способ изотопного обогащения клеток e.coli

Формула изобретения

Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния, предусматривающий культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния ²⁴Mg, или ²⁵Mg, или ²⁶Mg, включающем NH₄Cl, глюкозу, Na₂HPO₄, KH ₂PO₄, NaCl и MgSO₄, при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды:

NH4Cl	2 г
MgSO4	200-260 мг
глюкоза (сухая)	8-10 г
Na 2HPO4	11,9-12,1 г
KH4PO4	5,95-6,05 г
NaCl	0,98-1,02 г

Описание изобретения к патенту

Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.

Известен способ изотопного обогащения (патент РФ № 2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой H₂O-H₂SiF₆·nSiF₄ (где n 0), и газом, содержащим SiF₄, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF₄ растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.

Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.

Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.

Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния ²⁴Mg, ²⁵Mg, ²⁶Mg, входят NH₄Cl, глюкоза, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl и MgSO₄, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:

NH₄Cl - 2 г;

MgSO ₄ - 200-260 мг;

глюкоза (сухая) - 8-10 г;

Na₂HPO₄ - 11,9-12,1 г;

KH₂PO₄ - 5,95-6,05 г;

NaCl - 0,98-1,02 г.

Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.

Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 10⁵ KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.

Первый водный раствор:

NH ₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; Na₂HPO₄ - 11,9 г; KH₂PO ₄ - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.

Второй водный раствор:

NH₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; Na₂HPO₄ - 12 г; KH₂PO₄ - 6 г; NaCl - 1 г.

Третий водный раствор:

NH₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; Na₂ HPO₄ - 12, 1 г; KH₂PO₄ - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.

Первые три вещества, NH ₄Cl, глюкоза (сухая) и MgSO₄, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, Na₂ HPO₄, KH₂PO₄ и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO₄, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.

Таблица 1
Изотоп	Магнитный момент (µв)	Природное содержание, %
24Mg	0	79
25Mg	0.85	10
26Mg	0	11

Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды ²⁴MgO, ²⁵MgO и ²⁶MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.

Таблица 2
	Содержание изотопа магния, ат.%
Изотоп	для 24MgO	для 26 MgO	для 25MgO
24Mg	99,88±0,02	97,70±0,20	99,37±0,08
25Mg	0,07	1,98	0,33
26Mg	0,05	0,20	0,30

Таблица 3
	Содержание примесей, вес.%
Элемент	для 24MgO	для 26 MgO	для 25MgO
K	<0,005	<ПО	0,017
Na	0,002	<ПО	0,004
Ca	<0,005	0,008	0,34
Fe	<0,005	0,019	0,048
Al	0,0011	0,0008	0,031
Si	<0,005	<ПО	<0,005
Cr	-	<ПО	0,0030
Ni	0,0001	<0,0002	<0,0001
Cu	0,0029	0,0021	0,0004
Mn	0,0032	0,0021	0,059
Pb	<ПО*	<ПО	0,0015
Lu	<ПО	<ПО	0,0003
Pt	<ПО	0,0031	0,0002
B	<ПО	0,008	0,0026
Ti	<ПО	<ПО	0,0015
Co	<ПО	<ПО	0,0011
Sr	<ПО	<ПО	0,0002
Ba	<ПО	0,0003	0,0002
La	<ПО	<ПО	0,0003
Eu	<ПО	<ПО	0,0002
Zn	0,0006	0,0005	0,0009
Ru	<ПО	0,0001	<ПО
Cd	<ПО	0,0001	<ПО
P	<0,005	<ПО	<ПО

Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.

Таблица 4
Изотоп	Среда М9 с 24Mg	Среда М9 с 25Mg	Среда М9 с 26Mg
24Mg	99,7	1,4	4,5
25Mg	0,12	98,1	0,61
26Mg	0,13	0,5	94,9

В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 10⁵ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 10⁸-10 ⁹ КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.

Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.

Таблица 5
Изотоп	Исход-ная куль тура	Выдержка в термоста-те, час.	Клетки, выращенные на среде М9 с 24Mg			Клетки, выращенные на среде М9 с 25Mg			Клетки, выращенные на среде М9 с 26Mg
			1-й водный р-р	2-й водный р-р	3-й водный р-р	1-й водный р-р	2-й водный р-р	3-й водный р-р	1-й водный р-р	2-й водный р-р	3-й водный р-р
24Mg	87,8	10	90,8	94,5	95,1	5,9	6,3	6,1	12,5	9,8	9,8
		13	91,1	99,5	99,4	6,0	6,6	6,5	10,4	10,0	9,9
		16	93,5	99,5	99,5	6,2	6,6	6,5	9,7	10,0	10,0
25Mg	5,9	10	6,2	3,5	3,4	90,2	91,9	91,3	2,1	3,3	3,7
		13	5,8	0,23	0,22	91,9	92,5	92,1	2,0	1,6	2,6
		16	4,7	0,24	0,23	92,3	92,5	92,4	2,2	1,6	1,7
26 Mg	6,3	10	3,0	2,0	1,4	3,9	1,8	2,6	85,4	86,9	86,5
		13	3,1	0,23	1,5	2,1	0,87	1,4	87,6	88,4	87,5
		16	1,8	0,22	0,22	1,5	0,87	1,1	88,1	88,4	88,3
* Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5%

После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.

Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.

Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.