способ получения водорастворимого бактерицидного препарата

Классы МПК:A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов
A61K33/38 серебро; его соединения
A61K35/56 материалы из прочих животных кроме млекопитающих или птиц
B02B1/00 Подготовка зерна к помолу или подобным процессам
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт химии силикатов им. И.В. Гребенщикова Российской академии наук (ИХС РАН) (RU),
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины "Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-06-07
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к бактерицидным препаратам с лизоцимной активностью. Смешивают водные растворы нитрата серебра и лизоцима в заданном соотношении с получением восстановленного металлического серебра. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением водного раствора желатина в заданном соотношении. Полученную смесь подергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм. В течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм. В течение 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм. Проводят диализ обработанной смеси в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды с последующей сушкой под вакуумом. Изобретение позволяет получить нетоксичный и стабильный в растворе хлорида натрия бактерицидный препарат. 2 табл. 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к бактерицидным препаратам с лизоцимной активностью, содержащим ферменты животного происхождения, и к способу их получения. Препарат может быть использован в медицине и ветеринарии в качестве аппликаций наружного применения, при лечении гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта, а также грибковых заболеваний. Его важным свойством является проявление активности как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов.

Для оценки новизны и технического уровня изобретения рассмотрим ряд известных заявителю технических средств аналогичного назначения, характеризуемых совокупностью сходных с изобретением признаков, известных из сведений, ставших общедоступными до даты приоритета изобретения.

Использование лизоцима яичного белка в качестве бактериолитического фермента известно в медицине, см. Подборнов В.М. Сравнительная характеристика лизоцимов разного происхождения. - Антибиотики и химиотерапия, 1990, т.35, N 8, с 22-25.

К недостаткам использования лизоцима можно отнести узкий спектр его действия, так как он не оказывает литического действия на целый ряд микроорганизмов, в том числе и патогенных. В частности, он действует только против грамположительных бактерий.

Кроме того, антибиотическая активность природных антимикробных пептидов и белков, в том числе и лизоцима, в средах с повышенной концентрацией хлорида натрия снижается, что особенно неблагоприятно при использовании препаратов, в состав которых входят подобные полипептиды, при поражениях кожи, так как на поверхности кожи концентрация хлорида натрия на порядок превышает таковую в плазме крови.

Известен препарат для профилактики и лечения инфекционных болезней животных и человека (патент РФ № 2169573), включающий лизоцим яичного белка и микробный лизоцим при соотношении ингредиентов 1:1-2 по активности.

В известном препарате в качестве исходного продукта использован лизоцим яичного белка. Недостаток лизоцима яичного белка как исходного продукта для изготовления препарата для профилактики и лечения инфекционных болезней заключается в том, что его активность проявляется в отношении инфекций, вызываемых грамположительными бактериями. Кроме того, он не может быть использован для лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта, а также грибковых заболеваний и инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями.

Известен способ получения водорастворимой бактерицидной композиции (повиаргола), содержащей высокодисперсное металлическое серебро, стабилизированное защитным полимером. Композиция получена путем восстановления ионного серебра в водных растворах при нагревании с последующей сушкой. Восстановление ионного серебра ведут в атмосфере инертного газа при взаимодействии 0,025-29,73 мас. раствора нитрата серебра с 5,0-38,6 мас. водным раствором этилового спирта, содержащим 0,065-11,0 мас. поли-N-винилпирролидона-2, при этом реакцию проводят в темноте с нагреванием до 65-75°С (патент РФ № 2088234).

Этот способ выбран в качестве прототипа заявляемого технического решения. Недостатком прототипа является то, что он не обеспечивает полное восстановление ионного серебра. Наличие ионного серебра в полученной водорастворимой бактерицидной композиции определяет токсичность полученного препарата и нестабильность в растворе хлорида натрия.

На практике стабильность антимикробных препаратов в присутствии хлорида натрия является необходимым условием их эффективности, поскольку в организме человека хлорид натрия присутствует в широком диапазоне концентраций в различных биологических жидкостях. Стабильность серебросодержащих препаратов при контакте с биологическими жидкостями также невысока. При их практическом применении в присутствии хлорида натрия происходит образование осадка, что не позволяет этим препаратам равномерно распределяться в жидкостях и тканях организма, что снижает их эффективность.

Задачей изобретения является создание способа получения нетоксичного, стабильного в растворе хлорида натрия бактерицидного препарата с расширенным спектром действия за счет обеспечения его активности по отношению к грамотрицательным бактериям, обеспечивающим повышение эффективности лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта.

Сущность изобретения как технического решения выражается в следующей совокупности существенных признаков, достаточной для достижения указанного выше обеспечиваемого изобретением технического результата.

Способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, включающий смешение исходных компонентов, с последующей стабилизацией металлического серебра полимером путем восстановления ионного серебра в водных растворах с последующей сушкой, характеризуется тем, что восстановление ионного серебра в водном растворе ведут при взаимодействии нитрата серебра, лизоцима и желатина при следующем соотношении компонентов, мас.%: лизоцим 0,043-0,045, нитрат серебра - 0,073-0,085, желатин 0,071-0,080, вода - остальное, после чего полученную смесь подвергают чередующемуся воздействию УФ-облучения, затем проводят диализ и сушку под вакуумом.

Заявленное техническое решение характеризуется также наличием ряда факультативных признаков, а именно:

- полученную смесь исходных компонентов подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем в течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, а диализ обработанной смеси проводят в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании.

Наличие наночастиц серебра позволяет усилить бактерицидную способность лизоцима и получить водорастворимый бактерицидный препарат, обладающий активностью по отношению к грамотрицательным бактериям. Введение желатина позволяет стабилизировать серебро в форме наночастиц и улучшить активность получаемого препарата в растворах NaCl.

В таблице 1 приведены примеры составов исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного препарата.

Таблица 1
Название компонентовСоставы исходного продукта для получения препарата, мас.%
12 345
лизоцим0.043 0.0440.043 0.0420.046
желатин0.0710.073 0.0740.071 0.071
нитрат серебра 0.0730.0790.08 0.0730.073
вода99.813 99.80499.803 99.81499.810

Продолжение таблицы 1
Название компонентов Составы исходного продукта для получения препарата, мас.%
67 8910 11
лизоцим 0.0430.0430.043 -- 0.2
желатин 0.0710.0710.025 0.026- -
нитрат серебра 0.0720.0860.073 0.0730.85 -
вода 99.81499.80399.816 99.90499.15 99.8

В таблице 1 составы 1-3 подтверждают качественное и количественное соответствие заявленных компонентов, составы 4-8 количественно выходят за рамки заявленного диапазона, в составах 9-11 приведены примеры с наличием или отсутствием компонентов заявленных составов.

В сравнительной таблице 2 приведены свойства водорастворимого бактерицидного препарата в соответствии с составами исходного продукта для его получения.

Таблица 2
Замеряемые параметрыПримеры составов исходного продукта и их антимикробная активность
12 345
Стабильность в NaCl (0.15М) +++++++++ +-
Антимикробная активность (МИК), мкг/мл: способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259
Ecsherichia coli ML35p 3131 315518
Acinetobacter baumannii (клиничекий изолят) 88 8--
Stahylococcus aureus SG511 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259
MRSA ATCC 33591 313131 11018
способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 6262 62110 36
Токсичность для фибробластов человека11 11 1
для нейтрофилов человека 11 122

Продолжение таблицы 2
Замеряемые параметры Примеры составов исходного продукта и их антимикробная активность
способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 67 89 1011
Стабильность в NaCl (0.15М)+ --+ -+++
Антимикробная активность (МИК), мкг/мл:способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259
Ecsherichia coli ML35p 6524 32316 2100
Acinetobacter baumannii (клиничекий изолят)способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 -- -6 -
Stahylococcus aureus SG511 6548 32806 60
MRSA ATCC 33591 не акт.9664 806 2100
Токсичность для фибробластов человека12 21 40
для нейтрофилов человека2 222 40

Результаты исследований составов исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного препарата, описанных выше, представлены следующими характеристиками: антимикробная активность, токсичность, стабильность в 150 мм растворе хлорида натрия NaCl.

Антимикробная активность представлена как минимальная ингибирующая рост микробов концентрация (МИК) препаратов, в мкг/мл. Антимикробную активность образцов, полученных по заявляемому способу, изучали методом серийных разведений в питательной среде. Антимикробную активность исследовали в отношении грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ML35p, Acinetobacter baumannii, грамположительных бактерий Staphylococcus aureus SG511 и MRSA АТСС 33591.

Также была исследована токсичность полученных образцов для фибробластов и нейтрофилов человека. Для оценки цитотоксичности препаратов для культивируемых клеток использовали следующую шкалу: 0 баллов - отсутствие цитотоксического действия; 1 балл - слабое токсическое действие (20-25% гибель клеток); 2 балла - мягкое токсическое действие (50% гибель клеток); 3 балла - умеренное токсическое действие (70-75% гибель клеток); 4 балла - тяжелое токсическое действие (100% гибель клеток) - при использовании препаратов в концентрациях, в 5 раз превышающих МИК.

При проведении исследований были использованы следующие нормативные документы:

способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 Оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средствспособ получения водорастворимого бактерицидного препарата, патент № 2502259 Методические указания МУ 1.2.1105-02 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 10 февраля 2002 г.).

Методические указания по использованию культуры диплоидных клеток человека, рекомендуемых для токсиколого-гигиенических исследований. Утверждены МЗ СССР 18.09.91 № 15-6/21. М., 1991. 20 с.

Образец удовлетворяет требованиям безопасности, если ни одна из опытных клеточных культур не имеет степень более 1.

Стабильность известных ранее серебросодержащих препаратов при контакте с биологическими жидкостями также невысока. При их практическом применении в присутствии хлорида натрия NaCl происходит образование осадка, что не позволяет этим препаратам равномерно распределяться в жидкостях и тканях организма, что снижает их эффективность.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что составы № 1-3, представляющие собой сочетание лизоцима, желатина и нитрата серебра в заявленных соотношениях, подтверждают возможность решения поставленных нами задач и достижения указанного технического результата, а именно получены образцы, стабильные в растворе хлорида натрия, они обладают антимикробной активностью широкого спектра действия и не являются токсичными. Заявленные составы исходного продукта для получения водорастворимого бактерицидного являются оптимальными и в сравнении с чистым лизоцимом (состав № 11), раствором нитрата серебра (состав № 10), а также с наночастицами серебра (состав № 9), стабилизированными желатином.

Состав № 4, содержащий меньше лизоцима, чем составы № 1-2-3, обладает меньшей антимикробной активностью. Увеличение содержания лизоцима (состав № 5) приводит к нестабильности получаемого препарата в растворе NaCl. Снижение количества нитрата серебра (состав № 6) приводит к снижению антимикробной активности препарата, увеличение же его содержания (состав № 7) ведет к возникновению нестабильности в растворе NaCl. Уменьшение количества желатина ниже 0.071 мас.% (состав № 8) приводит к снижению стабильности препарата в среде NaCl.

Кроме того, были проведены дополнительные испытания (пример не включен в таблицу № 1) с увеличением содержания желатина до величин, превышающих 0.8 мас.%, что приводит к нежелательному гелированию получаемой композиции, и как следствие, к снижению технологичности процесса.

Таким образом, именно сочетание нитрата серебра, лизоцима и желатина в заявленных соотношениях, а именно, мас.%: лизоцим 0.043-0.045, нитрат серебра (AgNO3) 0.073-0.085, желатин 0.071-0.080, вода H2O - остальное - позволяет достигнуть требуемого технического результата - получение нетоксичного, стабильного в растворе хлорида натрия NaCl препарата, расширение спектра действия препарата за счет активности по отношению к грамотрицательным бактериям и повышение эффективности лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, пролежней, ожогов, бактериальных поражений слизистой глаз и полости рта.

Техническая сущность способа поясняется приведенными ниже примерами № 1-3.

Пример 1. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.073 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.043 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.071 мас.% водного раствора желатина.

Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.

Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 24 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл. Сушку проводят под вакуумом.

Пример 2. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.079 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.044 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.073 мас.% водного раствора желатина.

Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании: в течение 25 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.

Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 28 часов при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл. Сушку проводят под вакуумом.

Пример 3. Восстановление ионного серебра ведут при смешении 3 мл 0.08 мас.% водного раствора нитрата серебра и 3 мл 0.043 мас.% водного раствора лизоцима. Восстановленное металлическое серебро стабилизируют добавлением 1 мл 0.074 мас.% водного раствора желатина.

Полученную смесь подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25 минут, в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем 25 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм.

Затем проводят диализ полученного образца, для чего помещают в диализный мешок с микропорами 14000 Да в течение 30 мин при непрерывном перемешивании, с использованием бидистиллированной воды 1000 мл, далее сушку вакуумом.

Результаты исследований полученных образцов в различных условиях показали, что с увеличением времени УФ-обработки выпадает осадок и наблюдается нестабильность полученных композиций в растворе хлорида натрия NaCl. Условия получения, описанные в примерах реализации способа 1-3, наиболее оптимальны для решения поставленной задачи и позволяют получить технический результат.

Возможность промышленного применения заявленного технического решения подтверждается известными и описанными в заявке средствами и методами, с помощью которых возможно осуществление изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения водорастворимого бактерицидного препарата, включающий смешивание исходных компонентов, с последующей стабилизацией металлического серебра полимером путем восстановления ионного серебра в водных растворах с последующей сушкой, отличающийся тем, что восстановление ионного серебра в водном растворе ведут при взаимодействии нитрата серебра, лизоцима и желатина при следующем соотношении компонентов, мас.%: лизоцим 0,043-0,045, нитрат серебра (AgNO3) 0,073-0,085, желатин 0,071-0,080, вода - остальное, полученную смесь исходных компонентов подвергают УФ-облучению при непрерывном перемешивании в течение 25-30 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, затем в течение 25-30 минут в диапазоне длинноволнового излучения 365 нм и 55-60 минут в диапазоне коротковолнового излучения 254 нм, а диализ обработанной смеси проводят в течение 24-30 часов при непрерывном перемешивании.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2502259

patent-2502259.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов

Патенты РФ в классе A01N63/00:
кремнегуминовый регулятор роста растений и его применение для обработки растений -  патент 2529151 (27.09.2014)
штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами -  патент 2528058 (10.09.2014)
ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля -  патент 2527899 (10.09.2014)
планктонный штамм водорослей parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий -  патент 2527895 (10.09.2014)
способ содержания почвы виноградников -  патент 2527538 (10.09.2014)
родентицидный состав "изорат-6" (варианты) -  патент 2527064 (27.08.2014)
способ подготовки симбиотических бактерий рода xenorhabdus, выделенных из нематод вида steinernema feltiae protense, к хранению -  патент 2522811 (20.07.2014)
родентицидный состав "изорат-4" (варианты) -  патент 2518342 (10.06.2014)
антидотная композиция биологического происхождения для использования в растениеводстве -  патент 2518252 (10.06.2014)
сельскохозяйственные композиции с низкими нормами использования и способы применения -  патент 2516991 (27.05.2014)

Класс A61K33/38 серебро; его соединения

Патенты РФ в классе A61K33/38:
регулирование роста кости с использованием цеолита в комбинации с заменителями костного трансплантата -  патент 2529791 (27.09.2014)
способ лечения гнойных ран с использованием модифицированной монтмориллонит содержащей глины -  патент 2524802 (10.08.2014)
композиция в качестве бактерицидного и антифунгального средства (варианты) и макропористый бактерицидный материал на ее основе -  патент 2522986 (20.07.2014)
способ получения материала с антибактериальными свойствами на основе монтмориллонит содержащих глин -  патент 2522935 (20.07.2014)
комплексный препарат для профилактики и лечения кишечных инфекций -  патент 2519659 (20.06.2014)
водорастворимая бактерицидная композиция -  патент 2517063 (27.05.2014)
способ хирургического лечения несросшихся переломов и ложных суставов трубчатых костей при наличии дефицита мягких тканей в проекции несросшихся переломов и ложных суставов -  патент 2515146 (10.05.2014)
фармацевтическая композиция для лечения местных проявлений инфекций, вызванных вирусом простого герпеса и для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных инфекций -  патент 2514103 (27.04.2014)
средство для инъекционной терапии гастроэзофагеальной рефлюксной болезни -  патент 2514093 (27.04.2014)
средство для лечения ран и ожогов -  патент 2513186 (20.04.2014)

Класс A61K35/56 материалы из прочих животных кроме млекопитающих или птиц

Патенты РФ в классе A61K35/56:
композиция для парентерального введения, способ получения и применение композиции -  патент 2526826 (27.08.2014)
применение фармацевтических композиций в изготовлении лекарственных средств для лечения диабетических язв -  патент 2523889 (27.07.2014)
способ получения персонального препарата для лечения диабета, персональный препарат, полученный этим способом, способ лечения диабета этим препаратом -  патент 2522250 (10.07.2014)
комплекс биологически активных веществ для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы -  патент 2520695 (27.06.2014)
традиционная китайская лекарственная композиция для лечения бронхиальной астмы и способ ее приготовления -  патент 2519672 (20.06.2014)
средство для профилактики и лечения андрологических заболеваний и способ его получения -  патент 2519226 (10.06.2014)
средство, обладающее противоопухолевой, антикоагулянтной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензинпревращающий фермент (апф), и способ его получения -  патент 2509775 (20.03.2014)
средство, обладающее противовоспалительным и противоаллергическим действием -  патент 2488402 (27.07.2013)
средство, обладающее противовоспалительным действием -  патент 2483741 (10.06.2013)
приготовление пригодной для хранения суспензии жизнеспособных яиц глистов -  патент 2483740 (10.06.2013)

Класс B02B1/00 Подготовка зерна к помолу или подобным процессам



Наверх