способ стимуляции регенеративных процессов в ишемизированных тканях

Формула изобретения

Способ стимуляции регенеративных процессов в ишемизированных тканях, включающий введение в организм больного среды культивирования стромальных клеток из жировой ткани человека, содержащей факторы роста VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин в количестве, нг/млн клеток:

VEGF	4,6-21,9
HGF	0,05-0,22
Ангиопоэтин	0,4-1,3
Ангиогенин	1,4-3,9

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и фармакологии и может быть использовано с целью стимуляции ангиогенеза и нейрогенеза для лечения целого ряда заболеваний человека, таких, как трофические язвы, в том числе у больных диабетом, при заболеваниях пародонта, обширных ожогах, ишемии нижних конечностей, аллопециях, а также при повреждениях нервной системы. Ранее на моделях ишемии конечности и инфаркта миокарда и подкожно имплантированного матригеля у животных было показано, что локальное и системное введение мезенхимальными стромальными клетками из жировой ткани (МСК-ЖТ) способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. Кроме того, недавние исследования выявили, что введение МСК-ЖТ способствует прорастанию нервных окончаний в подкожно имплантированный Матригель. Однако использование клеточной терапии сегодня в России затруднено из-за отсутствия законодательной базы. Создание фармакологического препарата на основе кондиционированной среды мезенхимальных стромальных клеток, содержащей определенный качественный и количественный состав ростовых факторов и проведение доклинических, токсикологических и клинических исследований с целью сертификация препарата, коммерциализация производства и реализация через аптечную сеть не потребуют дополнительных разрешительных документов, поскольку предполагает использование биотехнологических подходов, а не клеточных технологий, и не вступает в противоречие с действующим законодательством.

В основе данного изобретения лежит выявленный факт, что основными действующими веществами в среде культивирования мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, оказывающими регенеративный эффект на восстановление структуры и функции поврежденных органов и тканей являются VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин, поскольку блокирующие антитела к этим факторам роста ингибируют общий стимулирующий эффект, который оказывает среда культивирования. Бессывороточная среда культивирования, секретированная МСК-ЖТ и содержащая комбинацию факторов роста (VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин) в определенных концентрациях эффективна для стимуляции васкуляризации и реиннервации. Изобретение позволяет получить оптимальное сочетание факторов роста, секретированных клетками человека - т.е. прошедших необходимые модификации и способствующее ангиогенезу и нейрогенезу в среде не содержащей белков животного происхождения, и бактериальных фрагментов. В дальнейшем среду культивирования возможно модифицировать при сохранении основных действующих факторов роста в определенных соотношениях (VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин) с целью сертификации препарата и для проведения доклинических, токсикологических и клинических исследований, а также коммерциализации производства. Такой препарат имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточной терапией.

Уровень техники

Мезенхимальные стромальные клетки человека обладают способностью секретировать широкий спектр хемокинов и ростовых факторов, и быстро реагировать на изменение гомеостаза ткани модификацией профиля их секреции. Таким образом, с участием мезенхимальных клеток осуществляется природный механизм регуляции регенерации тканей. Мезенхимальные клетки присутствуют во всех органах взрослого организма и могут быть выделены и культивированы in vitro. Морфологические и функциональные свойства МСК-ЖТ разного происхождения могут отличаться. Наиболее изучены Мезенхимальные клетки костного мозга (МККМ) (Трактуев и др., 2006; Lee et al., 2004). Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани (МСК-ЖТ), считаются перспективным типом клеток для терапии различных заболеваний. Во-первых, процедура выделения МСК-ЖТ из жировой ткани менее инвазивна и позволяет получить более значительный выход клеток на единицу объема ткани, чем при выделении МСК-ЖТ из костного мозга (Zuk, 2002; Yamamoto, 2007; Bieback, 2008; Fraser, 2008; Bailey, 2010). И, во-вторых, показано, что локальное и системное введение МСК-ЖТ-ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. По существующим на сегодняшний день представлениям, МСК-ЖТ могут способствовать реваскуляризации ткани путем встраивания в формирующиеся сосуды реципиента, и благодаря своей способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в частности путем секреции ангиогенных факторов роста и цитокинов. Стромальные клетки жировой ткани могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК-ЖТ-ЖТ приводит к получению гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток (Zuk et al., 2002), однако, использование клеточной терапии на основе мезенхимальных клеток затруднено из-за отсутствия законадательной базы сегодня в России по применению клеточных технологий. В этой связи использование среды культивирования для создания в дальнейшем фармакологического препарата имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточной терапией, поскольку предполагает использование разрешенных биотехнологических подходов. Известно, что МСК-ЖТ из жировой ткани секретируют "коктейль" факторов роста и цитокинов, однако, основные действующие факторы в составе среды культивирования, ответственные за регенеративный эффект этих клеток не определены. В этой связи выявленные в настоящем изобретении 4 фактора роста, ответственные за регенеративный эффект МСК-ЖТ, в дальнейшем станут основой для создания и сертификации нового фармакологического препарата, который может быть в дальнейшем использован для стимуляции ангиогенеза и нейрогенеза при лечении целого ряда заболеваний человека в медицине.

В связи с этим, представлялось существенным выявить основные действующие факторы, содержащиеся в среде культивирования МСК-ЖТ, оказывающие стимулирующее действие на регенерацию тканей и представляющие собой оптимальное сочетания факторов роста и цитокинов. На основе полученных данных в дальнейшем становиться возможным создание фармацевтического препарата, его сертификация и проведение доклинических, токсикологических и клинических исследований, а также коммерциализации производства.

Раскрытие изобретения

Поставленная задача была решена путем сравнения эффективности введения МСК-ЖТ для стимуляции ангиогенеза и среды культивирования МСК-ЖТ, не содержащей клетки, на нескольких моделях in vivo и in vitro. Результаты этих исследований показали, что стимулирующий эффект введения МСК-ЖТ в основном обусловлен секрецией факторов роста и цитокинов в среду культивирования, что позволяет в дальнейшем использовать среду культивирования, а не клетки, для стимуляции регенерации тканей. Затем были использованы блокирующие антитела к 4 факторам роста VEGF, HGF, ангиопоэтину и ангиогенину, которые практически полностью блокировали стимулирующий эффект среды культивирования МСК-ЖТ. Эти данные позволяют сделать вывод, что для стимуляции ангиогенеза, который лежит в основе регенерации тканей, необходимы 4 фактора роста, секретируемые в среду культивирования МСК-ЖТ-ЖТ в оптимальном соотношении, без которых среда культивирования теряет свои стимулирующие свойства.

Для культивирования МК-ЖТ использовали среду AdvanceSTEM в сочетании с коммерческими добавками AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement, которая была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных мезенхимных стволовых клеток, в частности клеток, происходящих из жировой ткани без добавления сыворотки (http://www.thermo.com). При этом было установлено, что

а) МСК-ЖТ мыши и человека при введении как сингенно, так и ксеногенно стимулируют регенерацию (реваскуляризацию и реиннервацию)

б) Эффекты обнаруженные при введении среды культивирования МСК-ЖТ в целом воспроизводят эффекты получаемые при введении клеток

в) удаление из среды культивирования ключевых ангиогенных факторов приводит к практическому исчезновению регенеративного эффекта.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Стимуляция роста кровеносных сосудов МСК-ЖТ мыши на модели подкожной имплантации Матригеля. 1 МСК-ЖТ, смешивали с Матригелем, обедненным ростовыми факторами, в количестве 7×10⁵ клеток на имплантат и вводили подкожно мышам. 2 Имплантаты анализировали через 10 дней. 3 Оценка количества CD31-положительных образований на срезах имплантатов Матригеля (n=3, по 5 срезов на образец). Иммуногистохимическая окраска замороженных срезов имплантатов Матригеля, содержащих МСК-ЖТ маркер эндотелиальных клеток (CD31, зеленая флуоресценция) и, объектив ×40.

Фиг.2. Влияние МСК-ЖТ на развитие сосудистой сети в матригеле

Мышам линии Balb/c вводили под кожу 400 мкл матригеля, смешанного со 100 мкл следующих растворов: (А) - среда без сыворотки; (Б) - МСК-ЖТ мыши, 2×106/мл в среде без сыворотки. Срезы окрашены иммуногистохимически антителами против сосудов мыши (CD31- зеленый) и антителами против перицитов (NG2 - красный). Двойная окраска - стабильные сосуды отмечены стрелками.

Фиг.3. Выявление окончаний нервных волокон в Матригеле. А-Г. Срезы матригеля, окрашенные антителами против белка периферических нервных окончаний GAP43 (красная флуоресценция). А - срез контрольного матригеля (с добавлением DMEM, 10% ЭБС), Б - срез матригеля с добавлением коктейля нейротрофических факторов В27; В - срез матригеля, содержащего МСК-ЖТ, культивированных при 21% O2 (МСК-ЖТ _норм); Г - срез матригеля, содержащего МСК-ЖТ, культивированных при 1% O2 (МСК-ЖТ _гипокс). Д - среднее количество GAP43-позитивных структур в поле зрения (n=15, * - р<0,05 по сравнению с контролем); Е - суммарная длина нервных волокон в поле зрения (n=100, * - р<0,05 по сравнению с контролем, - р<0,05 по сравнению с группами В27 и МСК-ЖТ-ЖТ_норм).

Фиг.4. Макрофотографии нижней конечности мыши после экспериментальной ишемии и введения МСК-ЖТ контрольной (А) и ишемизированной лапы (Б), Результаты подсчета числа сосудов на срезах ишемизированных мышц (В), Кровоток в правой (П) и левой (Л) лапе после перевязки бедренной артерии, 5 суток после введения МСК-ЖТ по данным Лазер-допплера.

Фиг.5. Ксеногенное подкожное введение Матригеля с клетками МСК-ЖТ человека мышам линии Nude. Перед введением в Матригель МСК-ЖТ были трансфицированы плазмидой для экспрессии флуоресентного белка DsRed (красная флуоресценция) с целью их дальнейшей визуализации на криосрезах Матригеля (отмечены овалом) (Б), ядра докарашены Dapi (А). Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против сосудов мыши (CD31- зеленая флуоресценция) (В).

Фиг.6. Влияние среды культивирования МСК-ЖТ человека на выживание и пролиферацию эндотелиальных клеток человека HUVEC. За 24 часа до начала эксперимента HUVEC высаживали на пластик, покрытый Матригелем, с плотностью 2,5-5×10 ³/см² в среде EGM-2 /10% ЭТС. За 15 часов до эксперимента культуральную среду заменяли на ЕВМ-2/5% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка). Перед началом эксперимента среда в лунках была заменена на: 1) 100% ЕВМ-2 /5% ЭТС (); 2) 50% ЕВМ-2 /5% ЭТС+50% среды, собранной с МСК-ЖТ человека, культивированных 72 часа при 21% O₂; 3) 50% ЕВМ-2 /5% ЭТС+50% среды, собранной с МСК-ЖТ человека, культивированных 72 часа при 1% O₂. Эксперимент продолжался 96 часов, после чего проводили подсчет количества клеток в лунках (n=3).

Фиг.7. Влияние среды культивирования МСК-ЖТ человека на уровень апоптотической активности эндотелиальных клеток человека HUVEC. За 24 часа до начала эксперимента HUVEC сажали на пластик с плотностью 2,5-5×10 ³/см² в среде EGM-2/10% ЭТС. За 15 часов до эксперимента культуральную среду заменяли на ЕВМ-2/ 5% ЭТС. Перед началом эксперимента среда в лунках была заменена на: 1) 100% ЕВМ-2/5% ЭТС; 2) 50% ЕВМ-2/ 5% ЭТС+50% среды, собранной с МСК-ЖТ человека, культивированных 72 часа при 21% 02; 3) 50% ЕВМ-2/5% ЭТС+50% среды, собранной с МСК-ЖТ человека, культивированных 72 часа при 1% O₂. Эксперимент продолжался 96 часов, после измеряли долю апоптотических клеток (n=3).

Фиг.8. Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ. А -отрицательный контроль (ЕВМ-2 без ростовых добавок); Б - положительный контроль (полная среда ЕВМ-2 с коммерческими добавками); В - кондиционированная среда от МСК-ЖТ; Объектив ×10.

Фиг.9. Формирование капилляроподобных структур клетками HUVEC in vitro. В среду культивирования МСК-ЖТ добавляли нейтрализующие антитела к VEGF в различной концентрации (10нМ, 100нМ, 1 мкМ, ЮмкМ, соответственно). Антитела к VEGF дозозависимо подавляют формирование капилляроподобных структур.

Фиг.10 Стимуляция роста кровеносных сосудов при введении МСК-ЖТ человека и среды культивирования от МСК-ЖТ на модели подкожной имплантации Матригеля, обедненного ростовыми факторами, мышам линии Nude. В качестве контроля Матригель смешивали со средой культивирования клеток без добавок (А); В эксперименте смешивали Матригель с концентрированной средой культивирования МСК-ЖТ человека (Б) или с МСК-ЖТ человека в количестве 7×10⁵ клеток на имплантат и вводили подкожно мышам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами против CD31 мыши.

Фиг.11. Сравнительный анализ восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши под влиянием введения МСК-ЖТ и среды культивирования МСК-ЖТ в ишемизированную мышцу. А, Б - Восстановление кровотока по данным лазер-доплеровского сканирования (%); В - гистограмма оценки числа капилляров на мышечное волокно в результате количественного подсчета сосудов на криосрезах мышцы; Г, Д, Е - Иммуногистохимическое окрашивание срезов мышцы антителами CD31 против сосудов мыши.

Осуществление изобретения.

При осуществлении изобретения среду культивирования получали с помощью технологии, включающей ферментативное выделение МСК-ЖТ человека из жировой ткани, культивирование в среде поддерживающей рост недифференцированных клеток, сбор среды культивирования и осаждение дебриса с помощью центрифугирования, стерилизацию супернатанта через фильтр с диаметром пор 0.1 µm и концентрацию. Однако помимо вышеуказанной технологии и способов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, специалисту в данной области техники хорошо известны другие методики по культивированию клеток, которые можно использовать для получения необходимой среды для культивирования.

Пример 1. Введенные МСК-ЖТ сингенно мышам Balb/c вызывают васкуляризацию в подкожный имплантат Матригеля

Влияние МСК-ЖТ мыши на рост кровеносных сосудов in vivo оценивали на модели ангиогенеза в подкожном имплантате Матригеля. Для этого 7×10 МСК-ЖТ 2-ого пассажа вводили подкожно сингенным мышам линии Balb/c в виде суспензии в Матригеле, обедненном факторами роста (Growth factors reduced Matrigel, BD Biosciences) по одной инъекции в каждый бок. Введение осуществляли под наркозом (2.5%-ный раствор авертина интраперитонеально). Для 1 инъекции 400 мкл холодного (4°С) Матригеля смешивали со 100мкл суспензии клеток в среде роста. В качестве отрицательного контроля вводили смесь Матригеля и 100мкл среды без клеток, в качестве положительного контроля - Матригель с добавлением 50нг/мл bFGF в присутствии гепарина. Инъекции проводили инсулиновым шприцем с иглой толщиной 23 G таким образом, чтобы Матригель успевал полимеризоваться под кожей и образовывал желеобразный имплантат неправильной формы.

Через 10 дней после подкожного введения суспензии клеток в Матригеле, мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации, полностью изымали имплантаты и взвешивали их. Далее имплантаты Матригеля замораживали в жидком азоте в среде для заморозки тканей Tissue-Tek (Sakura, Япония) для последующего приготовления срезов толщиной 6 мкм и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Оценку плотности кровеносных сосудов на срезах Матригеля проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Для этого срезы имплантатов Матригеля фиксировали в 4% растворе формалина (Рапгеас, Испания) 10 мин при комнатной температуре с последующей отмывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ). После отмывки срезы инкубировали в 0,05М растворе ацетата аммония на ФСБ (10 минут), отмывали ФСБ и инкубировали в 1% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин), содержащем 10% сыворотки осла (30 мин). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре с моноклональными антителами крысы против маркерного антигена эндотелия сосудов мыши (CD31) (BD Pharmigen, кат. № 550274, США) в течение 1 часа. После трехкратной отмывки ФСБ срезы помещали в раствор вторичных антител осла, конъюгированных с флуорохромом Alexa488 (Molecular Probes, США) на 1 час. Для выявления зрелых сосудов часть срезов одновременно инкубировали с антителами кролика против маркера перицитов NG2 мыши (Chemicon, кат. № ab5320, США) и антителами осла против кролика, конъюгированными с флуорохромом Alexa594 (Molecular Probes, США). В качестве отрицательного контроля срезы инкубировали с неспецифическими изотипическими иммуноглобулинами крысы и кролика.

Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert200M (Zeiss, Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRc (Zeiss, Германия) в программе Axio Vision. Размер сосудов и их плотность оценивали с помощью программного обеспечения MetaMorph 5.0 (Universal Imaging) и ClickCounter. Подсчет сосудов проводили в 5 полях зрения на срезе (по 12 срезов на каждый имплантат) при 20-кратном увеличении, отдельно выделяя капилляры (CD31-положительные образования без просвета или длиной менее 20 мкм), сосуды среднего диаметра (CD31-положительные образования диаметром или длиной 20-50 мкм) и крупные сосуды (диаметром более 50 мкм). Полученное число сосудов в поле зрения нормировали на единицу площади среза.

Ангиогенный потенциал, оценивали по их способности стимулировать васкуляризацию имплантатов Матригеля при введении МСК-ЖТ подкожно мышам. С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля на маркеры эндотелия сосудов CD31 и перицитов NG2 оценивали количество и состав прорастающих в матригель сосудов реципиента в ответ на введение МСК-ЖТ (Фиг.2). Обнаружено, что введение МСК-ЖТ мышам сингенно увеличивает васкуляризацию подкожных имплантатов Матригеля, по сравнению с контролем (Фиг.1).

Из Фиг.2 видно, что введение «пустого» матригеля без клеток характеризуется низкой степенью развития сосудов. Анализ гистологических срезов образцов «матригеля с клетками» выявил выраженное развитие сосудистой сети с высокой плотностью капилляров, а также значительными размерами отдельных капилляров и мелких сосудов. Кроме того, увеличивается число стабильных сосудов, что видно исходя из анализа количества двойного иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к CD31 и NG2 (данные обсчета не представлены). Полученные данные свидетельствуют о том, что введение МСК-ЖТ способствует стимуляции прорастания и стабилизации новых сосудов в Матригель.

Пример 2. Введенные МСК-ЖТ сингенно мышам Balb/c вызывают прорастание нервных волокон в Матригель

Для анализа прорастания нервных волокон в Матригель проводили иммунофлуоресцентное окрашивание замороженных срезов толщиной 20 мкм антителами против GAP43 аналогично методике, описанной в примере 1. Для этого замороженные срезы отмывали от фиксатора и инкубировали в 1% растворе БСА, содержащем 10% нормальной сыворотки осла в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее срезы инкубировали в растворе антител кролика против GAP43 мыши (Abeam, кат. № ab12274) в течение 1 часа при комнатной температуре. После отмывки несвязавшихся антител срезы инкубировали в растворе вторичных антител осла против кролика, конъюгированных с флуорохромом А1еха595. В качестве отрицательного контроля антитела заменяли неспецифичными иммуноглобулинами кролика.

Ядра клеток докрашивали флуоресцентным красителем DAPI. После трехкратной отмывки в ФСБ срезы заключали в среду Mounting Medium VectashieldTM (Vector Laboratories Inc.). Готовые образцы хранили при 4°С в темноте.

Для оценки количества нервных волокон и их длины в имплантатах Матригеля срезы, окрашенные антителами против маркерного белка растущих нервных окончаний, GAP43, анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM1000 и цифровой камеры Leica DFC 290. Подсчет количества и длины GAP43+структур проводили более чем на 10 снимках срезов каждого имплантата с использованием компьютерной программы Metamorph (MetaMorph Offline, version 7.1.7.0, Molecular devices).

Рост кровеносных сосудов сопряжен с ростом нервных волокон: все сосуды иннервируются, а нервы в свою очередь кровоснабжаются. Более того, факторы роста, стимулирующие рост кровеносных сосудов, в частности, VEGF и HGF, также активируют и прорастание нервных волокон. Поэтому мы предположили, что введение МСК-ЖТ может стимулировать рост нервных окончаний. Чтобы проверить это предположение, мы вводили МСК-ЖТ в Матригель и анализировали прорастание нервных волокон. Поскольку ишемия тканей сопровождается гипоксией мы попытались ответить на вопрос, будет ли сохраняться стимулирующий эффект МСК-ЖТ, если их культивировать в условиях гипоксии перед введением в Матригель. Для этого сравнивали количество прорастающих нервных волокон при подкожном введении МСК-ЖТ в Матригеле сингенным мышам линии Balb/c, культивированных в обычных условиях (при 21% O2) или при пониженном содержании кислорода (1% O2) (условия, стимулирующие продукцию клетками МСК-ЖТ ангиогенных факторов) (Фиг.3).

Через 10 дней после введения в имплантатах оценивали содержание нервных волокон с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов Матригеля антителами против маркерного белка растущих периферических нервных окончаний GAP43 и последующего морфометрического анализа. В контрольных имплантатах, содержащих вместо МСК-ЖТ среду роста (DMEM, 10% ЭБС), количество нервных волокон не превышало 12 (в среднем 8±4) в поле зрения (рисунок 3А, Д). В имплантатах, содержащих вместо клеток смесь нейротрофических факторов В27 («Invitrogen», США) или bFGF (250 нг/мл), было обнаружено до 27 (в среднем 16±11) GAP43-позитивных структур в поле зрения (рисунок 3 Б, Д). В то же время, при введении в Матригель МСК-ЖТ количество нервных волокон достигало 40 и более (в среднем 30±10) в поле зрения (рисунок 3В, Г, Д).

При введении МСК-ЖТ увеличивалось не только количество прораставших нервных волокон, но и их длина (рисунок 3Е). На срезах Матригеля, содержащего МСК-ЖТ, культивированные при 21% кислорода, суммарная длина нервных волокон была в 3 раза больше, чем в контрольных (в среднем суммарная длина в поле зрения составила 35±5 пикселей). В случае, когда Матригель содержал МСК-ЖТ, культивированные при 1% кислорода, были обнаружены GAP43-позитивные структуры, суммарная длина которых была в 5 раз больше (в среднем суммарная длина в поле зрения составила 50±7 пикселей), чем длина таких же структур в контрольном Матригеле.

Таким образом, введение МСК-ЖТ эффективно стимулирует прорастание нервных волокон на модели подкожной имплантации Матригеля. Причем культивирование МСК-ЖТ в гипоскических условиях усиливает способность МСК-ЖТ стимулировать нейрогенез, что позволяет предполагать, что введение этих клеток в ткань в условиях ишемии для стимуляции восстановления нервных волокон или предкультивирование МСК-ЖТ в гипоксических условиях будет усиливать регенеративный потенциал МСК-ЖТ.

Пример 3. Модель ишемии нижних конечностей мыши

Для экспериментов на модели ишемии нижней конечности мыши использовали самцов 8-12 месячного возраста линии Balb/c или Nude. Операции проводили в асептических условиях под ламинаром с положительным давлением воздуха. Перед операцией животных анестезировали 2,5% авертином из расчета 10 мл/кг веса.

На коже средней части левого бедра делали продольный разрез длиной 8 мм, после чего соединительную и жировую ткань расчищали в стороны от пучка бедренной артерии, вены и нерва. Выделяли бедренную артерию, а также все ее веточки, после чего артерию перевязывали в области паховой связки сверху и снизу после бифуркации ее на подкожную и подколенную артерии. Все веточки артерии, находящиеся между основными лигатурами, также перевязывали, после чего сосуд вырезали. По окончании операции кожу на бедре зашивали. Для перевязки сосудов использовали шелковую нить 6-0, а для зашивания кожи - абсорбирующуюся нить Vicryl 4-0.

На следующий день после проведения операции, непосредственно после проведения первого измерения кровотока (базальный кровоток), мышам через хвостовую вену в 200 мкл среды без сыворотки вводили 5×10 ⁵ МСК-ЖТ 2 пассажа или внутримышечно вводили 1×10 ⁵ в 100 мкл среды без сыворотки МСК-ЖТ 2 пассажа.

Измерение кровотока

Влияние введенных клеток на стимуляцию ангиогенеза оценивали по восстановлению кровотока в подошвенной области лапы мышей. Для оценки кровотока использовали лазер-допплеровский имиджер (Laser Doppler Imaging System, Moor, Великобритания) по модифицированной нами методике Т. Couffinhal.

В приборе используется инфракрасный лазер 2,5 мВт, генерирующий луч света, способный проникать на глубину до 1 мм. Метод измерения кровотока основан на том, что, в соответствии с принципом Доплера, клетки крови, «протекающие» в сосуде, вызывают сдвиг частоты испускаемого света, который и фиксируется прибором.

Измерения кровотока проводили на 1-ый, 5-ый и 10-ый день после проведения операции. Животное анестезировали газовой смесью 1,5% изофлорана/O₂ и поддерживали на этой анестезии в течение всего измерения. Животное помещали на матрас с поверхностной температурой 37-38°С, и до начала сканирования выдерживали минимум 10 мин при этих условиях. В обработку включались данные, полученные при условии, что разница в результатах трех последовательных измерений, проведенных с интервалом в 2 минуты, не превышала 5%. Для снижения возможного разброса результатов измерений при переходе от одного животного к другому, а также для исключения влияния внешних факторов (свет, глубина наркоза, температура в лаборатории и т.д.) данные обрабатывали в виде отношения кровотока в ишемизированной конечности (левая лапа) к кровотоку в интактной лапе.

Иммуногистохимическт анализ

Подготовка тканей

Образцы мышц замораживали в жидком азоте в среде О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония). Образцы хранили при температуре -70°С. Анализ экспрессии антигенов проводили на замороженных срезах толщиной 10 мкм на стеклах «super frost», обеспечивающих хорошую адгезию. Стекла со срезами тканей фиксировали в течение 2 минут в ацетоне, охлажденном до -20°С.

Детектирование антигена мыши CD31 на срезах мышц

Для блокирования активности эндогенной пероксидазы стекла инкубировали в растворе 0,3% H ₂O₂/ФСБ в течение 10 мин. Для снижения неспецифического связывания антител с образцами на срезы наносили блокирующий раствор (БР): 2% БСА/5% кроличьей сыворотки/ФСБ на 30 мин. После удаления излишка БР, срезы инкубировали в течение 60 мин с крысиными моноклональными антителами против мышиного CD31 антигена (BD Pharmingen, кат. № 550274) при разведении 1:50-1:100 в БР.

Для контроля на специфическое связывание антител с CD31 использовали неиммунные антитела крысы - IgG2a,k R35-95 (BD Pharmingen, кат. № 559073) при соответствующем разведении.

Для детектирования антител, связавшихся с антигеном CD31, использовали набор реактивов компании Vector Lab (PK-6104). После промывки в ФСБ на срезы наносили на 30 мин кроличьи поликлональные биотинилированные антитела в разведении 1:1000. Отмыв стекла от излишков антител, срезы инкубировали 30 мин с комплексом авидин/биотин-пероксидаза хрена. Локализацию комплексов антител выявляли с помощью DAB (Sigma, D4168). Для длительного хранения срезов стекла обезвоживали и помещали в ксилен-совместимую среду Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific, кат. № 8312-4).

Подсчет капилляров

Для каждого среза m.tibialis anterior с окрашенными CD31 ⁺ клетками с помощью цифровой фотокамеры получали серию снимков, охватывающих более 80% поверхности среза. Подсчет количества CD31⁺ клеток и миофибрилл проводили с использованием компьютерной программы Metamorph (MetaMorph Offline, version 7.1.7.0, Molecular devices). Плотность капилляров на срезе определяли как отношение CD31⁺ клеток к миофибриллам.

Статистическая обработка данных

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием Меритерия Стьюдента и теста для межгрупповых сравнений при многократных измерениях - One Way ANOVA с использованием программ Prism 4 и Instat Software. Там, где это было необходимо, результаты представлены как средние значение±стандартная ошибка среднего результата трех или более независимых экспериментов.

Пример 4. Введение МСК-ЖТ человека в составе Матригеля стимулирует прорастание сосудов у мыши

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение МСК-ЖТ стимулирует прорастание сосудов разного диаметра и нервных волокон в Матригель. Эффекты, связанные с действием МСК-ЖТ на неоваскуляризацию ишемизированных тканей обусловлены тем, что донорские МСК-ЖТ могут встраиваться в сосуды реципиента и стабилизировать их или стимуляция ангио- и нейрогенеза вызвана тем, что МСК-ЖТ секретируют факторы роста и хемокинами в зоне введения.

Ранее нами было показано, что клетки МСК-ЖТ мыши 2-ого пассажа, меченные прижизненным красителем PkH26 (Sigma), при подкожном введении в Матригель по методике, аналогичной описанной в примере 1, сингенным мышам линии Balb/c способны встраиваться в сосуды (данные не представлены). Однако при ксеногенном введении МСК-ЖТ человека, трансфицированных плазмидой DsRed, в тех же условиях, обнаружено, что меченые клетки человека не встраиваются в сосуды реципиента (Фиг.5). Напротив, донорские ксеногенные клетки человека располагаются кластерами и не колокализуются с сосудами. Несмотря на это, введение клеток человека в этих условиях оказывает стимулирующее действие на васкуляризацию Матригеля, о чем свидетельствует увеличивающееся количество прорастающих в Матригель сосудов мышиного происхождения по сравнению с контролем, поскольку антитела к CD31 обладают видовой специфичностью и позволяют отелить сосуды мыши от сосудов человека. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что МСК-ЖТ человека способны оказывать паракринное действием в зоне введения, предположительно за счет секреции факторов роста и цитокинов, которые во многом гомологичны у человека и мыши.

Итак, можно говорить о существовании двух механизмов определяющих индуцирующее действие МСК-ЖТ на рост кровеносных сосудов: обусловленное способностью МСК-ЖТ встраиваться в периэндотелиальное пространство в стенке формирующихся сосудов секреторной активностью этих клеток.

МСК-ЖТ секретируют множество факторов роста, активирующих ангиогенез и регенерацию тканей. Эти факторы активируют пролиферацию и миграцию зрелых и прогениторных эндотелиальных клеток, а также предотвращают их апоптоз, обусловливая, тем самым, рост кровеносных сосудов. Большинство из этих факторов также необходимы для индукции роста нервных волокон, поскольку они стимулируют пролиферацию предшественников шванновских клеток (наши собственные неопубликованные данные).

Полученные данные позволили нам предположить, что для стимуляции ангиогенеза и нейрогенеза возможно эффективно применять среду культивирования, кондиционированную мезенхимальными стволовыми клетками. Такой подход позволили бы избавиться от ряда ограничений связанных с использованием собственно клеток в связи с отсутствием законодательной базы в России по клеточным технологиям, а также позволил бы создать и сертифицировать фармакологический препарат на основе среды культивирования МСК-ЖТ.

Таким образом, использование сред культивирования МСК-ЖТ может иметь ряд преимуществ по сравнению с использование клеток МСК-ЖТ для стимуляции регенеративных процессов:

1. Получение среды культивирования от охарактеризованной линии клеток человека является на сегодняшний день отработанной и внедренной в производство технологией. Разработаны методы стерилизации и стабилизации компонентов среды.

2. Снимается вопрос иммунного ответа тканей реципиента на аллогенные клетки.

3. Нет необходимости выделения и получения отдельной популяции клеток для каждого пациента.

Пример 5. Влияние среды культивирования МСК-ЖТ-ЖТ человека на пролиферацию эндотелиальных клеток и апоптоз

Для подтверждения высказанного предположения были проведены ряд экспериментов in vitro, свидетельствующие о том, что среда культивирования оказывает стимулирующее действие на пролиферацию эндотелиальных клеток и капиллярогенез, а также защищает эндотелиальные клетки от апоптоза.

Нами была использована модель оценки пролиферативного и апоптотического потенциала собранных с МСК-ЖТ сред, культивированных в нормальных и гипоксических условиях. Среду культивирования МСК-ЖТ, собранную через 72 часа после начала эксперимента, использовали для изучения ее стимулирующего влияния на эндотелиальные клетки HUVEC. Рекомендованной средой культивирования HUVEC является EGM-2, представляющая собой базовую среду ЕВМ-2 с добавлением набора ростовых факторов необходимых для культивирования и поддержания морфо-функциональных характеристик эндотелиальных клеток человека. В эксперименте собранную с клеток МСК-ЖТ среду смешивали в равном объеме со свежей средой ЕВМ-2/5%ЭСБ и наносили на клетки HUVEC человека.

Результаты эксперимента, представленные на Фиг.6 и 7 показывают, что культивирование HUVEC в течение четырех дней в среде ЕВМ-2/5%ЭСБ приводило к выживанию только 31,8±4,0% посаженных клеток. Культивирование клеток в среде, содержащей 50% среды МСК-ЖТ, культивированных в стандартных условиях (21% О₂), приводило к полному выживанию клеток и пролиферации (115,4±10,6%), а в случае среды, содержащей 50% среды МСК-ЖТ, культивированных в условиях гипоксии (1% O₂), приводило еще и к значительной пролиферации клеток (161,5±13,9%) и снижению уровня апоптоза.

Как следует из описанных экспериментов, было достигнуто статистически достоверное отличие не только между контрольной средой и средой, содержавшей 50% кондиционированной среды МСК-ЖТ (р<0,001 в обоих случаях), но также между средами, собранными с клеток, культивированных в нормальных и гипоксических условиях (р<0,05). Принимая во внимание, что в данном эксперименте на HUVEC наносили только 50% раствор кондиционированной среды от МСК-ЖТ, можно предположить, что при нанесении на клетки более концентрированной среды (вплоть до 100%) эффект может быть еще более выраженным.

Пример 6. Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде с помощью иммуноферментного анализа (ELISA)

С помощью иммуноферментного анализа (ELISA) оценили продукцию МСК-ЖТ человека в среду культивирования основных ангиогенных факторов: VEGF, P1GF, HGF ANGPT1, TBS1 и Ang. Для оценки количества исследуемых факторов были использованы наборы реагентов компании R&D Systems (США).

Кондиционированную среду, полученную при культивировании МСК-ЖТ при необходимости концентрировали в 10 раз с использованием концентрирующих фильтров (Centricon, Millipore). Измерение проводили следующим образом: 96-луночные планшеты, содержащие антитела к исследуемому факторуу, инкубировали с образцами кондиционированных сред или со стандартами белков исследуемых факторов в качестве положительного контроля в течение 2 часов. После четырехкратной промывки специальным промывочным растворов наносили вторые биотинилированные поликлональные антитела козы в концентрации 0,2 мкг/мл на два часа, а затем повторяли процедуру отмывки. В качестве фермента, связывающегося с биотинилированными антителами, использовали стрептовидин-пероксидазу хрена в разведении 1:200, с которой инкубировали образцы 20 минут. Для развития ферментативной реакции в лунки вносили субстрат на 20-30 мин, после чего реакцию останавливали добавлением стоп-раствора. Уровень поглощения раствора в лунках определяли с помощью прибора Anthos Zenith 310 при длине волны 450 нм с корректировкой при длине волны 620 нм. По результатам для разных разведении белкового стандарта строили калибровочную кривую, по которой определяли концентрацию исследуемого белка в образцах кондиционированных сред и пересчитывали ее на количество клеток для каждого образца.

Для того чтобы оценить секреторную активность МСК-ЖТ кондиционированные среды, собранные за 48 часов культивирования, были проанализированы по содержанию таких ангиогенных факторов, как VEGF, P1GF, HGF, ангиопоэтин 1 типа, тромбоспондин 1 типа и ангиогенин. Результаты измерения белков с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) представлены в таблице.

Таблица 1
Содержание факторов роста в среде культивирования МСК-ЖТ-ЖТ человека, измеренное методом иммуноферментного анализа (ELISA)
Фактор (n = количество пациентов)	Содержание в кондиционированной среде МСК-ЖТ-ЖТ, нг/млн клеток
VEGF (n=53)	4,6-21,9
PLGF (n=40)	2,2-13,1
HGF (n=43)	0,05-0,22
Ангиопоэтин (n=39)	0,4-1,3
Ангиогенин (n=40)	1,4-3,9
Тромбоспондин-1 (n=40)	52,0-260,9
PAI-1 (n=39)	62,6-258,0

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов, P1GF - плацентарный фактор роста, Angpt1 - ангиопоэтин 1 типа, TBS1 - тромбоспондин 1 типа, Ang - ангиогенин.

Из таблицы видно, что в среде культивирования МСК-ЖТ присутствуют основные ангиогенные факторы VEGF, HGF, Ангиопоэтин-1 и ангиогенин, которые по данным литературы также участвуют в нейрогенезе.

Пример 7. Влияние кондиционированной среды от МСК-ЖТ на формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле

Ангиогенную активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ в среду оценивали с помощью анализа формирования капилляроподобных структур на Матригеле, обедненном ростовыми факторами (Growth factors reduced Matrigel, BD Biosciences) эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC). Для этого предварительно депривированные в течение 18 часов эндотелиальные клетки вены пуповины человека (HUVEC) 2-4 пассажа высаживали на 48-луночный планшет, покрытый Матригелем, обедненным ростовьми факторами, в количестве 2×104 клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавляли кондиционированную среду от МСК-ЖТ в соотношении 1:1 со средой роста ЕВМ-2 для HUVEC. Каждый образец кондиционированной среды использовали не менее чем в двух лунках. В качестве отрицательного контроля использовали среду роста эндотелиальных клеток ЕВМ-2, не содержащую коммерческих добавок, в качестве положительного контроля - полную среду роста HUVEC-ЕВМ-2 с коммерческими добавками (ЕВМ-2 BulletKit, Lonza). Для блокирования действия VEGF добавляли антитела против VEGF (Abeam, ab9570) в концентрации 0,1 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля для нейтрализующих антител использовали неспецифические изотипические иммуноглобулины мыши. Планшет помещали в CO₂-инкубатор при 37°С на 24 ч, после чего анализировали образование капилляроподобных структур с помощью светового микроскопа (Leica, Германия). Суммарную длину трубчатых структур в 5 случайно выбранных полях зрения в каждой лунке подсчитывали на изображениях, полученных при использовании объектива ×10 с помощью программы MetaMorph 5.0 (Universal Imaging).

Поскольку предполагается, что способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов обусловлена в значительной степени продукцией паракринных факторов, мы проанализировали ангиогенную активность суммарных продуктов секреции клеток в среду культивирования. На модели формирования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro мы обнаружили, что кондиционированная среды МСК-ЖТ способна стимулировать образование тубулярных структур также эффективно, как и полная среда для формирования капилляроподобных трубочек ЕВМ-2 с коммерческими добавками (ЕВМ-2 BulletKit, Lonza) (фиг.8), что свидетельствует о том, что МСК-ЖТ секретируют все необходимые ангиогенные факторы.

Одним из важнейших проангиогенных факторов, играющим центральную роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, является VEGF. Как было показано ранее, МСК-ЖТ секретируют VEGF в среду культивирования. Мы проанализировали вклад VEGF в эффект стимуляции образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками в присутствии кондиционированной среды от МСК-ЖТ. Добавление блокирующих антител против VEGF человека приводило к подавлению стимуляции образования тубулярных структур в среднем на 57 (40; 65)%, причем этот эффект был тем больше, чем выше были показатели содержания мРНК VEGF в клетках (r=0,64, р=0,09) и уровня продукции VEGF в среду культивирования (r=0,94, р=0,02) (Фиг.9).

Таким образом, на модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками было подтверждено, что блокирование VEGF в кондиционированной среде МСК-ЖТ приводит к подавлению этого эффекта в среднем на 57%.

Пример 8. Среда культивирования МСК-ЖТ, введенная подкожно в Матригеле, стимулирует прорастание сосудов и нервов аналогично введению МСК-ЖТ

На следующем этапе оценивали влияние среды культивирования на васкуляризацию и иннервацию матригеля введенного подкожно. Для этого матригель смешивали в соотношении 1:3 с концентрированной кондиционированной средой МСК-ЖТ человека или с таким же объемом среды, содержащей клетки МСК-ЖТ. Эксперимент проводили по описанным в предыдущих примерах методикам. В качестве отрицательного контроля использовали стандартную среду МСК-ЖТ без каких-либо добавок. Проведенное исследование показало, что кондиционированная среда МСК-ЖТ столь же эффективно стимулирует прорастание сосудов в Матригель, как и введение клеток МСК-ЖТ (Фиг.10), а также аналогичным образом кондиционированная среда МСК-ЖТ столь же эффективно стимулирует прорастание нервных волокон в Матригель, как и введение клеток МСК-ЖТ (данные не представлены).

Пример 9. Среда культивирования МСК-ЖТ, введенная подкожно в Матригеле, стимулирует прорастание сосудов и нервов аналогично введению МСК-ЖТ.

Проведенные исследования in vivo и in vitro показали, что кондиционированная среда от МСК-ЖТ вызывает эффекты сравнимые с введением собственно клеток МСК-ЖТ по стимуляции ангио- и нейрогенеза. Далее было необходимо подтвердить полученные данные на модели ишемии нижней конечности, при которой развивается гипоксия. На модели реваскуляризации ишемизированной конечности мыши была проведена количественная оценка влияния среды культивирования МСК-ЖТ человека на восстановление кровотока и было проведено сравнение эффектов среды культивирования с аналогичным действием клеток МСК-ЖТ человека. Для этого, в ишемизированную мышцу (создание ишемии описано в примере 3) ежедневно вводили кондиционированную среду от МСК-ЖТ. А в качестве положительного контроля использовали введение МСК-ЖТ. В качестве отрицательного контроля, как и в предшествующем эксперименте, вводили свежую среду роста без добавок. На 1, 5 и 10 сутки оценивали изменение кровотока в ишемизированной конечности (как описано в примере 3). На приведенных графиках видно, что эффект восстановления кровотока в ишемизированной лапе в случае применения кондиционированной среды от МСК-ЖТ сравним с эффектом, вызванным введением МСК-ЖТ (Фиг.11А, Б).

Криосрезы ишемизированных мышц окрашивали иммуногистохимически антителами к мышиным сосудам CD31 (Фиг.11Г, Д, Е). На срезах ишемизированных мышц подсчитывали число капилляров на мышечное волокно (Фиг.11В). Статистическая обработка полученных результатов подтвердила, что кондиционированная среда оказывает достоверный стимулирующий эффект на реваскуляризацию ишемизированной мышцы по сравнению с контролем, причем этот эффект сравним по результативности с введением собственно клеток МСК-ЖТ (Фиг.11В).

Таким образом, в этой части работы на животных моделях показано, что использование кондционированной среды МСК-ЖТ по своему эффекту сопоставимо с введением МСК-ЖТ.

Пример 10. Использование блокирующих антител для выявления основных действующих факторов, содержащихся в среде культивирования МСК-ЖТ, ответственных за паракринный эффект при регенерации этих клеток

И, наконец, для выявления ключевых факторов, присутствующих в среде культивирования МСК-ЖТ человека и опосредующих эффекты, связанные с реваскуляризацией и реиннервацией, использовали последовательное исключение наиболее важных, на наш взгляд факторов, продуцируемых МСК-ЖТ. Для этого в среду культивирования последовательно добавляли блокирующие антитела к VEGF, PLGF, HGF, Ангиопоэтин-1, Ангиогенину, Тромбоспондину-1, PAI-1 и анализировали способность такой среды стимулировать формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле (данные частично представлены в примере 7) и на модели подкожного введения среды культивирования в Матригеле мышам подкожно, аналогично примеру 9. Добавление блокирующих антител против VEGF (Cosmo Bio Co., Ltd., LifeSpan BioSciences), HGF (Abeam, GeneTex), Ангиопоэтина-1 (MyBioSource, LifeSpan BioSciences), Ангиогенина (LifeSpan BioSciences, santa cruz biotechnology, inc.), но не антител к PLGF (GeneTex, RnDSystems), Тромбоспондина-1 (Invitrogen), PAI-1 (antibodies-online Inc.) человека, в среду культивирования приводило к подавлению стимуляции образования тубулярных структур и ангиогенезу на модели подкожного введения среды культивирования в Матригеле. Таким образом, было выявлено 4 ключевых фактора, которые содержатся в среде культивирования МСК-ЖТ и способны эффективно вызывать регенерацию: VEGF, HGF, Ангиопоэтин-1, Ангиогенин. Другие факторы роста, по-видимому, не оказывают существенного эффекта в реваскуляризации и иннервации или имеют более отдаленные эффекты, которые в данной работе не были исследованы.

Таким образом, в основе данного изобретения лежит выявленный факт, что основными действующими веществами в среде культивирования мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, оказывающими регенеративный эффект на восстановление структуры и функции поврежденных органов и тканей являются VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин, поскольку блокирующие антитела к этим факторам роста ингибируют общий стимулирующий эффект, который оказывает среда культивирования. Среда культивирования, содержащая продукты секреции МСК-ЖТ в виде комбинации факторов роста (VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин) в определенных концентрациях эффективна для стимуляции васкуляризации и реиннервации. Изобретение эффективно способствует ангиогенез и нейрогенез за счет использования препарата, содержащего оптимальное сочетание факторов роста, секретированных клетками человека и. В дальнейшем среду культивирования возможно модифицировать при сохранении основных действующих факторов роста в определенных соотношениях (VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин) с целью создания и сертификации препарата, для проведения доклинических, токсикологических и клинических исследований, а также коммерциализации производства.

Список литературы

1. Повещенко О.В., Колесников А.П., Ким И.И., Ульянов Е.В, Мозжерина А.Н., Янкайте Е.В., Гертер Т.В., Соловьева А.О., Зонов Е.В., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. (2008) Способы выделения и условия культивирования стромальных клеток жировой ткани человека, полученной из различных источников. Бюллетень СО РАМН, № 5 (133), 90-95.

2. Трактуев Д.О, Парфенова Е.В., Ткачук В.А., Марч К.Л. (2006) Стромальные клетки жировой ткани - пластический тип клеток, обладающих высоким терапевтическим потенциалом. Цитология, т.4. - № 2. - с.83-94.

3. Lee R.H., Kim B.C., Choi I.S. et al. (2004) Characterization and Expression Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow and Adipose Tissue. Cell Physiol Biochem; 14:311-324.

4. Liu H., Мао J., Yao K., Yang G., Cui L., Cao Y. A study on a chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitor and its tissue engineering applications. Biomater. Sci, Polym. J. 2004; 15: 25-40.

5. Llames S.G., Del Rio M., Larcher F., Garcia M., Escamez M.J. et al.. Human plasma as a dermal sccaffold for the generation of a completely autologous bioengineere skin. Transplantaion. 2004; 77: 350-355.

6. Mazlyzam A.L., Aminuddin B.S., Lokman B.S., Isa M.R., Fuzina H., Fauziah 0., et al. Quantity evaluation analysis of bioengineered human skin. Med. J. Malaysia. 2004; 59(Suppl B): 39-40.

7. Mazlyzam A.L., Aminuddin B.S., Lokman B.S., Ruszymah B.H.I. Human serum is an advantageous supplement for human dermal fibroblast expansion: clinical implications for tissue engineering of skin. Arch. Med. Res. 2008; 39: 743-752.

8. Shahdadfar A., Fronsdal K., Haug Т., Reinholt P.P., Brinchmann J.E. In vitro expansion of human mesenchymal stem cells: choice of serum is a determinant of cell proliferation, differentiation, gene expression, and transcriptome stability. Stem Cells. 2005; 23:1357-1366.

9. Specs J.L, Gregory C.A., Singh H., Tucker H.A, Peister A., Lynch P.J., Hsu S.C., Smith J., Prockop D.J. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol. Ther. 2004; 9: 747-756.

10. Sundin M., Ringden O., Sundberg В., Nava S, Gottherstrom C., Le Blanc K. No alloantibodies against mesenchymal stromal cells, but presence of anti-fetal calf serum antibodies, after transplantation in allogenic hematopoietic stem cell recipients. Haematologica. 2007; 92: 1208-1215.

11. Wijelath ES, Rahman S, Murray J, Patel Y, Savidge G, Sobel M (2004) Fibronectin promotes VEGF-induced CD34 cell differentiation into endothelial cells. J Vase Surg 39:655.

12. Yeh ET, Zhang S, Wu HD, Korbling M, Willerson JT, Estrov Z (2003) Transdifferentiation of human peripheral blood CD34+-enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells in vivo. Circulation 108:2070.

13. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002). Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell, 13:4279.

14 RU 2382077 С1, 20.02.2010.

15. US 20100008992 A1, 14.01.2010.

16. US 20080159998 A1, 03.07.2008.