антибактериальная композиция, включающая водорастворимый низкомолекулярный хитозан

Формула изобретения

Антибактериальная композиция на основе хитозана и загустителя, включающая поливиниловый спирт, и/или глицерин, и/или полиэтиленгликоль, и/или поливинилпирролидон, отличающаяся тем, что в качестве антибактериального вещества используют низкомолекулярный водорастворимый хитозан с молекулярной массой в диапазоне от 3,5 до 4,9 кДа в количестве от 0,01 до 10 мас.%, загуститель - поливиниловый спирт от 2 до 15 мас.%, и/или глицерин от 10 до 90 мас.%, и/или полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас.%, и/или поливинилпирролидон от 10 до 50 мас.%, остальное - вода.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и относится к композиции, обладающей антибактериальной активностью, характеризующуюся тем, что она содержит активное вещество - водорастворимый низкомолекулярный хитозан, а также основу.

Хитозан - сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина - является продуктом дезацетилирования хитина, который содержится в экзоскелетах ракообразных и насекомых, гладиусах кальмара, клеточных стенках грибов и некоторых водорослей. Хитозан является единственным положительно заряженным полимером (поликатионом) естественного происхождения, который получают в больших количествах с высокой степенью химической чистоты, и, что немаловажно, обладающего умеренной стоимостью [1]. Мировое количество хитина оценивается на уровне 10¹⁰ тонн, что, учитывая постоянный биосинтез, делает его неистощимым источником для получения хитозана.

В последние два десятилетия значительно возрос интерес к биоцидным свойствам хитозана, которые наряду с нетоксичностью, биосовместимостью, гипоаллергенностью и биодеградируемостью, позволяют использовать его в биомедицинских целях в качестве альтернативы и/или вспомогательного вещества в антимикробной терапии, особенно по отношению к ряду бактериальных штаммов, резистентных к классическим антибиотикам [2].

Однако антибактериальные свойства хитозана сильно зависят от его молекулярно-массовых параметров [3]. Дело в том, что хитозан, являющийся сополимером глюкозамина и ацетилглюкозамина, представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени деацетилирования, расположению остаточных ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению средней величины рК_а [4]. В связи с широкой вариацией молекулярно-массовых параметров образцов полимера, для хитозана характерны значительные вариации в проявлении антибактериальных свойств.

Антибактериальные свойства хитозана зависят:

- во-первых, от его степени дезацетилирования, то есть от доли аминосахаридных остатков со свободной аминогруппой. Увеличение степени дезацетилирования хитозана ведет к усилению антибактериальных свойств полиаминосахарида [5].

- во-вторых, от степени протонирования свободных аминогрупп полимера, поскольку именно положительно заряженные аминогруппы во многом определяют сродство хитозана к клеткам микроорганизмов. С увеличением степени протонирования аминогрупп хитозана усиливаются антибактериальные свойства полимера. Степень протонирования полимера зависит от кислотности среды - чем более кислая среда, тем более заряжен положительно хитозановый полимер, поэтому при увеличении кислотности среды антибактериальные свойства хитозана усиливаются, а при защелачивании - уменьшаются [5].

- в-третьих, от молекулярной массы (степени полимеризации) хитозана. Обычно с увеличением молекулярной массы хитозана его антибактериальные свойства усиливаются [5, 6]. Это объясняется его возрастающей способностью взаимодействовать с клетками микроорганизмов при увеличении молекулярной массы. Обычно такая зависимость прослеживается при оценке антибактериальных свойств хитозанов в кислых условиях - при низких значениях pH среды (менее 6,5). Однако, имеются сведения, которые свидетельствуют об усилении антибактериальных свойств хитозана при уменьшении его молекулярной массы, что связывают с лучшей растворимостью более низкомолекулярных форм полимера [7, 8]. Обычно такие данные получают при оценке антибактериальных свойств хитозанов в нейтральных или слабощелочных условиях - при средних значениях pH среды (от 6,5 до 8,0). Такое противоречие в зависимости антибактериальных свойств хитозана от его молекулярной массы (степени полимеризации) обуславливает актуальность поиска оптимальных по молекулярно-массовым параметрам образцов хитозана, которые бы обладали достаточно высокой антибактериальной активностью в широком диапазоне кислотности среды - как в кислых, так и в слабощелочных условиях, для последующего его включения в антибактериальную композицию.

Известен способ стабилизации косметических препаратов путем введения в них хитозана с молекулярной массой от 3 до 700 кДа. В данном случае хитозан используют в качестве консерванта, добавляя его в состав препарата в количестве от 0,005 до 0,5 мол. [9].

Известна композиция, содержащая хитозан (0,19%), аскорбиновую кислоту (0,165%) и аскорбинат натрия, применяемая в хирургической стоматологии для заживления дефектов пародонтальной ткани [10].

Известна композиция, содержащая хитозан (1-4 мас.%), глицерол (10-90 мас.%) и уксусную кислоту (1 мас.%), используемая как носитель для медикаментов анальгетиков и антибактериальных агентов [11].

Близким аналогом к нашему изобретению можно считать патент на изобретение «Гель для ухода за кожей и лечения ее заболеваний и композиция для его получения» [12]. Главным недостатком данного примера является то, что в нем используется хитозан с молекулярной массой от 10 до 500 кДа, который не обладает достаточной растворимостью в нейтральных и щелочных условиях.

Таким образом, все приведенные выше примеры подразумевают использование либо хитозана с достаточно высокой молекулярной массой, либо с молекулярными массами в широком диапазоне этого параметра не учитывающие сильные различия в проявлении антибактериального действия у образцов с различными молекулярно-массовыми характеристиками, что может привести к недостаточному использованию антимикробного потенциала этого полимера. Как указывалось выше, образцы хитозанов с более высокой молекулярной массой могут терять свою активность в нейтральных и щелочных условиях. Полидисперсные образцы, которые содержат молекулы хитозанового полимера с сильно различающейся молекулярной массой также могут обладать недостаточной эффективностью в подобных условиях ввиду потери активности входящих в их состав фракций молекул полимера с достаточно высокой степенью полимеризации (молекулярной массой).

В связи с этим целью заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающая в свой состав водорастворимый низкомолекулярный хитозан, обладающий повышенной антибактериальной активностью в широком диапазоне уровней кислотности среды (pH от 5,50 до 8,00) и придающий это свойство композиции.

Поставленная задача достигается путем включения в состав композиции хитозана с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа (степенью полимеризации от 20 до 29), который обладает более высоким уровнем значения рК_а (значение рК_а соответствует значению pH среды при котором ровно половина свободных аминогрупп конкретного образца хитозана заряжена положительно), по сравнению с более высокомолекулярными образцами (табл.1). Эти образцы (с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа, и степенью полимеризации от 20 до 29, соответственно) также обладают лучшей расторимостью в нейтральных и слабощелочных условиях по сравнению с более высокомолекулярными образцами, о чем можно судить по незначительному выпадению их в осадок при повышении pH среды (рис.1) В ходе оценки антибактериальных свойств этих образцов хитоазана (с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа, и степенью полимеризации от 20 до 29, соответственно) было установлено, что они обладают антибактериальной активностью в отношении стафилококков в широком диапазоне pH среды (от 5,50 до 8,00), в отличие от более высокомолекулярных образцов, котрые были малоактивны при нейтральных и в слабощелочных условиях (рис.2 и 3). Использование олигомеров менее 3,5 кДа является нецелесообразным ввиду их слабых антибактериальных свойств (рис.2 и 3). В качестве загустителя возможно использование поливинилового спирта, глицерин, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающая в свой состав водорастворимый низкомолекулярный хитозан, характеризующийся повышенным уровнем рК_а, а также высокой растворимостью и антибактериальной активностью в широком диапазоне уровней кислотности среды (pH от 5,50 до 8,00).

Пример 1. Антибактериальная композиция, включающая в свой состав: хитозан водорастворимый низкомолекулярный с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа (степенью полимеризации от 20 до 29) от 0,01 до 10 мас.%, поливиниловый спирт от 2 до 15 мас.%, остальное - вода.

Композиция в виде геля обладает антибактериальной активностью в отношении различных видов бактерий в широком диапазоне pH. Полученные результаты антибактериального теста заявляемой композиции представлены в таблицах 2-4.

Пример 2. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя глицерин от 10 до 90 мас.%.

Пример 3. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас.%.

Пример 4. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя поливинилпироролидон от 10 до 50 мас.%.

Пример 5. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но кроме поливинилового спирта от 2 до 15 мас.%., включающая и глицерин от 10 до 90 мас.%, и полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас.%, и поливинилпироролидон от 10 до 50 мас.%.

Таблица 1
Характеристика образцов хитозана
№ образца	Молекулярная масса, кДа	СП	ИП	СД, моль.%	рКа
1	0,7	4	1,41	95	7,1
2	1,5	8	1,39	93	6,7
3	2,2	13	1,34	97	6,6
4	3,5	20	1,71	95	6,5
5	4,2	24	1,38	97	6,5
6	4,9	29	2,28	78	6,5
7	8,3	49	1,44	97	6,4
8	15,0	87	1,61	94	6,4
9	19,9	116	1,66	98	6,4

СП - средняя степень полимеризации

ИП - индекс полидисперсности

СД - степень деацетилирования

Рис.1. Значения рК_а хитозанов определенные с помощью кондуктометрического титрования

Таблица 2
Антибактериальная активность в отношении S. aureus заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 1 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода
pH	Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
	Хитозан от 3,5 до 5,5 кДа	Хитозан 2 кДа	Хитозан 20 кДа
5,50	10	3	12
5,75	11	3	10
6,00	11	3	11
6,25	10	3	11
6,50	10	3	10
6,75	10	3	9
7,00	8	3	5
7,25	8	3	3
7,50	8	2	0
7,75	7	0	0
8,00	5	0	0

Таблица 3
Антибактериальная активность в отношении Е. coli заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 1 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода.
pH	Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
	Хитозан от 3,5 до 4,9 кДа	Хитозан 2 кДа	Хитозан 20 кДа
5,50	14	5	15
5,75	13	5	15
6,00	14	5	14
6,25	13	4	13
6,50	12	4	12
6,75	12	4	10
7,00	12	4	3
7,25	11	2	0
7,50	11	1	0
7,75	8	0	0
8,00	4	0	0

Таблица 4
Антибактериальная активность в отношении S. epidermidis заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 0,01 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода.
pH	Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
	Хитозан от 3,5 до 4,9 кДа	Хитозан 2 кДа	Хитозан 20 кДа
5,50	15	12	17
5,75	15	10	17
6,00	15	11	16
6,25	15	11	15
6,50	15	10	15
6,75	15	10	15
7,00	15	3	14
7,25	15	1	6
7,50	11	1	1
7,75	10	0	0
8,00	7	0	0

ЛИТЕРАТУРА

1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Изд-во Наука, 2002. - 368 с.

2. Tin S., Sakharkar K.R., Lim C.S., Sakharkar M.K.. // Int. J. Biol. Sci. 2009. V. 5. N2. P.53-60.

3. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Варламов В.П. / Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2009, № 5, с.91-98.

4. Tharanathan R.N., Kittur F.S. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential. Crit. Rev. Nutr. 2003. V.43. P.61-87.

5. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan. J. Appl. Polym. Sci. 2001. V.79. P.1324-1335.

6. Eaton P., Femandes J.C., Pereira E. et al. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy. 2008, 108 (10): 1128 - 1134.

7. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е. и др. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол.2004,40 (З): 301 - 306.

8. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosan - preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity. Biochim. Biophys. Acta. 2004, 1670 (2): 137 - 146.

9. Патент RU № 2028138, 1995. Способ стабилизации косметических препаратов

10. Muzzarelli R, Biagini G, Pugnaloni A, Filippini 0, Baldassarre V, Castaldini C, Rizzoli С./ Reconstruction of parodontal tissue with chitosan. // Biomaterials, 1989, v.10, N 9, p.598 603

11. Пат. США 4659700, AG1K 31/725, 1987.

12. Патент RU № 2085187, 1997. Гель для ухода за кожей и лечения ее заболеваний и композиция для его получения.