способ получения кератиназы из penicillium citrinum

Классы МПК:C12N9/58 получаемые из грибов
C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
C12R1/80 Penicillium
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЛАР РАСХН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-05-24
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов кератиназы, и может быть использовано для получения препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве. Способ получения кератиназы предусматривает направленную адаптацию штамма Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР путем трехкратного пересева на агаризованной среде Чапека, содержащей в качестве источника углерода 2% кератина волос. Культивирование в глубинных условиях на среде Чапека, содержащей 10% кератина волос и 0,5% сахарозы в течение 6 суток. Отделение биомассы от культуральной жидкости с последующим выделением целевого продукта двухстадийной хроматографической очисткой, включающей гель-фильтрацию на TSK-Gel TOYOPEARL HW-40 и аффинную хроматорграфию на протеин А сефарозе CL-4B с последующей лиофилизацией. Изобретение позволяет увеличить выход фермента, получать препарат кератиназы, расщепляющий способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин волос, и повысить степень очистки ферментного препарата. 2 табл., 5 пр.

Формула изобретения

Способ получения кератиназы, предусматривающий направленную адаптацию штамма Penicillium citrinum PC-54-91ВИЛАР, путем трехкратного пересева культуры на агаризованной среде Чапека, содержащей в качестве источника углерода 2% кератина волос, культивирование в глубинных условиях на среде Чапека, содержащей 10% кератина волос и 0,5% сахарозы в течение 6 суток с последующим выделением фермента из фильтрата культуральной жидкости путем гель-фильтрации на TSK-Gel TOYOPEARL HW-40, элюции 0,15 М раствором NaCl с последующим осуществлением аффинной хроматографии на протеин А сефарозе CL-4B с последующей элюцией 1 М раствором уксусной кислоты и лиофилизацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к производству ферментов с помощью микробного синтеза и может быть использовано для получения высокоактивных препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве в случаях, где необходим гидролиз кератина.

Целью работы является получение высокоочищенного препарата кератиназы с высоким выходом и ферментативной активностью, способного гидролизовать способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин.

В комплексе протеолитических ферментов, образуемых микроорганизмами, важное место занимают ферменты, расщепляющие кератин - кератиназы (Е.С. 3.4.21-24, 99). Кератины - белки, состоящие из длинных полипептидных цепей, стабилизированных дисульфидными связями, гидрофобными взаимодействиями, а также водородными связями, и содержащие большой процент гидрофобных аминокислотных остатков, нерастворимы в воде и устойчивы к действию обычных лротеолитических ферментов. По вторичной структуре белка семейство кератинов разделяют на две группы: способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератины, организованные в виде способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -спирали, характеризующиеся большим содержанием цистеина и множеством дисульфидных связей, входящие в состав волос, шерсти, ногтей, рогов и копыт млекопитающих (жесткий способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин), а также эпидермиса (мягкий способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин), и способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератины, имеющие форму нескольких зигзагообразных полипептидных цепей (способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -листы), с меньшим содержанием цистеина, входящие в состав перьев, клюва, когтей птиц, чешуек пресмыкающихся и экзоскелета членистоногих, помимо способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератинов.

Спектр применения микробных кератиназ чрезвычайно широк: в агроиндустрии для конверсии кератинсодержащих отходов в производстве кормовых гидролизатов, добавок и азотных удобрений; в биомедицинской, фармацевтической и косметической индустрии для гидролиза прионов, приготовления вакцин при лечении дерматофитозов, производства биоактивных пептидов, удаления кератина при лечении псориаза и акне, деградации кератинизированной кожи и депиляции; в кожевенной промышленности для осуществления процесса обезволашивания в качестве альтернативы традиционному, загрязняющему окружающую среду, способу дубления кож с использованием сульфидов; в текстильной промышленности для модификации волокон; в производстве детергентов и биополимеров (биоразлагаемые пленки, клеи, покрытия); для очистки сточных вод, а также в процессе преобразования кератинсодержащих отходов в биотопливо [Brandelli, 2010].

Продуцентами микробных кератиназ являются бактерии, преимущественно Bacillis sp., актиномицеты и некоторые дейтеромицеты. В настоящее время коммерческий препарат кератиназы, производится фирмой «Merck» из культуральной жидкости актиномицета Streptomyces fradiae I.M. № 3739 [Nickerson, 1961]. Глубинное культивирование производят в питательной среде, содержащей наряду с минеральными солями кератиновый субстрат (простерилизованная неденатурированная шерсть, перья или мука из копыт) в течение 7 суток. Для осаждения кератиназы фильтрат культуральной жидкости обрабатывают сульфатом аммония, затем проводят обессоливание полученного осадка путем диализа и лиофильное высушивание препарата. Несмотря на высокую ферментативную активность данной кератиназы, применяемой для обезволашивания в кожевенной промышленности, степень ее очистки невелика (активность по сравнению с культуральной жидкостью возрастает в 14 раз), что ограничивает области применения этого препарата.

Также известен способ получения кератиназы с использованием Streptomyces chromogenus S.graecus ЛИА 0832, предусматривающий увеличение выхода кератиназы в 11 раз посредством изменения рН культуральной среды [Жеребцов, 1990].

Кератиназы большинства изученных микроорганизмов способны разрушать способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератины и лишь незначительное их число продуцируют ферменты с выраженной активностью по отношению к способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератинам, особенно к кератину волос и шерсти. Описан способ получения различных бактериальных кератиназ, заключающийся в отборе штамма на агаризованной среде, культивировании в питательной среде, содержащей 0,5% муки из волос, 5% соевой муки, 1% кукурузной муки и 1% рыбной муки, и получении фильтрата культуральной жидкости [Yang, 2005]

Особый интерес представляет получение протеолитических ферментов с высокой кератиназной активностью по отношению способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератинам, но не обладающих коллагеназной активностью, поскольку их применение за счет отсутствия разрушения коллагена позволяет получать высококачественные кожи, а также фармацевтические и косметических препараты. Обнаружен штамм Bacillus subtilis S14, секретирующий кератиназу с указанными свойствами при культивировании в среде, содержащей молочную сыворотку и бычью шерсть (40 г/л). Однако, активность этой субтилизин-подобной кератиназы, очищенной с помощью ионнообменной хроматографии, не изучалась, а была охарактиризована только культуральная жидкость [Macedo, 2005]. Недавно сообщалось о штамме Bacillus subtilis AMR, способном гидролизовать волосы человека [Mazotto, 2009]. Предварительно волосы были обезжирены смесью хлороформ/метанол (1:1), промыты, измельчены и добавлены в 0.06 М фосфатный буфер (рН 7,2) в количестве 10 г/л, содержащий также 0,01% дрожжевой экстракт. Максимальная кератинолитическая активность культуральной жидкости через 8 суток составила 163 ед./мл, однако определение активности проводили с использованием «растворимого» кератина, что может приводить к существенному увеличению полученных результатов.

В настоящее время значительно возрос интерес к использованию в качестве продуцентов протеолитических ферментов с кератинолитическим действием микромицетов, не являющихся дерматофитами. Сообщается о методе получения кератиназы из Myceliophtora thermophilia GZUIFR-H94 путем культивирования продуцента на среде, содержащей в качестве источника углерода и азота 10 г/л перьевой муки, а также 0,98 г/л мочевины при 38°C [Yongquan, 2009].

К продуцентам-дейтеромицетам, способным с высокой скоростью гидролизовать способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин относится один из штаммов Aspergillus flavus, который, как сообщается, можно использовать в качестве депилирующего агента при поверхностном культивировании на среде с молочной сывороткой, добавленной в качестве индуктора синтеза протеазы [Malathi, 1991]. Недостатком работы является определение не собственно кератиназной активности, а только активности фермента по отношению к казеину. Очистка фермента и определение его субстратной специфичности проведены не были. Следует отметить также, что используемый дейтеромицет является потенциальным продуцентом афлотоксинов.

Известен способ получения кератиназ из культуральной жидкости Doratomyces microsporus и Paecilomyces marguandii при культивировании в жидкой среде, содержащей соевую муку в качестве индуктора кератиназы, которые способны эффективно гидролизовать способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератины эпидермиса и ногтей, но в значительно меньшей степени кератин волос, шерсти и перьев и обладающие невысокой коллагенолитической активностью [Gradizar, 2005].

К числу дейтеромицетов, не являющихся дерматофитами, способных образовывать кератиназы, гидролизующие ногти, волосы человека или перья относятся и некоторые видов рода Penicillium [Marcondes, 2008], в том числе и Penicililum citrinum [Anby, 2006; Гордонова, 2009]. Следует отметить, что Penicillium citrinum не является патогенным и имеет большое практическое значение в биотехнологии и медицине как продуцент статинов [Li, 2011], регуляторов роста растений [Kuramata, 2007] и различных ферментов, таких как, использующиеся в пищевой промышленности нуклеаза P1, необходимая для получения 5-инозиновой кислоты [Ichishima, 1991], и липаза [Pimentel, 1996]. Среди ферментов, синтезируемых этим микромицетом, важное место занимают и протеолитические ферменты, к которым относятся кератиназы.

В качестве прототипа был выбран способ получения кератиназы из Penicillium citrinum [Anby, 2006]. Предложенная методика культивирования Penicillium citrinum позволила авторам считать изученный штамм потенциальным продуцентом кератиназы. Поддержание штамма осуществляли на среде Сабуро. Глубинное культивирование проводили в питательной среде, содержащей 1% кератиновый субстрат в виде порошка из обезжиренных смесью хлороформ-метанол (1:1), отмытых дистиллированной водой и высушенных перьев в качестве единственного источника углерода и азота, и минеральные соли (г/л): 1,5 K2HPO4, 0,05 MgSO4×7Н2О, 0,025 CaCL2 , 0,015 FeSO4×7H2O и 0,005 ZnSO 4×7H2O,pH 7,5, засеянной суспензией спор в количестве 106 спор на 1 мл среды, при 30°C, перемешивании 100 об/мин в течение 3 недель. Кератиназная активность культуральной жидкости, отфильтрованной и подвергшейся центрйфйгйрованию (8000 g, 10 мин), составила 1,48 кератиназных единиц/мл и была выше таковой многих других изученных видов дейтеромицетов-недерматофитов (роды: Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces) и дерматофитов (Microsporium gypseum, Chrisosporium keratinophillum, Myceliopthora vellerea). Выделение кератиназы проведено не было.

Поскольку способа выделения и очистки кератиназы из культуральной жидкости Penicillium citrinum до настоящего момента не разработан, нами были рассмотрены способы получения других протеолитических ферментов указанного продуцента.

Известен способ выделения пенициллолизина - металлопротеиназы из Penicillium citrinum [Yamaguchi, 1993] путем хроматографии фермента на СМ-сефарозе, рехроматографии на СМ-сефарозе и окончательной очистки с помощью FPLC-Superose 12. В результате получен электрофоретически гомогенный препарат с молекулярным весом 18 кДа, однако степень очистки и выход фермента не описаны. Кератиназная активность пенициллолизина не изучалась.

В литературе описан способ выделения сериновой протеазы, относящейся к семейству субтилизинов, секретируемой Penicillium citrinum 52-5, при культивировании на минеральной среде, содержащей 0,5% глюкозы и 1,5% мясного экстракта в течение 4 суток [Su, 2001]. Очистка отфильтрованного от биомассы экстракта включала: высаливание сульфатом аммония до 80% на льду, центрифугирование, растворение осадка в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,8), диализ против этого буфера, отделение нерастворенных белков центрифугированием и окончательную очистку с помощью ионообменной хроматографии на СМ-сефарозе. В результате удалось очистить фермент в 3,4 раза, при этом выход протеазы составлял 14,1%.

Описан способ получения сериновой протеазы, инактивирующей лактатдегидрогеназу, из Penicillium citrinum KE-1 [Watazu, 1994]. Дейтеромицет культивировали в жидкой среде, содержащей 1% глюкозы, 1% мясного экстракта, 1% полипептона и 0,3% NaCl, pH 7,0 при температуре 30°C в течение 6 суток. Процедура очистки супернатанта, полученного после центрифугирования культуральной жидкости, включала следующие стадии: осаждение белка сульфатом аммония, центрифугирование, растворение осадка в 10 мМ фосфатном буфере (рН 6,0), диализ против того же буфера, ионообменная хроматография на СМ-сефарозе, концентрирование активных фракций путем ультрафильтрации на UF-10 PS мембране, диализ против фосфатного буфера (рН 6,0), содержащего 0,1 М NaCl, хроматографию на Сефадексе G-100, диализ против дистиллированной воды и лиофильное высушивание. В результате фермент был очищен в 124 раза, выход составил 81%.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышении кератиназной активности культуры Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР, сокращение времени ведения процесса культивирования и разработка процедуры выделения и очистки кератиназы для получения очищенного ферментного препарата с высоким выходом, способного гидролизовать способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин.

Указанные цели достигаются использованием в качестве источника кератиназы дейтеромицета Penicillium citrinum PC-5 4-91 ВИЛАР с предварительной направленной адаптацией посевного материала путем его трехкратного пересева на среде Чапека, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота 2% кератина волос; глубинным культивированием продуцента на модифицированной среде Чапека, содержащей 10% кератина волос; применением двухстадийного метода хроматографической очистки, включающего гель-фильтрацию на TSK-Gel TOYOPEARL HW-40 («TOYO-SODA») - геля на основе сферических гидрофильных гранул (диаметр - 45 мкм) полиэтиленоксида с размером пор 50 А и диапазоном молекулярного веса разделяемых протеинов от 15000 до 100 Да, не сорбирующего вещества белковой природы, с применением в качестве элюента 0,15 М раствора NaCL, и аффинную хроматографию фракции с молекулярной массой свыше 15000 Да с использованием протеин А сефарозы CL-4B («Pharmacia») - сорбента с диаметром гранул 60-140 мкм на основе агарозы, представляющего из себя полисахарид, элементарным звеном которого служит агаробиоза, а в качестве лиганда применяется протеин А, обладающего способностью сорбировать кератиназы, которые элюируют 1 М раствором уксусной кислоты (рН 2,4), и дальнейшим лиофильным высушиванием препарата.

Определение кератиназной активности проводят модифицированным методом Anbu et al (2006). За единицу кератиназной активности (КЕ/мл) принимают такое количество фермента, которое в результате протеолиза 20 мг кератина волос при 37°C в течение 1 ч в присутствии 3,8 мл 100 мМ трис-HCL буфера (рН 7,8) и 0,2 мл фильтрата культуральной жидкости, полученного с использованием мембранного фильтра с диаметром пор 0,23 мкм, или 0,2 мл элюента при измерении на спектрофотометре (способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 =280 нм) после фильтрации инкубационной смеси дает повышение оптической плотности опытных проб над контрольными, равное 0,1. Удельную кератиназую активность рассчитывают в пересчете на мг внеклеточного белка, определенному методом Лоури.

Пример 1. Для получения посевного материала культуру Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР) выращивали в течение 7-ми суток в термостате при 26°C на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека, следующего состава (%): NaNO3 - 0,2; KH2 PO4 - 0,1; MgSO4×7H2O - 0,05; KCl - 0,05; FeSO4×7H2O - 0,001; СаСО3 - 0,3; сахароза - 2; агар - 2, рН 6,8 (способ получения № 1 - таблица 1). Посевным материалом служила суспензия спор дейтеромицета (108 спор на 100 мл среды). Культивирование в глубинных условиях осуществляли в колбах объемом 300 мл с 100 мл питательной среды на качалке при скорости вращения 220 об/мин при 26°C. Культивирование проводили на модифицированной среде Чапека с частичной заменой сахарозы на кератиновый субстрат из волос - обезжиренные смесью хлороформ: метанол (1:1), измельченные и тиндализованные волосы человека [Гордонова, 2007] (0,5% сахарозы и 1,5% кератина). В фильтратах культуральной жидкости дейтеромицета, полученных путем их фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,23 мкм на различных этапах культивирования, определяли общую и удельную кератинолитическую активность как описано выше.

Максимальная кератиназная активность культуральной жидкости составляла 1,08 КЕ/мл через 10 суток культивирования.

Пример2. Культуру Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР, выращенную на агаризованной среде Чапека как в примере 1, пересевали один, два или три раза (способы получения № № 2, 3, 4 соответственно - таблица 1) на агаризованную среду Чапека с заменой сахарозы на кератин волос для направленной адаптации культуры. Условия засева и культивирования аналогичны примеру № 1. Максимальная кератиназная активность культуральной жидкости составляла 1,47 КЕ/мл через 8 суток культивирования в способе получения № 2, 2,35 КЕ/мл через 7 суток культивирования в способе получения № 3 и 2,60 КЕ/мл через 6 суток в способе получения № 4.

Пример 3. Культивирование Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР проводили как описано в способе получения № 4, повышая концентрацию кератина волос в жидкой питательной среде до 5 и 10% (способы получения № № 5 и 6 соответственно - таблица 1). Максимальная кератиназная активность культуральной жидкости через 6 суток культивирования составляла 4,73 КЕ/мл для способа получения № 5 и 6,26 КЕ/мл для способа № 6.

В таблице 1 представлены результаты, показывающие преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным.

Пример 4. Культивирование Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР проводили как описано в способе получения № 6 (табл.1). Для выделения и очистки кератиназы из фильтрата культуральной жидкости последовательно применяли гель-фильтрацию и аффинную хроматографию. Для проведения гель-фильтрации использовали колонку "LKB" (2,6×40 см) с гелем TOYOPEARL HW-40. На колонку наносили 10 мл фильтрата культуральной жидкости. Элюентом служил 0,15 М раствор NaCl. Детектирование осуществляли при длине волны 274 нм с помощью проточного денситометра "Uvicord 2", скорость элюции составила 3.3 мл/мин. Оптимизация условий хроматографии, таких как объем нанесенного образца и скорость элюции, позволила добиться достаточно четкого разделения указанных фракций. При этом фракция, соответствующая внешнему объему колонки и материалу с молекулярной массой выше 15 кДа, обладала значительной кератиназной активностью, превышающей кератиназную активность исходного препарата в 3,03 раза, и составляла 11,8 КЕ/мг. Однако проведенный с помощью диск-электрофореза анализ материала фракции 1 показал, что она не является гомогенной и кроме основного белка с молекулярной массой около 21 кДа содержит и другие белки с более высокими и низкими молекулярными массами, что потребовало разработки дополнительных способов очистки ферментного препарата.

Материал, обладающий кератиназной активностью, после проведения гель-фильтрации собирали и подвергали очистке методом аффинной хроматографии. Для этих целей колонку LKB объемом 9×150 мм заполняли протеин-А сефарозой в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) и наносили материал фракции, полученной после гель-фильтрации, обладающий кератиназной активностью. Элюцию проводили, используя последовательно 0,01 М фосфатный буфер, тот же буфер с 1 М NaCl и 1 М раствор уксусной кислоты до полного удаления сорбированного материала. Скорость элюции составляла 10 мл/час. Оптическую плотность элюата контролировали при длине волны 274 нм с помощью проточного денситометра "Uvicord 2". Показано, что при проведении аффинной хроматографии материал, обладающий кератиназной активностью, элюировался с колонки под действием 1 М уксусной кислоты. Кератиназная активность других фракций практически равнялась нулю. Электрофоретический анализ с помощью диск-электрофореза в ПААГ [Шелудько, 1975] выявил только одну гомогенную белковую фракцию с молекулярной массой около 21 кДа. При этом после проведения аффинной хроматографии ферментативная активность полученного препарата возрастала до 231,1 КЕ/мг, то есть увеличивалась в 59,3 раза. В таблице 2 представлены результаты хроматографической очистки кератиназы, продуцируемой Penicillium citrinum РС-54-91 ВИЛАР.

Полученный раствор ферментного препарата разливали в стерильные пенициллиновые флаконы по 5 мл, замораживали их в морозильной камере «Sanyo Ultra Low» при -60°C и лиофильно высушивали на лиофильной сушилке «Edwards» (Англия) при - 40°C и 0,1-0,2 атм.

Активность ферментов в различных областях рН определяли, используя 0.01 М фосфатный буферный раствор с рН: 5.8; 6.4; 7.0; 7.4; 8.0. Для изучения температурной стабильности ферментных препаратов их инкубировали в 0.01М фосфатном буфере (рН 7.4) в течение 60 мин при температурах: 20°; 30°; 40°; 50°; 60°C, после чего проводили определение ферментативной активности, как это описывалось выше. Для проведения ингибиторного анализа использовали EDTA - ингибитор металлопротеиназ и PMSF (фенилметансульфонилфторид) - ингибитор сериновых протеаз, а также дитиотрейтол (DTT). Действие ингибиторов на кератиназную активность определяли по остаточной протеолитической активности после предварительного инкубирования фермента (15 мин при 37°C) с ингибиторами, вносимыми до конечной концентрации в пробе с 1 мкг фермента: EDTA до 1 мМ, PMSF и DTT до 3 мМ. Субстратную специфичность ферментов определяли, измеряя количество образовавшихся способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -аминогрупп в процессе гидролиза белка и дипептидов, как описано ранее [Никитина, 2011]. Реакцию проводили при следующих условиях: начальная концентрация субстрата 20 мМ; весовое соотношение фермент: субстрат равнялось 1:50; рН 7,4; температура 37°C.

Полученная кератиназа активна в диапазоне рН от 6,4 до 8,0, с оптимумом рН 7,0; в диапазоне от 20 до 40°C, с оптимумом при 30°C. Фермент полностью теряет свою активность под действием PMSF и практически не реагирует на обработку EDTA, то есть является протеазой серинового типа. DTT снижает активность кератйназы в меньшей степени, чем PMSF, что свидетельствует о влиянии дисульфидных связей на стабильность активного центра фермента. Ферментативная активность была крайне низка при использовании в качестве субстратов дипептидов Ley-Gly и Gly-Gly и коллагена, что свидетельствует об отсутствии коллагеназной активности у протеазы.

Таким образом, кератиназа, продуцируемая Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР и выделяемая согласно изобретению, относится к классу нейтральных термолабильных протеаз серинового типа, расщепляет способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин и практически не гидролизует коллаген.

Пример 5. Для получения посевного материала культуру Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР) выращивали в течение 7-ми суток в термостате при 26°C на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека, следующего состава (%): NaNO3 - 0,2; KH2 PO4 - 0,1; MgSO4×7H2O - 0,05; KCl - 0,05; FeSO4×7H2O - 0,001; СаСО3 - 0,3; сахароза - 2; агар - 2, рН 6,8. Культуру дейтеромицета, выращенную на агаризованной среде Чапека, пересевали три раза на агаризованную среду Чапека с заменой сахарозы на кератин волос для направленной адаптации культуры. Посевным материалом служила суспензия спор дейтеромицета (108 спор на 100 мл среды). Культивирование в глубинных условиях осуществляли в колбах объемом 300 мл с 100 мл питательной среды на качалке при скорости вращения 220 об/мин при 26°C в течение 6 суток. Культивирование проводили на модифицированной среде Чапека с частичной заменой сахарозы на кератин волос (0,5% сахарозы и 10% кератина). В фильтратах культуральной жидкости дейтеромицета, полученных путем их фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,23 мкм на различных этапах культивирования, определяли кератинолитическую активность. Максимальная кератинолитическая активность культуральной жидкости составляла 6,26±0.38 КЕ/мл.

Для выделения и очистки кератйназы из фильтрата культуральной жидкости последовательно применяли гель-фильтрацию и аффинную хроматографию. Для проведения гель-фильтрации использовали колонку "LKB" (2,6×40 см) с гелем TOYOPEARL HW-40. На колонку наносили 10 мл фильтрата культуральной жидкости. Элюентом служил 0,15 М раствор NaCl. Детектирование осуществляли при длине волны 274 нм с помощью проточного денситометра "Uvicord 2", скорость элюции составила 3.3 мл/мин. Оптимизация условий хроматографии, таких как объем нанесенного образца и скорость элюции, позволила добиться достаточно четкого разделения указанных фракций. При этом фракция, соответствующая внешнему объему колонки и материалу с молекулярной массой выше 15 кДа, обладала значительной кератиназной активностью, превышающей кератиназную активность исходного препарата в 3,03 раза, и составляла 11,8 КЕ/мг. Однако проведенный с помощью диск-электрофореза анализ материала фракции 1 показал, что она не является гомогенной и кроме основного белка с молекулярной массой около 21 кДа содержит и другие белки с более высокими и низкими молекулярными массами, что потребовало разработки дополнительных способов очистки ферментного препарата.

Материал, обладающий кератиназной активностью, после проведения гель-фильтрации собирали и подвергали очистке методом аффинной хроматографии. Для этих целей колонку LKB объемом 9×150 мм заполняли протеин-А сефарозой в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) и наносили материал фракции, полученной после гель-фильтрации, обладающий кератиназной активностью. Элюцию проводили, используя последовательно 0,01 М фосфатный буфер, тот же буфер с 1 М NaCl и 1 М раствор уксусной кислоты до полного удаления сорбированного материала. Скорость элюции составляла 10 мл/час. Оптическую плотность элюата контролировали при длине волны 274 нм с помощью проточного денситометра "Uvicord 2". Показано, что при проведении аффинной хроматографии материал, обладающий кератиназной активностью, элюировался с колонки под действием 1 М уксусной кислоты. Кератиназная активность других фракций практически равнялась нулю. Электрофоретический анализ с помощью диск-электрофореза в ПААГ [Шелудько, 1975] выявил только одну гомогенную белковую фракцию с молекулярной массой около 21 кДа. При этом после проведения аффинной хроматографии ферментативная активность полученного препарата возрастала до 231,1 КЕ/мг, то есть увеличивалась в 59,3 раза. В таблице 2 представлены результаты хроматографической очистки кератиназы, продуцируемой Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР.

Полученный раствор ферментного препарата разливали в стерильные пенициллиновые флаконы по 5 мл, замораживали их в морозильной камере «Sanyo Ultra Low» при -60°C и лиофильно высушивали на лиофильной сушилке «Edwards» (Англия) при - 40°C и 0,1-0,2 атм.

Положительный эффект изобретения заключается в увеличении продукции кератиназы культурой Penicillium citrinum PC-5 4-91 ВИЛАР в 4,2 раза, сокращении времени культивирования с 21 до 6 суток по сравнению с прототипом и в получении препарата кератиназы, расщепляющего способ получения кератиназы из penicillium citrinum, патент № 2499833 -кератин волос в двухстадийном хроматографическом процессе с продуктивностью 19 мг/л культуральной жидкости и активностью 231 КЕ./мг, выходом 70% и степенью очистки 59,3 раза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Brandelli A., Daroit J.D., Riffel. 2010. A. Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:1735-1750

2. Nickerson W.J., Princeton, Novel J.J. Process of treating keratinaceous material and a keratinase produced thereby. US 2988487 13.06.1961

3. Жеребцов Н.А., Насонова Л.В. Способ получения кератиназы. SU 1565888 А1 Опубликовано 23.05.90

4. Yang Haojie, You Shu., Ni Liqiang Method for preparing keratinase. CN 1687410 (А). Опубликовано 26.10.2005

5 Macedo A.J., Beys da Silva, Gava R., Driemeier D. 2005. Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting Remarkable dehairing capabilities. Appl. Envirom. Microbiol. 71(10:594-596

6. Mazotto A.M., Lage Cedrola S.M.., Lins U., Rosado A.S., Silva K.T., Chaves J.Q.. Rabinovitch L., Zindali R.B., Vermelho A.B. 2010. Keratinolytic activity of Bacillus subtillus AMR using human hair. Lett. Appl. Microbiol. 50:89-96

7. Wen Du, Yanfeng Han, Jiandong Liang, Zongqi Liang, Jiwei Zhang. Myceliophthora thermophilia strain and application thereof in aspect of producing keratinase. CN 101717727 (А). Опубликовано 06.02.2010

8. Malathi S., Chakraborty R. 1991 Production of protease by a new Aspergillus flavus isolate under solid-substate fermentation conditions for use as a depilation agent. Appl. Environ. Microbiol. Mar.: 712-716

9. Gradizar H., Fridrich J., Krizaj I., Jerala R. 2005. Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Paecilomyces marguandii and Doratomyces microsporus to some known proteases. Appl. Environ. Microbiol. 71(7)3420-3426

10. Marcondes N.R., Taira C.L., Vandresen D.C., Svindzinski T.I.E., Kadowaki M.K., Peralta M.R. 2008. New feather-degrading filamentous fungi. Microb. Ecol. 56:13-17

11. Anbu P, Gopinath S.C.B., Hilda A., Mathivanan N., Annadurai G. 2006.

Secretion of keratinolytic enzymes ang keratinolysis by Scopulariopsis brevicaulis and Trichophyton mentagrophytes: regresson analysis. Can. J. Microbiol 52:1060-1069

12. Гордонова И.К., Никитина З.К., Зон Х.Ч., Томашевич С.В., Быков В.А. 2009. Вопросы биол., медиц. и фармецевтич. химии. 1:19-24

13. Li Chen, Wei Lui, Xiao Hu, Kai Huang, Jiu-Lin Wu, Qi-Qing Zhang. 2011 Citrinin derivates from the marine-derived fungus Penicillun citrinum. Chem. Pharm. Bull. 59(4):515-517

14. Kuramata M, Fujioka S., Shimada a., Kawano Т., Kimura Y. 2007. Citrinolactones A, B and C, and sclerotinin C, plant regulators from Penicillum citrinum. Biosci Biotechnol. Biochem. 71(2):499-503

15. Ichishima E., Yamaguchi M., Yano H., Yamagata Y., Hirano K. 1991. Specifity of a new metalloproteinase from Penicillum citrinum. Agric. Biol. Chem. 55(8):2191-2193

16. Pimentel M.C., Melo E.H., Lima Filho J.L., Duran N. 1996. Production of lipase free of citrinin by Penicillum citrinum. Mycopathologia. l33(2):119-12117.

17. Yamaguchi M., Hanzawa S., Hirano K., Yamagata Y., Ichishima E. 1993. Specifity and molecular properties of penicillolysin, a metalloproteinase from Penicillum citrinum. Phytochemistry 33(6)6:1317-1321

18. Su, N.-Y., Yu C.-J., Der Shen Y., Pan F.-M, Chow L.-P. 2001. Pen с 1, a novel enzymatic allergen protein from Penicillum citrinum. European Journal of Biochemistry 261:115-123.

19. Watazu Y., Nagamatsu K., Shirahase Y., Kaneda N., Murao S, Okabe H. 1994. Isolation and characterization of a serine Proteinase, inactivating m-subunit of lactate degidrogenase, from Penicillum citrinum KE-1. Biosci. Biotech. Biochem. 58(4):745-751

20. Гордонова И.К., Дмитриев Г.В., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Орехов С.Н. 2007. Поиск микроорганизмов - продуцентов кератиназ. Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. 4:11-15

21. Шелудько Н.С. 1975. Цитология. 17(10):1148-1154

22. Никитина З.К., Гордонова И.К. 2011. Некоторые свойства кератинолитического фермента, секретируемого Cladosporium sphaerospermum. Вопросы биол, медиц. и фармацевтич. химии. 5:36-39

Таблица 1
Кератиназная активность Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР и штамма Penicillium citrinum в прототипе
Способ получения, № № пассажа на модифицированной среде Количество кератина (глубинное культивирование), % Время культивирования, сутКератиназная активность, КЕ/мл
1 01,510 1,08±0,08
2 11,58 1,47±0,10
3 21,57 2,35±0,15
4 31,56 2,60±0,16
5 356 4,73±0,32
6 3106 6,26±0,38
Прототип 0121 1,48±0,095

Таблица 2
Схема очистки кератиназы из культуральной жидкости Penicillium citrinum PC-54-91 ВИЛАР (на 100 мл питательной среды)
ПроцедураОбщий белок, мгОбщая кератиназная активность, КЕУдельная кератиназная активность, КЕ/мл Удельная кератиназная активность, КЕ/мг Степень очисткиВыход по активности, %
Фильтрат КЖ 152595 6,263,91 100
Гель-фильтрация 41482 1,6911,83,03 81
Аффинная хроматография1,8 4161,30231,1 59,370

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2499833

patent-2499833.pdf

Класс C12N9/58 получаемые из грибов

штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности -  патент 2499039 (20.11.2013)
полученная из микроорганизма протеаза усовершенствованного типа, обеспечивающая свертывание молока -  патент 2495931 (20.10.2013)
ферментный препарат тромболитического и фибринолитического действия из базидиального гриба рода coprinus -  патент 2435848 (10.12.2011)
способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной -  патент 2380416 (27.01.2010)
способ получения молокосвертывающего фермента -  патент 2354698 (10.05.2009)
штамм базидиального гриба trametes hirsuta (wulfen) pilát- продуцент голубой лакказы -  патент 2345135 (27.01.2009)
способ получения технического препарата лакказы -  патент 2345134 (27.01.2009)
субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" -  патент 2340371 (10.12.2008)
полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды -  патент 2318018 (27.02.2008)
штамм гриба aspergillus oryzal - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов -  патент 2070921 (27.12.1996)

Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них

ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля -  патент 2527899 (10.09.2014)
питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала -  патент 2527074 (27.08.2014)
способ восстановления чувствительного слоя биосенсора -  патент 2524438 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы -  патент 2514224 (27.04.2014)
штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы -  патент 2511427 (10.04.2014)
способ получения грибной белковой биомассы -  патент 2511041 (10.04.2014)
мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение -  патент 2507252 (20.02.2014)
способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 -  патент 2503715 (10.01.2014)

Класс C12R1/80 Penicillium

штамм гриба penicillium simplicissimum (oudem.) thom - продуцент шерининов -  патент 2422508 (27.06.2011)
способ получения безглютеновой споровой или плесневой культуры, принадлежащей к виду реnicillium roqueforti, и безглютеновая споровая или плесневая культура penicillium roqueforti, используемая для получения сыра с голубыми прожилками, предназначенного для лиц, страдающих целиакией, и способ получения молочного продукта с голубыми прожилками -  патент 2409192 (20.01.2011)
способ получения тартрата эпоксиагроклавина-i и хиноцитрининов -  патент 2386692 (20.04.2010)
генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата -  патент 2378372 (10.01.2010)
штамм гриба penicillium verrucosum, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами, и средство-иммуномодулятор на его основе -  патент 2373276 (20.11.2009)
штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы -  патент 2361918 (20.07.2009)
способ получения ферментного препарата для расщепления гемицеллюлозных гетерополисахаридов клеточной стенки растений и ферментный препарат (варианты) -  патент 2358756 (20.06.2009)
штамм penicillium sizovae - деструктор лигнина древесины -  патент 2355753 (20.05.2009)
штамм мицелиального гриба penicillium funiculosum - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, -глюканазы, -глюкозидазы, ксиланазы и ксилоглюканазы, и способ получения ферментного препарата комплекса карбогидраз для осахаривания лигноцеллюлозных материалов -  патент 2323254 (27.04.2008)
способ биологической очистки серосодержащих сточных вод -  патент 2314267 (10.01.2008)
Наверх