универсальный способ очистки воздуха, жидких сред и поверхностей при помощи биосовместимого микропористого кремния для противовирусной обработки в быту, в медицине и на производстве

Формула изобретения

Способ очистки воздуха, жидких сред и поверхностей, включающий противовирусную обработку, для чего используют раствор частиц микропористого кремния.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, биотехнологии и нанотехнологии.

Из уровня медицины хорошо известны технические решения аналогичного характера.

Так, из уровня медицины известными являются «Способы и изделия, имеющие высокую противовирусную и противобактериальную эффективность», раскрытые в заявке на изобретение № 2008152442/15, A01N 25/08, 04.06.2007. В частности, известен способ уничтожения вирусов и бактерий на неживой поверхности, включающий обработку поверхности композицией, содержащей соединение, способное снижать рН неживой поверхности до значения менее приблизительно 4 в течение, по меньшей мере, приблизительно 0,5 ч и вплоть до восьми часов, где соединение, способное снижать рН неживой поверхности, выбрано из группы, состоящей из (a) органической кислоты, (b) неорганической кислоты, (c) неорганической соли, включающей катион, имеющий валентность, равную 2, 3 или 4, и противоион, способный снижать рН кожи до значения менее приблизительно 4, (d) алюминия, циркония или алюминиево-циркониевого комплекса и (е) их смесей, и соединение, способное снижать рН неживой поверхности, присутствует в композиции в количестве от приблизительно 0,05 до приблизительно 15% по массе композиции, и композиция имеет рН от приблизительно 2 до менее чем приблизительно 5, где соединение образует по существу непрерывный барьерный слой на неживой поверхности.

Также из уровня медицины известными являются «Композиции, обладающие сильным противовирусным действием», раскрытые в описании к заявке 2008152402/15, A01N 37/36, 29.05.2007. В частности, представлен способ сокращения популяции вируса на поверхности, включающий обработку поверхности твердой композицией, включающей: (а) порошкообразный твердый субстрат, выбранный из группы, состоящей из оксида кремния, глины, сверхабсорбирующего полимера и их смесей; и (b) обладающее эффективным вирулицидным действием количество органической кислоты, включающей одну или более из поликарбоновых кислот, включающих от двух до четырех карбоксильных групп, при необходимости, содержащих одну или более гидроксильных групп, аминогрупп или обеих, и полимерную кислоту, содержащую множество карбоксильных, фосфатных, сульфонатных и/или сульфатных фрагментов, в котором композиция образует, по существу, непрерывный барьерный слой, включающий органическую кислоту на поверхности.

Кроме того, известным является «Способ улучшения борьбы с вирусами на коже», раскрытый в описании к заявке 2008151426/14, A61K 31/78, 23.05.2007. В частности, описан способ уменьшения вирусной популяции на живой поверхности, включающий: (а) контактирование поверхности с композицией для предварительной обработки, содержащей анионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество или их смесь и имеющей рН от приблизительно 5 до приблизительно 7, затем (b) контактирование поверхности с противовирусной композицией, способной достигать логарифмического понижения по меньшей мере на 4 порядка против безоболочечных вирусов после 30 с контакта, где противовирусная композиция содержит: (i) от приблизительно 25% до приблизительно 75%, по массе, С1-6 дезинфицирующего спирта или их смеси; (ii) вирулицидно эффективное количество органической кислоты, включающей (i) две или несколько поликарбоновых кислот, содержащих от двух до четырех карбоксильных групп, причем каждая необязательно содержит одну или несколько гидроксильных групп, аминогрупп или и те, и другие, и (ii) полимерную кислоту, имеющую множество карбоксильных, фосфатных, сульфонатных и/или сульфатных фрагментов; и (iii) от 0 до приблизительно 5%, по массе, гелеобразующего агента, выбранного из группы, состоящей из целлюлозы, производного целлюлозы, гуара, производного гуара, альгина, производного альгина, нерастворимого в воде C8-C20 спирта, каррагенана, смектитовой глины, поликватерниевого соединения и их смесей, и имеет рН от приблизительно 2 до приблизительно 5, где противовирусная композиция образует на живой поверхности практически непрерывный барьерный слой, содержащий органическую кислоту.

Также известным является «Средство для лечения и профилактики острых распираторных вирусных и бактериальных заболеваний и способ его получения», раскрытый в описании к патенту РФ № 2407738 C07D 235/14, C07D 401/06, C07D 403/06, C07D 403/12, C07D 405/06, A61K 31/454, A61K 31/4178, A61K 31/496, A61K 31/5355, A61P 31/12, 03.07.2009. Изобретение относится к новым противовирусным активным компонентам, представляющим собой замещенные 2-аминометил-1-бензил-1H-бензо[d]имидазола общей формулы 1 или их фармацевтически приемлемым солям, фармацевтической композиции, противовирусным лекарственным средствам, способу профилактики и лечения вирусных заболеваний, особенно вызываемых вирусами гепатита C (HCV). В общей формуле 1 R1 представляет собой один или два заместителя циклической системы, в том числе атом водорода, С1-С3алкил, С1-С3алкилокси или атом галогена; R2 представляет собой атом водорода или С1-С3алкил; R3 и R4 представляют собой неодинаковые заместители аминогруппы, в том числе водород, С1-С2алкил, С1-С3-алканоил, необязательно замещенный фураноил; необязательно замещенный или необязательно аннелированный с 5-6 членным азагетероциклом фенил; или R3 и R4 вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют морфолин-4-ил, 4-(С1-С3алкилзамещенный)-пиперазин-1-ил, a R1 и R2 имеют вышеуказанное значение, или пиперидин-1-ил, при условии, что R1 имеет вышеуказанное значение, a R2 представляет собой С1-С3алкил, или при условии, что R1 представляет собой водород или о-фтор, a R2 имеет вышеуказанное значение.

Кроме того, из уровня медицины известны технологии аналогичного назначения, раскрытые в описаниях зарубежных охранных документах, например, US 7910595, US 7910587, US 7910523, US 7910313, US 7906550, WO 2010000207, WO 2010047295, EA 201070053 и др.

Ближайших аналогов не обнаружено.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание универсального способа очистки воздуха, жидких сред и поверхностей при помощи биосовместимого микропористого кремния для противовирусной обработки в быту, в медицине и на производстве.

При реализации данного изобретения достигаются несколько результатов, один из которых заключается в возможности унификации исходных материалов для создания эффективных противовирусных препаратов, а другой - в многофункциональности его применения.

Выделяют три основных метода дезинфекции: физический, биологический и химический.

К физическому методу относят: воздействие высокой температуры, например, в виде пара, кипячения, стерилизации горячим воздухом, прокаливания, сжигания; обработку ультрафиолетом или ультразвуком.

Биологические способы обеззараживания реализуются с помощью биологических фильтров, биотермических камер и компостирования.

К химическим средствам дезинфекции можно отнести воздействие химических соединений, например, хлорсодержащих реагентов, брома, йода и их производных, фенолов и крезолов, гуанидина, альдегидов, спиртов, оксидов, кислот, щелочей и др.

Традиционными химическими средствами дезинфекции являются хлорактивные препараты органической (хлорамин, хлорпроизводные циануровой кислоты и гидантоина) и неорганической (гипохлориты) природы.

Ряд хлорактивных веществ дешев, однако к их недостаткам относится резкий неприятный запах, коррозионное действие, для некоторых характерна плохая растворимость в воде, неустойчивость при хранении.

Из соединений йода наиболее широкое применение нашли йодофоры - вещества, представляющие комплекс йода и носителя, в качестве которого используются высокомолекулярные вещества и ПАВ.

Выраженное бактерицидное, туберкулоцидное, фунгицидное и вирулицидное действие, а также спороцидный эффект йодофоров обусловливают применение этих веществ в качестве антисептиков и очень ограниченно для дезинфекции отдельных объектов.

Широко применяется в здравоохранении для дезинфекции, стерилизации и предстерилизационной очистки перекись водорода. Она обладает такими ценными качествами, как отсутствие запаха, быстрое разложение во внешней среде на нетоксичные продукты, отсутствие аллергенного действия.

Однако перекись водорода малостабильна, производит выраженное местнораздражающее действие и, по сравнению с другими дезинфектантами, имеет низкую бактерицидную активность. Жидкая форма средств на основе перекиси водорода неудобна для применения, что побуждает исследователей к поиску перекисных соединений в твердой форме.

В последнее десятилетие благодаря своим свойствам большое распространение получили дезинфицирующие средства из группы ПАВ. По способности ионизироваться в водных растворах их разделяют на катионные, анионные, амфолитные и неионогенные ПАВ. В качестве самостоятельных дезинфектантов используют катионные и амфолитные ПАВ, соединения всех групп применяют как потенцирующие добавки в составе композиционных дезинфицирующих средств.

Высокой антимикробной активностью и широким спектром действия отличаются препараты из группы надкислот. Такими дезинфицирующими средствами являются дезоксон-1, дезоксон-4. Последний препарат отличается наличием стабилизатора, позволяющего использовать его растворы при температуре 500С. Действующее начало этих препаратов - надуксусная кислота (5-6%). Дезоксоны обладают высокими бактерицидными, вирулицидными, туберкулоцидными, фунгицидными и спороцидными свойствами. Наличие такого широкого спектра действия позволяет использовать препараты для дезинфекции различных объектов при инфекциях различной этиологии. Однако достаточно сильный запах уксуса, присущий дезоксонам, затрудняет широкое их использование. Дезоксон-1 является одним из немногих препаратов, который можно применять для стерилизации гибких эндоскопов.

Из группы альдегидов в практике дезинфекции используются формальдегид, глутаровый альдегид и дезинфектанты на их основе. Формальдегид применяют в виде растворов (водных или спиртовых) и в виде газа в комбинации с паром. Несмотря на высокую антимикробную активность, применение формальдегида ограничено в связи с сильным раздражающим действием и наличием канцерогенных свойств. Глутаровый альдегид получил более широкое применение в качестве дезинфицирующего средства, но для его эффективного воздействия необходима щелочная среда, получаемая путем добавления активаторов.

Таким образом, краткий анализ показывает, что вопросам создания новых, более совершенных дезинфицирующих средств, изучению их свойств, антимикробной активности, устойчивости, изучению токсичности уделяется большое внимание.

В последнее время происходят активные исследования медико-биологические свойств различных наноматериалов, в частности на основе серебра.

Имеются сообщения о том, что ионы серебра обладают выраженной способностью инактивировать вирусы осповакцины, гриппа штаммов A-1, B, Митрс-штамма, некоторых энтеро- и аденовирусов, а также ингибировать вирус СПИДа и оказывают хороший терапевтический эффект при лечении вирусного заболевания Марбург, вирусного энтерита и чумы у собак.

При этом выявлено большое преимущество терапии коллоидным серебром по сравнению со стандартной терапией.

Однако следует заметить, что фармакологические препараты водного коллоидного серебра не устойчивы, частицы серебра агрегируются беспорядочно в крупные агрегаты при хранении, что резко снижает антибактериальные свойства серебра.

Еще в 2009 году профессором Тимошенко В.Ю. были сделаны предположения о вирулицидных свойствах наночастиц кристаллического кремния (c-Si) и мезопористого кремния (мезо-ПК) размерами 100-200 нм.

Такие предположения основывались на соразмерности нанокристаллов и вирусов, что принципиально не исключало их взаимодействия.

Результаты некоторых исследований такого взаимодействия при использовании предоставленных профессором Тимошенко В.Ю. наночастиц с-Si и мезо-ПК подтвердили наличие вирулицидных свойств растворов нанокристаллического кремния. Однако выраженный вирулицидный эффект был получен лишь при достаточно больших его концентрациях более 2 мг/мл [1].

Дальнейшие исследования показали значительную зависимость вирулицидных свойств нанокристаллов кремния от их размера.

Это позволило высказать предположение о наличии значительно более сложных процессов физико-биологического взаимодействия кремниевых наночастиц и вирусных биологических субстанций, чем это представлялось ранее.

Исследованные нами водные растворы микропористого кремния (микро-ПК, размер менее 10 нм) показали более чем на порядок большую вилулицидную эффективность при существенно меньшей их концентрации.

Ниже приведено краткое описание экспериментальных исследований вирулицидного действия микро-ПК, характеристики используемых материалов и образцов, ни в коей мере не ограничивающих возможные варианты экспериментальных исследований.

Исходными являлись готовые растворы частиц микропористого кремния. На основе исходных были приготовлены растворы препаратов с концентрацией 2 мг/мл. При этом в качестве растворителя использован PBS с рН 7,0.

Далее, с использованием того же растворителя, были приготовлены 2-кратные разведения с 1/2 по 1/128 в объеме 200 мкл.

К каждому разведению добавили по 20 мкл вирусосодержащей жидкости (штамм ВИЧ-1/Bru, 1,5*10³ TCID50) и перемешали на оборудовании Wortex в течение 20 минут.

Затем пробы центрифугировали при 1600 об/мин 10 мин при комнатной температуре. Полученный супернатант в объеме 20 мкл использовали для заражения клеток СЕМ SS. Конечная множественность составляла 75 TCID50.

Результаты экспериментальных исследований представлены в табл.1. В таблицу занесены результаты контроля зараженности в процентах в зависимости от концентрации суспензий.

Таблица 1
Разведения	1/1	1/2	1/4	1/8	1/6	1/32	1/64	1/128
Концентрация, мг/мл	2	1	0,5	0,25	0,12	0,06	0,03	0,015
Уровень зараженности, %	0,7	2,2	1,9	10,9	3,6	67,8	98,8	93,4

Полученные данные свидетельствуют о том, что препараты на основе микропористого кремния проявляют значительный вирулицидный эффект уже при концентрации их водного раствора 0,12 мг/мл.

Наиболее известные и часто встречающиеся у людей заболевания связаны с респираторными инфекциями. Одним из возбудителей таких инфекций является респираторно- синцитиальный вирус (РСВ). РСВ быстро передается от человека к человеку воздушно-капельным путем и вызывает инфекции верхних и нижних дыхательных путей. РСВ является наиболее частой причиной заболевания людей, и в особенности детей.

Культивирование респираторно-синцитиального вируса (РСВ) штамма Long осуществляли в клетках МА-104 (клетки эмбриональной почки макаки резус). Для этого клетки культивировали в полной среде DMEM (10% ЭТС, 300 мг/л глутамина, 80 мг/л Гентамицина) в течение суток до образования монослоя 75% конфлуентности, затем меняли среду на безсывороточную DMEM (300 мг/л глутамина, 80 мг/л Гентамицина) и инфицировали клетки вирусом РСВ при MOI=0,01 с последующим инкубированием в течение 4 часов при 37°C, в 5%-ой атмосфере СO₂. Затем удаляли среду, содержащую вирионы, отмывали клетки безсывороточной средой DMEM от не связавшихся вирусных частиц и добавляли свежей безсывороточной среды DMEM с последующим инкубированием в течение 4 суток до достижения примерно 90%-ого цитопатического эффекта, который наблюдали методом световой микроскопии.

Среду, полученную от культивирования инфицированных клеток, которая содержала новообразованные вирионы РСВ, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут для осаждения клеточного дебриза. Надосадок с вирусными частицами аликвотировали и хранили при -70°C до использования в экспериментах.

Полученный вирусный материал смешивали в равных объемах с частицами микропористого кремния различной концентрации, растворенных в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ). В качестве положительного контроля использовали ФСБ без микро-ПК. В качестве отрицательного контроля использовали ФСБ без РСВ. Полученную смесь РСВ и микро-ПК (размеры частиц менее 10 нм) перемешивали на качалке в течение 20 минут при 1200 об/мин. Затем смесь центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин для осаждения кремниевых частиц. В полученном супернатанте определяли количество жизнеспособных вирионов титрованием на подготовленном монослое клеток.

Для этого клетки МА-104 засевали на 96-луночный планшет в количестве 104 кл/лун в полной среде DMEM и инкубировали в течение суток до образования монослоя. Затем клетки отмывали безсывороточной средой DMEM и инфицировали полученным супернатантом, осуществляя двоичное титрование. Инфицирование проводили в четырех повторах, в конечном объеме 100 мкл/лун. Клетки с внесенным супернатантом инкубировали в течение 8 суток, и оценивали образование синцития, вызванного действием РСВ на монослое методом световой микроскопии. В табл.2 представлены результаты 5 независимых экспериментов с респираторным вирусом (RS virus Long). Приведенные в табл.2 цифры означают уровень заражения клеток в % относительно контроля (0 мг/мл=100%).

Таблица 2
Концентрация, мг/мл	0	0,002	0,2	2
Уровень заражения, %	100±10	60±15	17±10	0,02±0,1

На фиг.1 представлены графики зависимостей уровня зараженности от концентрации водного раствора микро-ПК, построенные с использованием данных табл.1 и табл.2. Аналогичные данные были получены при исследовании вирулицидного действия на распространенный оболочечный герпесвирус.

С целью визуализации взаимодействия микро-ПК и вирусов, с помощью электронного микроскопа были получены изображения различных стадий этого процесса.

На фиг.2-4 представлены фотографии, полученные с помощью электронного микроскопа, которые поясняют механизм вирулицидного эффекта.

Как видно на фиг.2, исследуемые вирусы представляют собой группы шарообразных субстанций. После воздействия предлагаемых препаратов на вирусы, последние оказываются блокированными со всех сторон частицами микро-ПК, что делает невозможным их дальнейшее взаимодействие с клетками живых организмов (см. фиг.3). При большем увеличении электронного микроскопа можно увидеть, как именно блокирован одиночный вирус частицами микропористого кремния (см. фиг.4).

На основе результатов базовых экспериментов разработаны и практически проверены рекомендации использования рассмотренного вирулицидного эффекта для очистки воздуха, жидкостей, и поверхности предметов, ни в коей мере не ограничивающие возможные концентрации растворов микро-ПК и удельные расходы растворов для различных применений (см. табл.3).

Таблица 3
	Воздух	Вода	Поверхность
Исходная концентрация вируса, TCID50	100	1500	1500
Концентрация раствора, мг/мл	0,01	0,1	0,2
Удельный расход	140 мл/м3*)	0,1 мг/мл	100 мл/м2
Примечание: *) - удельный расход растворов микро-ПК для очистки воздуха зависит от применяемого способа очистки. Приведенный в табл.3 удельный расход характеризует способ, основанный на барботаже потока воздуха через слой раствора с линейной скоростью 4-6 см/с при промежутке времени 2 часа между сменами картриджей с раствором объемом 12,5 л.

Таким образом, на основании экспериментально полученных данных может быть сделан вывод о том, что исследованные препараты микропористого кремния обладают универсальным вирулицидным эффектом, снижая заражающую активность вируса на 80-100% при концентрациях растворов 0,1-0,2 мг/мл и могут быть широко использованы в быту, в медицине и на производстве.

Использованные источники

1. Гилязова Алла Владимировна. Микробициды с анти-вич-активностью. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва 2010.