2 из животных (фиг.5).

Взятые вместе, эти данные позволяют предположить, что полная регрессия опухоли после первоначальной обработки солидных опухолей мышей (лимфома В-клеток мыши А20 или карцинома ободочной кишки мыши CT26WT) LTX-315 привела в результате к формированию эндогенной долговременной защиты против роста тех же опухолей после повторной инокуляции. Ингибирование опухолевого роста было более выраженным у животных, несущих опухоли лимфомы В-клеток А20, по сравнению с животными, несущими опухоли ободочной кишки CT26WT.

Пример 8

Иммунологические эффекты LTX-315 в модели лимфомы В-клеток мыши А20. Пилотное исследование адаптивного переноса спленоцитов in vivo.

Данное исследование было предпринято, чтобы изучить, может ли долговременная защита против роста тех же опухолей после повторной инокуляции у животных, наблюдаемых в исследовании R315-33, пассивно передаваться реципиентам, ранее не подвергнутым воздействию, посредством спленоцитов, взятых у обработанных LTX-315 животных-доноров.

Каждую из десяти самок мышей Balb/c (n=32) инокулировали клетками А20 (5 миллионов на 50 мкл s.c.) на поверхность живота. Как только опухоли достигали 20 мм2, их инъецировали LTX-315 (1 мг) интратуморально, один раз в сутки в течение 3 суток, в объеме 50 мкл. Затем проводили мониторинг размера опухоли (мм2) и массы тела, и дополнительную инъекцию LTX-315 вводили, если наблюдали какой-либо повторный рост опухоли. Затем мышей, показавших полную регрессию опухоли, умерщвляли и использовали в качестве доноров для переноса спленоцитов, тогда как мышей-доноров, не подвергнутых воздействию, использовали в качестве контролей. Селезенки от донорных мышей вырезали и выделяли клетки. Мышей-реципиентов, не подвергнутых воздействию, облучали и делили на 2 группы. Группа 1 получила изолированные спленоциты от пролеченных мышей, тогда как группа 2 получила изолированные спленоциты от мышей, не подвергнутых воздействию. Свежеприготовленные клетки инъецировали (20×10 6 на 100 мкл) через хвостовую вену. Через двадцать четыре часа мышей-реципиентов инокулировали 5 миллионами клеток лимфомы В-клеток мыши А20 на поверхности живота, как описано выше. Мониторинг размера опухоли и массы тела проводили до достижения максимального опухолевого груза ~125 мм2 или появления серьезных вредных эффектов (то есть образования раны во время некроза опухолевой ткани), и в этот момент животных умерщвляли.

Ингибирование опухолевого роста наблюдали у облученных мышей, которые получили спленоциты, выделенные из животных, которые показали полную регрессию опухоли после обработки LTX-315, по сравнению с контрольными животными, которые получили спленоциты из доноров, не подвергнутых воздействию (фиг.6). Также было отмечено существование отличия по цвету и текстуре опухолей у реципиентов спленоцитов от LTX-315-обработанных мышей, позволяющего предположить немедленный воспалительный ответ.

На основании этих наблюдений полученные данные свидетельствуют об адаптивном иммунном ответе у животных, которые получили спленоциты от животных, ранее показавших полную регрессию опухолей лимфомы В-клеток А20 после обработки LTX-315. Эти данные позволяют предположить, что обработка LTX-315 может придавать долговременную защиту против специфичных опухолей за счет вызова иммунного ответа.

Пример 9

Целью исследования было изучение противоракового эффекта профилактической вакцинации клетками лимфомы А20, лизированными 10 мг/мл LTX-315:

(i) одной; и

(ii) в комбинации с 20 мг/мл LTX-315, инъецированным в сайт вакцинации перед вакциной.

Суммарно использовали два различных режима обработки.

Введение осуществляли путем подкожной инъекции LTX-315, растворенного в ростовой среде, содержащей клетки лимфомы А20. Смесь клеток и LTX-315 оставляли на 30 мин перед инъекцией, чтобы обеспечить полный лизис раковых клеток.

Группе 1 ("вакцина") мышей инъецировали подкожно на поверхность живота 50 мкл смеси из десяти миллионов клеток мышей А20 (АТСС, LGC Promochem АВ, Борас, Швеция) и 10 мг/мл LTX-315 ("лизат А20"). Группу 2 ("вакцина + адъювант") мышей обрабатывали, как для группы 1, но дополнительно давали 25 мкл 20 мг/мл LTX-315 подкожно в сайте вакцинации за 5 минут до инъекции лизата А20. Группа 3 ("контроль") мышей не получала никакой обработки.

Через шесть недель после обработки всех мышей инокулировали 5 миллионов жизнеспособных клеток лимфомы В-клеток мыши А20 подкожно на поверхности живота в объеме 50 мкл.

Мониторинг мышей в течение исследования проводили путем измерения размера опухоли и регулярного взвешивания животных. Мышей наблюдали до достижения максимального опухолевого груза ~130 мм2, и в этот момент мышей умерщвляли.

Материалы и методы

Животные: Самки мышей Balb/c без специфичных патогенов, возраст 6-8 недель, поставляемые Marian Laboratories (Англия, OK; www.harlan.com)

Условия содержания животных: Стандартные условия вивария в Университете Tromsнонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 .

Тестируемое вещество: Клетки А20 мыши, лизированные LTX-315 (партия № 1013687), и один LTX-315 (партия № 1013687).

Приготовление тестируемого вещества: 10×106 клеток А20 добавляли к 50 мкл 10 мг/мл LTX-315/растворитель ("лизат А20"). Тестируемое вещество было готово к применению через 30 минут после смешивания. Один LTX-315 растворяли в 0,9% NaCl в стерильной H2O.

Растворитель: RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамином или 0,9% NaCl в стерильной H2O.

Референсные вещества: не применялись

Обработка контролей: не применялась

Метод оценки: Измерения размера опухолей и контроль состояния здоровья путем взвешивания и обследования.

Дополнительные данные метода: цифровой калибр использовали для измерений размера опухолей, и взвешивание и физическое обследование использовали в качестве контроля состояния здоровья.

Средняя масса тела, доза, путь и режим обработки показаны в таблице 11 (ниже).

Таблица 11
ГруппаЧисло животных Исходная масса тела (г; среднее ±СО) ОбработкаЧисло клеток и доза Путь
1 817,31±0,3815 Однократно10×106 клеток А20 в 50 мкл LTX-315(10 мг/мл)Подкожно
28 17,14±0,4633Однократно 0,25 мкл LTX-315 (20 мг/мл) + 10×106 клеток А20 в 50 мкл LTX-315 (10 мг/мл)Подкожно
37 17,29±0,3020Не обработан Не применялисьНе применялся

Результаты:

Противораковый эффект различных обработок представлен в виде среднего размера опухоли в таблице 12 ниже, и графическое представление данных приведено на фиг.7. В таблице 12 сутки 1 представляли собой сутки инокуляции жизнеспособных клеток А20 через шесть недель после вакцинации.

Таблица 12
ОбработкаСредний размер опухоли (мм 2) на сутки 4Средний размер опухоли (мм2) на сутки 11Средний размер опухоли (мм2) на сутки 16Средний размер опухоли (мм2) на сутки 21
Группа 19,515±1,528 20,44±6,19136,21±10,30 55,89±15,27
Группа 27,315±2,231 17,13±5,07829,13±7,903 47,16±13,54
Группа 310,25±3,100 34,49±8,29856,04±8,339 82,89±14,06

Обсуждение/Выводы:

Инокуляцию клеток лимфомы В-клеток мыши осуществляли через 6 недель после проведения обработки (сутки 1), и животных умерщвляли, когда опухоли достигли максимально допустимого опухолевого груза ~130 мм2.

Результаты показывают, что опухоли развивались медленнее в обеих группах обработки LTX-315/А20-лизат по сравнению с контрольной группой. Медианное выживание в группе 1 составляло 28 суток, 33 суток для группы 2 и 25 суток для контрольной группы (группы 3). Увеличение медианного выживания составляло 12% для группы 1 и 35% для группы 2 по сравнению с контрольной группой (группа 3).

Эти данные указывают на пролонгированное выживание обработанных групп по сравнению с необработанной контрольной группой. На сутки 34, когда последнее животное в контрольной группе было умерщвлено, 50% животных в группе 2 были еще живы, тогда как 37,5% животных в группе 1 были все еще живы. Окончание исследования было определено как сутки 60. В этот момент времени суммарно 3 из 16 обработанных животных имели полную регрессию первоначально развивающейся опухоли, и у них опухоль отсутствовала. По окончании исследования наблюдали, что у 25% животных из группы 1 и 12,5% животных из группы 2 опухоль отсутствовала.

В макроскопическом масштабе существовали морфологические отличия между обработанными группами (группой 1 и 2) по сравнению с необработанной контрольной группой (группой 3). Наблюдали, что развивающиеся опухоли в двух группах обработки белее и тверже, чем наблюдаемые в контрольной группе. Это открытие вместе с замедленной скоростью роста опухолей указывает на то, что иммунный ответ против клеток А20 был индуцирован вакцинацией смесью LTX-315 и лизированных клеток А20.

Следовательно, LTX-315 может иметь двойное применение путем лизиса опухолевых клеток и индукции высвобождения сигналов опасности из нормальных клеток в сайте инъекции.

Понятно, что это не предназначено для ограничения изобретения только вышеописанными конкретными формами осуществления, но различные формы осуществления, модификации и усовершенствования легко очевидны обычному специалисту в данной области техники без отклонения от объема прилагаемой формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы:

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 или

нонапептид с противоопухолевой активностью, патент № 2503685 ;

где С представляет собой катионную аминокислоту и L представляет собой аминокислоту с липофильной группой R, в котором одна из аминокислот, имеющая липофильную группу R, представляет собой не кодируемую генетически аминокислоту, причем это соединение возможно находится в форме фармацевтически приемлемой соли, эфира или амида.

2. Соединение по п.1, где каждая липофильная группа R имеет по меньшей мере 9 неводородных атомов.

3. Соединение по п.1, каждая липофильная группа R имеет по меньшей мере одну циклическую группу.

4. Соединение по п.1, в котором от 1 до 3 из аминокислот с липофильными группами R представляют собой триптофан.

5. Соединение по п.1, которое включает не кодируемую генетически аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из:

2-амино-3-(бифенил-4-ил)пропановой кислоты (бифенилаланин), 2-амино-3,3-дифенилпропановой кислоты (дифенилаланин), 2-амино-3-(антрацен-9-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(нафталин-2-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-(нафталин-1-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-[1,1':4',1''-терфенил-4-ил]-пропионовой кислоты, 2-амино-3-(2,5,7-три-трет-бутил-1Н-индол-3-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-[1,1':3',1''-терфенил-4-ил]-пропионовой кислоты, 2-амино-3-[1,1':2',1''-терфенил-4-ил]-пропионовой кислоты, 2-амино-3-(4-нафталин-2-илфенил)-пропионовой кислоты, 2-амино-3-(4'-бутилбифенил-4-ил)пропановой кислоты, 2-амино-3-[1,1':3',1''-терфенил-5'-ил]-пропионовой кислоты и 2-амино-3-(4-(2,2-дифенилэтил)фенил)пропановой кислоты.

6. Соединение по п.1, имеющее формулу SEQ ID NO:23 (LTX-315), или его соль, эфир или амид.

7. Композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп.1-6 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

8. Композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп.1-6 в комбинации по меньшей мере с одним другим терапевтическим ингредиентом.

9. Соединение по любому из пп.1-6 для применения в качестве противоопухолевого агента.

10. Соединение LTX-315, имеющее последовательность SEQ ID No:23, возможно в форме фармацевтически приемлемой соли, эфира или амида, для применения в качестве адъюванта вакцины.

11. Применение соединения LTX-315, имеющего последовательность SEQ ID No:23, возможно в форме фармацевтически приемлемой соли, эфира или амида, в качестве адъюванта вакцины.

12. Композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая эффективное количество соединения, как определено в п.10, в комбинации по меньшей мере с одной вакциной.

13. Композиция по п.12, где вакцина представляет собой либо лизат опухоли, либо противораковую вакцину, содержащую по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности(ям) из опухоль-ассоциированного антигена(ов).

14. Фармацевтический набор, включающий:

(i) по меньшей мере одну вакцину и

(ii) соединение, как определено в п.10.

15. Фармацевтический набор по п.14, где вакцина представляет собой либо лизат опухоли, либо противораковую вакцину, содержащую по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности(ям) из опухоль-ассоциированного антигена(ов).

16. Фармацевтический набор по п.14, где вакцина представляет собой антивирусную вакцину, содержащую по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности(ям) из вирусного белка(ов).

17. Способ лечения опухоли, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-6 пациенту, нуждающемуся в этом.

18. Способ вакцинации, включающий стадию введения пациенту фармацевтически эффективного количества соединения как определено в п.10 и вакцины.

19. Способ вакцинации по п.18, где вакцина представляет собой либо лизат опухоли, либо противораковую вакцину, содержащую по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности(ям) из опухоль-ассоциированного антигена(ов).

20. Способ вакцинации по п.18, где вакцина представляет собой антивирусную вакцину, содержащую по меньшей мере один белок и/или пептид с аминокислотными последовательностями, соответствующими иммуногенной последовательности(ям) из вирусного белка(ов).


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2503685

patent-2503685.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот

Патенты РФ в классе C07K7/06:
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
конъюгаты, содержащие гидрофильные спейсеры линкеров -  патент 2523909 (27.07.2014)
конъюгаты антагониста пептида аналога бомбезина -  патент 2523531 (20.07.2014)
применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка -  патент 2517190 (27.05.2014)
способ получения дегареликса -  патент 2515555 (10.05.2014)
композиции для лечения боли и/или воспаления -  патент 2515054 (10.05.2014)

Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот

Патенты РФ в классе A61K38/08:
применение пептида актг (4-7)-пгп гепатопротекторного воздействия -  патент 2528741 (20.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
содежащий октреотид состав с замедленным высвобождением со стабильно высоким уровнем воздействия -  патент 2526822 (27.08.2014)
применение опиорфина в качестве психостимулирующего агента -  патент 2526819 (27.08.2014)
способ хирургического лечения острого панкреатита с ранним энтеральным интраоперационным питанием пациента -  патент 2526247 (20.08.2014)
способ лечения болезни альцгеймера -  патент 2526155 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
ингибиторы протеазы вируса гепатита с и их применение -  патент 2523790 (27.07.2014)
применение аналогов соматостатина при менингиоме -  патент 2523416 (20.07.2014)

Класс A61K35/00 Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения

Патенты РФ в классе A61K35/00:
биологический материал, подходящий для терапии остеоартроза, повреждения связок и для лечения патологических состояний суставов -  патент 2529803 (27.09.2014)
способ лечения внебольничной пневмонии у детей -  патент 2529782 (27.09.2014)
способ лечения спаечной болезни -  патент 2529408 (27.09.2014)
способ лечения трофических язв -  патент 2528973 (20.09.2014)
способ комплексного лечения коров при послеродовом эндометрите -  патент 2528916 (20.09.2014)
гепатопротекторное средство из морских водорослей -  патент 2528898 (20.09.2014)
способ лечения больных с онкологическими заболеваниями и/или иммунодепрессиями -  патент 2528877 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом -  патент 2528250 (10.09.2014)

Наверх