стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции

Классы МПК:C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них
A61K38/01 продукты гидролиза белков; их производные
A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-09-26
публикация патента:

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл. Изобретение может быть использовано для размножения регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от аутоиммунного заболевания, с целью последующего введения полученных Т-лимфоцитов данному больному. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Рисунки к патенту РФ 2499043

стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биопрепаратам медицинского назначения, предназначенных для воздействия на иммунную систему организма, а именно на активность Т-лимфоцитов, а именно к стимуляторам пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов.

Минорная субпопуляция Т-лимфоцитов, называемая регуляторными Т-лимфоцитами (Treg), способна, с помощью нескольких механизмов, ингибировать пролиферацию обычных Т-лимфоцитов, выполняя важную функцию подавления активности Т-клеток, направленной против собственных антигенов организма. Фенотипически регуляторные Т-лимфоциты отличаются наличием маркеров CD4+CD25+FoxP3+ [Aune Т.М. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. -v.2. - p.765-774].

Повышенное содержание регуляторных Т-лимфоцитов наблюдается в лимфоцитах опухолей и дренирующих лимфоузлов опухолей, что, возможно, является одной из причин подавления Т-клеточного иммунного ответа организма на антигены опухоли. В связи с этим повышение активности и/или содержания Treg в организме может стать способом лечения ряда аутоиммунных заболеваний, осложнений, связанных с пересадкой органов и тканей, включая пересадку костного мозга, например болезни «трансплантат против хозяина». В частности, в настоящее время предложен способ лечения аутоиммунных и аллоиммунных заболеваний путем забора у больного, нуждающегося в данном лечении, лейкоцитарной массы, выделении из нее клеток с фенотипом CD4+CD25+, последующем культивировании данных клеток in vitro продолжительностью до 4-х недель с целью их размножения и обратном введении полученных клеток больному (WO 2005086781, 2004).

В качестве агентов, стимулирующих пролиферацию регуляторных Т-клеток предлагается использовать азацитидин, фактор некроза опухоли-бета, ретиноевую кислоту, трихостатин А, анти-CD3, анти-CD28, окисленный АТФ, интерлейкин-2 (WO 2009126877, 2008; WO 2009114097, 2008).

Недостатком данных стимуляторов является то, что они не являются строго избирательными стимуляторами пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов, что вызывает необходимость в поиске более специфичного активатора пролиферации таких клеток.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является использование в качестве стимулятора цитокинов, в частности, интерлейкина-2, который вводят в культуральную среду в дозе 100 Ед/мл (WO 2005086781, 2004). Недостатком этого стимулятора является недостаточная специфичность.

Задачей, стоящей перед авторами, являлось расширение арсенала стимуляторов пролиферации регуляторных Т-клеток на пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов.

Технический результат был достигнут в результате синтеза пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа (SIRS1-21), последовательность аминокислот которого представлена в приложении 1 Seq ID NO: 1, который оказался обладающим избирательным стимулирующим влиянием на пролиферацию регуляторных Т-клеток (Treg) в популяциях лимфоцитов тимуса и селезенки.

Белок SIRS (soluble immune response suppressor), полная последовательность аминокислот которого до сих пор неизвестна, представляет собой полипептид с молекулярным весом около 10-14 кДа, который продуцируется CD8+ клетками, активированными митогенами, антигеном или интерферонами (US 4771125, 1984) и обладает способностью ингибировать продукцию антител и угнетать реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo [Aune T.M. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - p.765-774]. Последовательность аминокислот N-концевого участка SIRS мыши, содержащего 21 аминокислотный остаток (SIRS 1-21), установлена [Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - р.765-774]. Информация о возможности использования SIRS или его фрагментов в качестве стимуляторов пролиферации клеток Treg в просмотренной литературе не найдена.

В ходе проведенных исследований авторами было установлено, что пептид SIRS 1-21 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+ клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток, что может быть связано с угнетением регуляторными Т-лимфоцитами пролиферации обычных лимфоцитов.

Стимуляция образования регуляторных Т-лимфоцитов осуществляется путем введения культуральную жидкость стимулятора SIRS 1-21 в концентрации 0,1-10 мкг/мл. При этом эффективность воздействия повышается при одновременном введении в систему интерлейкина-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Химический синтез N-концевого фрагмента SIRS (SIRS1-21)

Синтез пептида SIRS1-21 проводили твёрдофазным способом на синтезаторе Vega Coupler 250 по методу in situ с использованием Nстимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 -Boc-защищённых производных аминокислот. В работе были использованы следующие производные аминокислот Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asn(Trt)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Met-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH. Исходным аминоацил-полимером служил Boc-Ser(Bzl)-PAM с удельной емкостью 0,64 мМол/грамм.

Деблокирование временной трет-бутилоксикарбонильной защиты проводили 50% трифторуксусной кислотой (TFA) в хлористом метилене (DCM). Реакции конденсации проводили в диметилформамиде (DMF). Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления трехкратного избытка диизопропилэтиламина (DIPEA) непосредственно в реакционную смесь на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в DMF. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом активированных эфиров, полученных из соответствующих производных аминокислот с помощью диизопропил-карбодиимида, используя 5-кратные избытки реагентов в DMF. Смесь производных аминокислот готовили непосредственно перед внесением в реакционный сосуд. Контроль полноты реакции конденсации проводили с помощью нингидринового и бромфенолового тестов.

После завершения наращивания пептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали 50% TFA два раза по 1 минуте, промывали DCM и диэтиловым эфиром, извлекали из реактора и сушили до постоянного веса.

Отщепление пептида от полимера и удаление боковых защитных группировок проводили с помощью жидкого фтористого водорода по Snl механизму в присутствии скавенджеров.

Выделенный грубый продукт подвергался очистке методом полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6ц, 60Å, 19×300 mm (детекция при 220 нм).

Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали масс-спектральному и ВЭЖХ-анализам.

По данным MALDI-TOF-спектрометрии молекулярная масса пептида (М+Н)+ - 2281. Теоретическая молекулярная масса в расчете на свободный пептид - 2280,38.

Содержание основного вещества, пептида SIRS1-21 составило более 95% по данным ВЭЖХ.

Пример 2. Влияние SIRS1-21 на пролиферацию спленоцитов

Пептид SIRS1-21 разводили в среде RPMI-1640 с 1% эмбриональной сыворотки теленка в концентрации 1 мг/мл, далее готовили последовательные разведения и вносили в лунки 96-лу ночного плоскодонного планшета по 50 мкл на лунку. Далее в лунки вносили суспензию спленоцитов в 100 мкл среды RPMI-1640, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ТЭС), по 3×105 клеток на лунку. Постановка теста осуществлялась не менее чем в 4 параллелях для каждой экспериментальной точки.

Платы помещали в СО2-инкубатор и инкубировали при 37°С в условиях абсолютной влажности. Через 48 ч от начала инкубации в культуры клеток вносили 3H-тимидин (Изотоп, Санкт-Петербург) в конечной концентрации 5 мкКю/мл. Через сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера FilterMate 96 (Perkin-Elmer) и определяли интенсивность включения тимидина на планшетном стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 -счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer).

Результаты, выраженные в количестве Н3-тимидина, включенного в кислотонерастворимый осадок (имп/мин) представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние пептида SIRS1-21 на пролиферацию спленоцитов мыши in vitro
SIRS1-21 , мкг/млИнтенсивность пролиферации спленоцитов (имп/мин)
10 8319±387
1 7306±715
0,1 7019±386*
0,01 8416±1132
0 (контроль) 8305±1254

Анализ полученных результатов указывают на слабое угнетение пролиферации спленоцитов в присутствии 0,1 мкг/мл исследуемого пептида. Более низкие и более высокие концентрации SIRS1-21 в течение исследуемого периода времени (1 сутки) влияния на пролиферацию спленоцитов не оказывали.

Пример 3. Оценка влияния пептида SIRS1-21 на пролиферацию регуляторных Т-клеток in vitro.

В ходе эксперимента исходили из того, что цитофлюориметрически регуляторные Т-клетки могут быть идентифицированы так CD4+ CD25+ лимфоциты, экспрессирующие также транскрипционный фактор FoxP3.

Тимоциты или спленоциты мыши инкубировали с пептидом SIRS1-21 в присутствии 100-300 пг/мл рекомбинантного ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 или без него в течение 3 суток. Для определения процента регуляторных Т-клеток в суспензии тимоцитов и спленоцитов клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8 и CD25, а также к внутриклеточному маркеру FoxP3. Использовали антитела к антигенам мыши производства eBioscience: анти-РохР3-FITC (клон FJK-16s), анти-CD4-РЕ (клон GK1.5), анти-CD25-РЕ-Cy5 (клон РС61.5), анти-CD8a-РЕ-Cy5 (клон 53-6.7). Для окрашивания антителами к FoxP3 пользовались набором Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) по инструкции изготовителя. Анализ экспрессии соответсвующих маркеров проводили в трехцветном режиме на цитофлюориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние SIRS1-25 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток в культивируемых тимоцитах и спленоцитах мыши
SIRS1-21, мкг/мл Содержание CD4+CD25+FoxP3+ клеток (%)
ТимоцитыСпленоциты
Без ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 С ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 3 пг/мл Без ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 С ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 3 пг/мл
100200 300100200 300
0 0,430,38 0,380,372,4 2,52,8 2,7
0,1 0,480,500,50 0,543,0 3,03,03,4
16,50,63 0,770,85 0,797,375,4 5,565,1
400,48 0,830,920,88 7,395,52 5,585,55
500,410,90 0,990,95 7,395,585,61 5,60

Из таблицы 2 видно, что лучшие результаты достигаются при инкубации клеток в присутствии 16,5 мкг/мл SIRS1-21. При этом наблюдается 1,5-2-кратное увеличение содержания CD4+CD25+FoxP3+ в суспензии тимоцитов и 2-3-кратное увеличение содержания клеток этого фенотипа в суспензии спленоцитов.

Для тимоцитов эффект SIRS1-21 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток более выражен на фоне ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 , который сам на содержание данных клеток в популяции тимоцитов практически не влияет. Таким образом, SIRS1-21 стимулирует пролиферацию Treg в популяциях тимоцитов и спленоцитов, в том числе в присутствии в среде культивирования ИЛ-1стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их   стимуляции, патент № 2499043 .

Из приведенных выше данных следует, что пептид SIRS1-21 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток.

Указанное свойство делает данный пептид перспективным для размножения ex vivo регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от аутоиммунного заболевания, связанного с хроническим воспалением, например, больного ревматоидным артритом, псориазом и псориатрическим артритом, диабетом 1-го типа, аутоиммунным тироидитом (болезнь Хашимото), язвенным колитом, болезнью Крона, грануломатозным васкулитом, саркоидозом, склеродермией, множественным склерозом, системным склерозом, гломерулонефритом аутоиммунной природы и другими подобными заболеваниями, при отторжении трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина», с целью последующего введения полученных Т-регуляторных Т-лимфоцитов данному больному для лечения вышеперечисленных заболеваний и патологических состояний.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, в качестве стимулятора образования регуляторных Т-лимфоцитов.

2. Способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования клеток, содержащих Т-лимфоциты, в присутствии стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора в культуральную среду вводят N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа по п.1 в концентрации 0,1-50 мкг/мл.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в среду культивирования дополнительно вводят интерлейкин-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2499043

patent-2499043.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N5/02:
способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток -  патент 2528764 (20.09.2014)
способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом -  патент 2528250 (10.09.2014)
способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани -  патент 2527182 (27.08.2014)
способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкмнк) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ммск) -  патент 2525143 (10.08.2014)
композиция для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей -  патент 2522816 (20.07.2014)
клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности -  патент 2510833 (10.04.2014)
способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда -  патент 2505602 (27.01.2014)
малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека -  патент 2493250 (20.09.2013)
стимуляция пути wnt при перепрограммировании соматических клеток -  патент 2492232 (10.09.2013)
способ оценки нейтрофилоцитопоэза на основе способности клеток реагировать на нейтрофилокины -  патент 2473903 (27.01.2013)

Класс A61K38/01 продукты гидролиза белков; их производные

Патенты РФ в классе A61K38/01:
способ хирургического лечения острого панкреатита с ранним энтеральным интраоперационным питанием пациента -  патент 2526247 (20.08.2014)
способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью -  патент 2478644 (10.04.2013)
способы и композиции для лечения сухости глаз -  патент 2470662 (27.12.2012)
композиция для лечения и/или предотвращения желудочно-кишечной инфекции -  патент 2469735 (20.12.2012)
последовательности пептидов и пептидные композиции -  патент 2466737 (20.11.2012)
способ лечения острой кишечной непроходимости опухолевой этиологии в интраоперационном и послеоперационном периоде -  патент 2457003 (27.07.2012)
индукция толерантности к белкам яиц -  патент 2445992 (27.03.2012)
жидкая фармацевтическая композиция ботулинического токсина -  патент 2440825 (27.01.2012)
лечение пациентов, подвергнутых стрессу -  патент 2437655 (27.12.2011)
композиция, обогащенная лейцином -  патент 2428977 (20.09.2011)

Класс A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

Патенты РФ в классе A61K38/16:
средство для лечения аутоиммунных заболеваний -  патент 2528337 (10.09.2014)
антибактериальный пептид хоминин klp-1 широкого спектра действия -  патент 2528055 (10.09.2014)
композиции для доставки белков и методы их применения -  патент 2526904 (27.08.2014)
оксинтомодулин человека, его применение, лекарственный препарат на его основе и способ применения препарата для лечения и профилактики гипергликемии -  патент 2524204 (27.07.2014)
композиции клеток и способы их применения для лечения сердечной ткани -  патент 2519762 (20.06.2014)
мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения -  патент 2515063 (10.05.2014)
способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius -  патент 2509801 (20.03.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
лантибиотические карбоксиамидные производные с усиленной антибактериальной активностью -  патент 2506272 (10.02.2014)
остеогенный биорезорбируемый материал для замещения костных дефектов и способ его получения -  патент 2504405 (20.01.2014)


Наверх