средство для лечения кокцидиозов в ветеринарии

Формула изобретения

Средство для лечения заболеваний, вызываемых различными видами простейших, относящихся к подцарству Protozoa, типу Apicomlexa, классу Sporozoa, отряду Coccidiida, семейству Eimeriidae, отличающееся тем, что действующим веществом является - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромид.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится преимущественно к ветеринарии, а именно к новому противопаразитарному средству «Эвей» - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромиду, и может быть использовано в качестве кокцидиостатического препарата.

Кокцидиозы - остро, подостро и хронически протекающие болезни животных, вызываемые различными видами простейших, относящихся к подцарству Protozoa, типу Apicomlexa, классу Sporozoa, отряду Coccidiida, семейству Eimeriidae.

Эймериозы вызываются простейшими, паразитирующими преимущественно в эпителиальных клетках кишечника. В организме больных эймериозом птиц происходит интоксикация продуктами обмена простейших и гнилостной микрофлоры, что ведет к нарушению функций нервной системы, вызывая угнетение животных, вплоть до коматозного состояния, тремора мышц и паралича конечностей. Птицы теряют в весе, мясо переболевших животных имеет низкую питательную ценность и быстро портится при хранении. У птиц снижается яйценоскость. Хозяйства несут большие расходы на приобретение препаратов для лечения, профилактики и проведение дезинвазии помещений. При сильной степени инвазии эймериозы могут вызывать массовую гибель животных [Акбаев М.Ш., Воселеевич Ф.И., Акбаев P.M. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 2008. - 756 с.].

Для лечения эймериозов животных и птиц предложены ряд лекарственных препаратов, обладающих антиэймериозной активностью: химкокцид, салиномицин, байкокс, нитрофурановые (фуракриллин, фуразолан, фуразолидон) и сульфаниламидные препараты (сульфадимезин, сульфадиметоксин, сульфапередозин, норсульфазол, фталазол), а также левомецетин, мономиецин и многие другие [Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос, - 2000. 559 с.].

Несмотря на широкое использование лекарственных препаратов в качестве средств лечения и профилактики эймериозов, получить 100% показатели экстенс- и интесэффективности не удается. Поэтому эти препараты применяются неоднократно. Таким образом, принцип использования антиэймериозных препаратов основан на многократном их применении, что неиндифферентно для любого организма. Многие из них обладают токсическим, раздражающим и иммунодепрессивным действием. Кроме того, длительное применение одного кокцидиостатика приводит к появлению устойчивых видов эймерий, которые вызывают явления дисбактериоза, способствуют угнетению ферментативной активности желудочно-кишечного тракта и могут быть причиной других функциональных изменений в организме животных.

Кроме того, при применении сульфаниламидов могут возникнуть аллергические реакции и другие побочные явления: дерматиты, лейкопения, невриты. Вследствие плохой растворимости сульфаниламиды и особенно продукты их ацетилирования, образующиеся в организме путем замещения водорода аминогруппы остатком уксусной кислоты, могут выпадать в почках в виде кристаллов и закупоривать мочевые пути [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч.2. М., Медицина, 1993, с.688.].

Однако необходимо заметить, что ближайших аналогов заявленного нами изобретения пока не существует, поэтому соответственно в отношении него и нет технического результата.

Следовательно, изыскание новых препаратов и схем их применения для профилактики и лечения эймериоза животных и птиц, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей ветеринарии.

Задачей заявленного технического решения является создание эффективного кокцидиостатического препарата нового поколения, обладающего характерными свойствами:

- очень низкими лечебными дозами препарата «Эвей» - применяется однократно, 10 мг/кг веса животного;

- высокой эффективностью в отношении эймерий, обеспечивающей расширение арсенала известных малоэффективных, токсичных и дорогостоящих средств указанного назначения.

Пример 1. Способ получения препарата «Эвей» на основе трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромида формулы I:

частично воспроизводится по работе американских авторов [Starnes W.H., Lauff J.J. Reactions of a Quinone Methide with Tri-n-butylphosphosphine. J. Org. Chem. Vol.35, N 6, 1970. - P.1978-1986.], однако следует отметить, что в этих работах вообще не изучались биологические свойства соединения формулы I, а в выявленных заявителем из уровня техники патентов других американских ученых аналогичные соединения изучались только в качестве препаратов против ожирения (при этом следует отметить, что эксперимент получился отрицательным) [US Patent 2004/0138301 A1. B.S. Hansen, Т.K. Hansen, S. Tullin, U. Colding-Jordensen. Chemical uncouplers for the treatment of obesity].

Анализ выявленных патентов показал, что всем авторам описанных выше патентов не удалось получить чистых соединений и спектрально подтвердить их индивидуальность, также не удалось измерить и температуру плавления.

Авторам заявленного технического решения, в отличие от авторов приведенных выше патентов, удалось усовершенствовать методику синтеза американских коллег, за счет нахождения и применения оригинального для заявленного технического решения растворителя, а именно заявитель заменил растворитель диэтиловый эфир на более полярный растворитель ацетонитрил, что поспособствовало более полному протеканию реакции. В результате чего заявителю удалось не только выделить спектрально чистое соединение, но и измерить температуру плавления, изучить всеми современными физико-химическими методами исследования, а также вырастить индивидуальные кристаллы и установить структуру соединения формулы I с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА), что не представлялось возможным сделать ранее, при использовании существенно менее полярного растворителя - диэтилового эфира

Пример 2. Изучение кокцидиостатической активности "Эвей" в отношении смешанного эймериоза птиц и животных.

Испытание лечебной эффективности соединения "Эвей" при эймериозе животных и птиц проводили в трех опытах.

Кокцидиостатическая активность препарата исследована в условиях вивария кафедры паразитологии и радиобиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» в августе - сентябре 2011 года на 30 цыплятах в возрасте 20 суток. Цыплят заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (Е. tenella, E. maxima и др.) в дозе 10000 ооцист на голову, после чего их разделили на 3 группы по 10 голов в каждой, с учетом пола и живой массы. Цыплята во время эксперимента содержались в клетках и питались промышленным комбикормом. Через 8 суток после заражения первая группа цыплят получила препарат "Эвей" однократно, в дозе 10 мг/кг веса по действующему веществу (по ДВ). Для сравнения цыплятам второй группы в корм добавляли ампролиум 30%-ный в дозе 240 мг ДВ на кг корма в течение 7 дней. Третья группа цыплят не получала лекарственных препаратов и являлась контрольной. Помет от каждого цыпленка во всех группах исследовали по методу Котельникова и Хренова до лечения и на 3, 7 и 15 сутки после лечения.

Через 7 суток после заражения у цыплят всех групп в пробах помета были выявлены ооцисты кокцидий. У них начали проявляться первые клинические признаки заболевания: угнетение, понижение аппетита. На этом фоне цыплята получали лекарственные препараты. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная эффективность препаратов "Эвей" и «Ампролиума» при лечении эймериоза кур
№ гр.	Количество птиц в группе	ИИ до начала лечения (экз) М±м	Интенсивность инвазии (ИИ), интенсэффективность и экстенсэффективность (ИЭ)
			3 суток			7 суток			15 суток
			ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)	ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)	ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)
1	10	66±2,3	3±0,3	95,5	90	7±0,1	89,4	90	14±0,5	78,8	90
2	10	49±1,6	18±2,3	63,3	60	14±2,1	71,4	80	25±1,1	49	70
3	10	53±1,2	94±1,7	-	0	75±2,5	-	0	150±2,3	-	0

Данные таблицы 1 показывают, что у цыплят экспериментально зараженных эймериозом до лечения интенсивность инвазии колебалась от 49±1,6 до 66±2,3 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Через трое суток после начала лечения в первой группе (препарат "Эвей") интенсивность инвазии составила 3±0,3, а интенсэффективность и экстенсэффективность 95,5 и 90 процентов соответственно.

Через семь суток интенсивность инвазии составила в первой группе 7±0,1, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 89,4 и 90 процентов соответственно.

Во второй группе (препарат сравнения «Ампролиум») интенсивность инвазии на третьи сутки после начала лечения составила 18±2,3. Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения составили 63,3 и 60 процентов соответственно. Через семь суток интенсивность инвазии составила 14±2,1, интенсэффективность лечения - 71,4, экстенсэффективность - 80 процентов.

Во время опыта не было зафиксировано падежа цыплят в первой группе. Во второй группе пал один цыпленок, в контрольной - три цыпленка. Для освобождения цыплят второй группы от кокцидий потребовалось больше времени. При этом показатели интенсэффективности и экстенсэффективности были ниже, чем в первой группе. В контрольной группе интенсивность эймериозной инвазии в период опыта возросла с 53±1,2 до 150±2,3 в конце опыта.

Во втором опыте использовали 15 кроликов, свободных от кокцидий и гельминтов. Животных заражали смешанной культурой спорулизованных ооцист эймерий (Е. stidae, E. perforans, E. magna и.др.). Для этого неспорулированные ооцисты эймерий культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 26-27°C, периодически орошая дехлорированной водой. Суспензию ооцист отмывали 2 раза водопроводной водой центрифугированием и подсчитывали количество ооцист в 1 мл. Каждому животному перорально вводили ооцисты эймерий в расчете 20000 на 1 кг массы.

После заражения кролики были разделены на 3 группы. Через 10 дней после заражения животным первой группы вместе с концентрированным кормом давали соединение "Эвей" в дозе 10 мг/кг (по ДВ), однократно, второй группе - фуразолидон в дозе 20 мг/кг, двумя пятидневными курсами с интервалом в 3 дня. Кроликов третьей группы не лечили, и они служили в качестве контроля.

Животные в течение опыта находились в одинаковых условиях содержания, предотвращающих спонтанное заражение. Кормление животных осуществлялось в соответствии с зоотехническими нормами. Ежедневно проводили клинический осмотр поголовья. Пробы фекалий для исследования брали до заражения и введения препаратов и через 3, 7 и 15 дней после лечения. Для копрологических исследований проб материала использовали метод Котельникова и Хренова.

Данные о противоэймериозной эффективности препаратов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная эффективность препаратов "Эвей" и фуразолидона при лечении эймериоза кроликов
№ гр.	Количество животных в группе	ИИ до начала лечения (экз) М±м	Интенсивность инвазии, интенсэффективность и экстенсэффективность
			3 суток			7 суток			15 суток
			ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)	ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)	ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)
1	5	116±1,4	10±0,3	91,4	80	7±0,1	94	80	9±0,1	92,2	80
2	5	129±2,7	38±2,5	70,5	60	44±1,1	65,9	60	19±2,4	85,3	60
3	5	103±2,1	124±1,7	-	0	98±1,5	-	0	110±1,9	-	0

Из таблицы 2 видно, что до лечения все кролики были заражены эймериозом, интенсивность инвазии (ИИ) колебалось от 103±2,1 до 129±2,7 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Через 3 суток после начала лечения в первой группе (препарат "Эвей") интенсивность инвазии составила 10±0,3, а интенсэффективность и экстенсэффективность 91,4 и 80 процентов соответственно.

Через семь суток интенсивность инвазии составила в первой группе 7±0,1, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 94 и 80 процентов соответственно.

Во второй группе (препарат фуразолидон) интенсивность инвазии на третьи сутки после начала лечения составила 38±2,5. Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения составили 70,5 и 60 процентов соответственно. Через семь суток интенсивность инвазии составила 44±1,1, интенсэффективность лечения - 65,9, экстенсэффективность - 60 процентов.

У кроликов контрольной группы интенсивность эймериозной инвазии в ходе опыта не снижалась и составила через трое суток 124±1,7, через семь суток 98±1,5, через 15 суток 110±1,9.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что после лечения экспериментально зараженных эймериозом кроликов интенсэффективность соединения "Эвейгельм" через трое суток была выше на 20,9%, через 7 суток - 29,1% и через 15 суток - 6,9%.

Испытание препарата в отношении возбудителей кокцидиоза свиней проводили в ООО "Агрофирма Сарсазы" в июне - июле 2011 года. На основании копроскопических исследований по методу Котельникова и Хренова были сформированы три группы спонтанно зараженных поросят по 20 голов в возрасте 65-70 суток. Поросята первой группы получали препарат "Эвей" в дозе 10 мг/кг веса (по ДВ), однократно с кормом. Поросята второй группы получали ампролиум в дозе 25 мг/кг массы животного 2 раза в день 4 дня подряд. Третья группа поросят лекарственных препаратов не получала и являлась контрольной. Фекалии от поросят в группах исследовали до лечения и на 14 сутки. Результаты исследований приведены в таблице 3. Интенсивность инвазии в группах до лечения составляла от 82±2,5 до 108±1,3 ооцист в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Экстенсивность инвазии составляла 100% во всех группах. Спустя две недели после лечения интенсивность инвазии в первой группе составила 13±1,6, а во второй 37±1,2. Интенсэффективность и экстенсэффективность составила в первой группе 86,6 и 90 процентов соответственно, а во второй 54,9 и 70 процентов соответственно.

Таблица 3
Сравнительная эффективность препаратов "Эвей" и ампролиум при лечении эймериоза свиней
№ гр.	Количество животных в группе	ИИ до начала лечения (экз) М±м	Интенсивность инвазии, Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения через 14 суток
			ИИ (экз) М±м	ИЭ (%)	ЭЭ (%)
1	20	97±1,9	13±1,6	86,6	90
2	20	82±2,5	37±1,2	54,9	70
3	20	108±1,3	130±2,6	-	0

В контрольной группе интенсивность инвазии в течение опыта сохранилась.

Пример 3. Определение острой токсичности и раздражающего действия лекарственной субстанции "Эвей".

Работа по изучению острой токсичности проводилась на базе кафедры паразитологии и радиобиологии КГАВМ им. Н.Э. Баумана в сентябре 2011 года. В опыте использовались 70 белых мышей, самцов и самок, массой тела 18-21 г. Препарат в виде водной суспензии вводили в желудок однократно с помощью зонда. Лабораторные животные, учитывая пол, возраст, массу тела, были разделены на 7 групп: 6 опытных и одну контрольную (по 10 голов в каждой). Мышам опытных групп вводили препарат в возрастающих дозах 50, 100, 150, 200, 250 и 300 мг/кг массы тела по ДВ соответственно. Мышам контрольной группы в желудок вводили дистиллированную воду. За состоянием здоровья лабораторных животных наблюдали в течение 14 дней после введения, учитывая внешний вид, подвижность, прием корма. Случаи гибели регистрировали, павших животных вскрывали. Результаты приведены в таблице 4.

Однократное пероральное введение препарата в дозе 50 мг/кг массы тела по ДВ не вызвало у мышей изменений в поведении и общем состоянии животных. До конца эксперимента не было отмечено падежа животных. Эта доза была определена как максимально переносимая. В группе 2, в которой вводили 100 мг/кг массы тела, наблюдалось угнетение двигательной активности и аппетита животных, которое продолжалось до 5 дней. Три из десяти мышей пали на вторые и третьи сутки. В группе 3 также наблюдалось угнетение двигательной активности и аппетита животных. До конца эксперимента погибли 4 из 10 мышей. В группе 4 произошел падеж 7 из 10 мышей в период с первых по седьмые сутки после введения. В группе 5 наблюдалось значительное ухудшение общего состояния животных, уменьшение двигательной активности и потребления корма. 9 из 10 мышей пали в течение первых пяти суток. В группе 6, в которой вводили препарат в дозе 300 мг/кг массы тела, наблюдался кратковременный период двигательной активности, который затем сменялся периодом глубокого угнетения и отказом от корма. Все мыши погибли в течение первых и вторых суток после введения. При вскрытии у всех животных 6 группы отмечено вздутие желудочно-кишечного тракта газами на всем протяжении, застой содержимого в желудке, венозный застой в сосудах брюшной полости. Результаты опытов приведены в таблице 4.

Расчет среднесмертельной дозы произведен по методу Кербера с использованием формулы:

LD ₅₀=LD₁₀₀-( (Z×D))/m, где

D - интервал между каждыми двумя смежными дозами;

Z - среднее арифметическое число животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция под влиянием каждых двух смежных доз;

m - число животных в каждой группе.

При пероральном введении LD ₅₀ препарата составила 160 мг/кг массы тела, по ДВ.

Таким образом, установлено, что лекарственная субстанция "Эвей" при пероральном введении, в соответствии с ГОСТ 121.007-76, по своим токсикологическим характеристикам относится к III классу опасности - веществам умеренно опасным для теплокровных животных.

Таблица 4
Схема опыта и результаты изучения острой токсичности лекарственной субстанции "Эвей" на белых мышах
№ группы	Доза препарата, мг/кг	Количество животных в группе на начало опыта, гол.	Пало животных, гол.	Выжило животных, гол.	Летальность, %
1	50	10	0	10	0
2	100	10	3	7	30
3	150	10	4	6	40
4	200	10	7	3	70
5	250	10	9	1	90
6	300	10	10	0	100

Изучение раздражающего действия препарата проводили на пяти кроликах, в возрасте 12 месяцев, одного пола и примерно одинаковой массы тела (2,5-3 кг). Препарат в виде водной суспензии, с помощью глазной пипетки, вводили под правое веко по одной капле. Для контроля под левое веко, аналогично, вводили дистиллированную воду. За животными наблюдали в течение часа. За это время не было выявлено покраснения коньюктивы глаз ни у одного из кроликов. Через 12 и 24 часа не было замечено видимых различий левых и правых глаз у опытных кроликов. Это позволило сделать вывод, что лекарственная субстанция "Эвей" не обладает выраженным раздражающим действием.