способ лечения фиброза легких
Классы МПК: | G09B23/28 в медицине A61K38/43 энзимы; проэнзимы; их производные A61K47/48 неактивный ингредиент, химически связанный с активным ингредиентом, например полимер, связанный с лекарственным средством A61P11/00 Лекарственные средства для лечения дыхательной системы |
Автор(ы): | Артамонов Андрей Владимирович (RU), Бекарев Андрей Александрович (RU), Дыгай Александр Михайлович (RU), Киншт Дмитрий Николаевич (RU), Мадонов Павел Геннадьевич (RU), Скурихин Евгений Германович (RU), Першина Ольга Викторовна (RU), Ермакова Наталия Николаевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент") (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-04-04 публикация патента:
27.09.2013 |
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к разработкам способа лечения фиброза легких. Для этого лабораторным животным интраназальным путем вводят иммобилизированную на полиэтиленгликоле гиалуронидазу в дозе 16 ЕД. Введение осуществляют 1 раз в сутки на 1, 3, 7, 10-е сутки после введения блеомицина - фактора моделирования фиброза легких. Способ обеспечивает повышение устойчивости легочной ткани к отложению фибротических масс, в том числе предупреждает обратный процесс формирования фиброза, за счет свойств пегилированной гиалуронидазы и разработанного режима ее введения, что приводит к длительному антифибротическому эффекту при низкой токсичности и иммуногенности воздействия на организм. 1 пр., 1 табл., 1 ил.
Формула изобретения
Способ лечения фиброза легких, заключающийся в интраназальном введении лабораторным животным (мыши) препарата гиалуронидазы в дозе 16 ЕД, отличающийся тем, что вводят иммобилизированную на полиэтиленгликоле гиалуронидазу 1 раз в сутки на 1, 3, 7, 10-е сутки после введения блеомицина.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии и пульмонологии, и касается лечения фиброза легких.
Идиопатический фиброз легких, достаточно распространенное тяжелое интерстициальное легочное заболевание, являющееся серьезной проблемой для клиницистов, так как обладает неблагоприятным прогнозом [1]. До настоящего времени не ясны механизмы возникновения заболевания, и как следствие этого нет лекарственных препаратов, препятствующих развитию фиброза легких. Терапия фиброза легких направлена главным образом на профилактику быстрого прогрессирования заболевания, а не на его предупреждение. Для этого в настоящее время используют глюкокортикостероиды, часто в комбинации с цитостатическими агентами, антиоксиданты (N-ацетилцистеин), антифиброзные средства (D-пеницилламин, колхицин) [2]. Как правило, изучение патогенеза фиброгенных изменений в легких и выявление средств, препятствующих интерстициальному отложению коллагена, проводят на блеомициновой модели пневофиброза [3, 4].
Известен способ коррекции блеомицин-индуцированного фиброза легких под влиянием единичной интраназальной инокуляции препарата гиалуронидазы [5].
Данный способ является близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатками способа являются кратковременность действия фермента, высокая вероятность аллергических реакций, которые в сочетании с плохим периодом полувыведения препарата могут ограничивать клиническую эффективность гиалуронидазы [3, 6].
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа лечения фиброза легких и уменьшение побочного действия препарата гиалуронидазы.
Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ лечения фиброза легких, заключающийся в интраназальном введении лабораторным животным иммобилизированной на полиэтиленгликоле гиалуронидазы в дозе 16 ЕД 1 раз в сут на 1, 3, 7, 10-е сут после введения блеомицина.
Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата иммобилизированной на полиэтиленгликоле гиалуронидазы 1 раз в сут на 1, 3, 7, 10-е сут после введения блеомицина.
Регулирование восстановления тканей при их повреждении - это тщательно скоординированный ответ организма, направленный на ликвидацию повреждения и восстановление целостности тканей [7]. Механизмы, которые участвуют в регуляции ответа организма на повреждение ткани, не полностью понятны. Известно, что различные легочные заболевания характеризуются избыточным отложением отдельных компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в результате чего может развиться органный фиброз. При бронхиальной астме, эмфиземе легких, легочном фиброзе и других хронических заболеваниях легких обнаруживается дисбаланс между синтезом и деградацией гиалуроновой кислоты [7, 8].
Гиалуроновая кислота основной компонент экстрацеллюлярного матрикса, который динамически изменяется во время повреждения тканей и воспалений. Взаимодействуя с протеогликанами (аггрекан, версикан) гиалуроновая кислота участвует в организации фибрина, фибронектина и коллагена [8]. В эксперименте показано, что продукция гиалуроновой кислоты возрастает в несколько раз после интратрахеальной инсталляции блеомицина, что связывают с повреждением паренхемы легких и воспалением [7].
Основным ферментом, регулирующим метаболизм гиалуроновой кислоты, является гиалуронидаза. Расщепляя гиалуроновую кислоту на фрагменты (глюкозамины и глюкуроновая кислота), фермент тем самым ремодулирует экстрацеллюлярный матрикс [3, 7, 8, 9]. Основным показанием для применения гиалуронидазы являются контрактуры суставов, рубцы после ожогов и операций, анкилозирующий спондилоартрит, склеродермия, травматические поражения сплетений и периферических нервов (плексит, неврит), гематомы, тяжелые заболевания поясничных дисков и другие [3]. В эксперименте показано, что на фоне введения блеомицина в легких гиалуронидаза препятствует развитию фиброза. Это связывают со снижением концентрации глюкуроновой кислоты в паренхиме [5]. Однако, несмотря на выявленную эффективность действия препарата, использование нативной гиалуронидазы во многом ограничено, благодаря высокой способности фермента вызывать аллергические реакции и короткому периоду полувыведения из плазмы при системном введении [3, 6].
На сегодняшний день модификация пептидных препаратов пегилированием активно развивающееся направление фармакологии. Пегилированные лекарственные препараты пептидной структуры имеют ряд весомых и несомненных преимуществ, которые ранее были просто невозможны при использовании нативных аналогов: усиление биологической активности, удлинение периода полураспада, замедление выведения, отсутствие пиков плазменной/тканевой концентрации, понижение токсичности и иммуногенности [10]. Результаты экспериментальных исследований последних лет дают основание говорить о перспективах лечения пегилированной гиалуронидазой миелосупрессии, вызванной цитостатиком [11].
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.
Изобретение может быть использовано для повышения устойчивости легочной ткани к отложению фибротических масс при фибротических заболеваниях в легких.
Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на 7-8 недельных мышах линии C57BL/6J в количестве 100 штук. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.
Способ будет понятен из следующего описания и приложенного к нему рисунка 1.
На рис.1 изображено легкое мыши, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а - интактной, б - получавшей блеомицин, в - получавшей нативную гиалуронидазу на фоне моделирования фиброза; г - получавшей иммобилизированную гиалуронидазу на фоне моделирования фиброза; легкое мыши, при окрашивании ткани легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань: д - интактной; е - получавшей блеомицин; ж - получавшей нативную гиалуронидазу на фоне моделирования фиброза; з - получавшей иммобилизированную гиалуронидазу на фоне моделирования фиброза.
Способ осуществляют следующим образом:
Фиброз легкого моделировали однократным интратрахеальным введением 80 мкг блеомицина («Блеомицетин», ОАО «Лэнсфарм», Россия) в 30 мкл физиологического раствора. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора (контроль). Блеомицин относится к группе противоопухолевых антибиотиков. Его механизм действия до конца не выяснен, хотя известно, что он способен подавлять синтез нуклеиновых кислот (преимущественно ДНК) и белка. Препарат активен в отношении клеток, находящихся как в митотическом цикле, так и вне его, но проявляет большую активность в фазе G2. Основное токсическое действие цитостатик оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в паренхиме легких [3].
Иммобилизированную гиалуронидазу (ООО «Scientific Future Management», г.Новосибирск), модифицированную активированным полиэтиленоксидом молекулярной массой 1500 Да с помощью электроннолучевого синтеза вводили интраназально в дозе 16 ЕД/18 мкл/20 г на 1, 3, 7, 10-е сутки после интратрахеального введения блеомицина.
Нативную гиалуронидазу (ООО «Scientific Future Management», г.Новосибирск) вводили интраназально в дозе 16 ЕД/18 мкл/20 г на 1, 3, 7, 10-е сутки после интратрахеального введения блеомицина.
Заявляемая доза и режим введения нативной и иммобилизированной гиалуронидазы подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения отменяют получение заявленного технического результата. Снижение дозы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа.
В качестве фона использовали интактных животных (интактный контроль).
На 3, 7, 14 и 21-е сутки после введения блеомицина проводили эвтаназию мышей передозировкой CO2 и изучали морфологическую картину легких. Для гистологического исследования из средней части правого легкого по стандартной методике готовили парафиновые блоки. С каждого блока получали срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином для изучения содержания лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и плазматических клеток и по Ван-Гизону на соединительную ткань [12].
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна-Уитни.
Пример.
При интратрахеальном введении блеомицина в легких мышей отмечаются изменения, характерные для токсического фиброзирующего альвеолита. В ранние сроки после инсталляции блеомицина (3 сут) наблюдается выраженная сосудистая реакция, характеризующаяся венозным полнокровием в стенках альвеол и отеком эпителия межальвеолярных перегородок (рисунок). Вокруг крупных сосудов и перибронхиально обнаруживаются воспалительные инфильтраты, содержащие лимфоциты, гистиоциты, альвеолярные макрофаги, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты (рис.1). На 7 сут происходит усиление гиперемии и отечных явлений, в просветах альвеол появляются спущенные альвеоциты. Одновременно увеличивается интенсивность интерстициального воспаления, отмечается утолщение стенок альвеол за счет инфильтрации их воспалительными клетками. 14 сут опыта характеризуются значительным усилением процессов воспаления и отека по сравнению с 7 сут опыта. В альвеолах появляется серозно-фибринозный экссудат, повышается количество слущенных альвеоцитов и клеток инфильтрата. При изучении лейкоцитарной формулы выявляется, что число нейтрофильных лейкоцитов превышает количество макрофагов и лимфоцитов. У корня легкого встречаются участки, где легочный рисунок отсутствует за счет массивной воспалительной инфильтрации. В этот период наблюдения в патологический процесс вовлекаются бронхиолы с образованием мелких кист и разрушением структуры альвеол, что является начальным этапом формирования так называемого «сотового легкого». На 21 сут воспалительный процесс в легких достигает максимальной выраженности. С помощью гистохимической окраски выявляется повышение интенсивности отложения коллагеновых волокон в легочной ткани фиброзных животных на протяжении всего периода наблюдения. На ранних сроках эксперимента отмечается преимущественно перибронхиальный и околососудистый фиброз (7 сут), который в дальнейшем распространяется на альвеолярные перегородки и превращается в интерстициальный (14 сут) (рис.1, табл.1). На 21-е сут опыта наблюдается картина обширного распространенного пневмофиброза.
Нативная гиалуронидаза и иммобилизированная гиалуронидаза замедляют прогрессирование фиброза в блеомициновых легких на протяжении всего периода наблюдения (табл.1). Пегилированная форма гиалуронидазы более эффективно замедляет отложение фиброзных масс в легких мышей, по сравнению с животными, получавшими нативную гиалуронидазу на 7, 14-е сут опыта (рис.1).
Таблица 1 | |||
Содержание соединительной ткани (% от площади ткани) в легких мышей линии C57BL/6J в условиях интратрахеального введения блеомицина и курсового назначения препаратов гиалуронидазы на фоне моделирования фиброза легких (M±m) | |||
Блеомицин + иммобилизированная гиалуронидаза | |||
Сроки исследования, сутки | Блеомицин | Блеомицин + гиалуронидаза | |
Интактный контроль | 1,12±0,03 | ||
7 | 3,07±0,07* | 3,05±0,17* | 2,35±0,16*& |
14 | 3,91±0,07* | 2,60±0,21*& | 2,33±0,15*& |
21 | 4,26±0,14* | 3,24±0,07*& | 2,90±0,11*& |
Примечание: отмечена достоверность (P<0,05) различия показателя: * - от интактного контроля; & - от блеомицинового контроля |
У животных, леченных нативной гиалуронидазой или иммобилизированной гиалуронидазой, имеет место диффузная инфильтрация воспалительными клетками, в отличие от мышей, получавших только блеомицин, у которых инфильтрат локализуется преимущественно у корня легкого (рис.1). При изучении лейкоцитарной формулы у мышей, получавших препараты гиалуронидазы, отмечается незначительное увеличение количества альвеолярных макрофагов и снижение количества нейтрофилов в инфильтрате по сравнению с группой блеомицинового контроля.
Таким образом, интраназальное введение иммобилизированной гиалуронидазы препятствует отложению фибротических масс в паренхиме легких у мышей в условиях интратрахеального введения блеомицина, при этом антифибротический эффект пегилированного фермента более выражен, чем у нативной гиалуронидазы.
Предлагаемый способ позволяет рассматривать иммобилизированную гиалуронидазу в качестве средства антифиброзной терапии легких.
Литература
1. Илькович М.М., Новикова Л.Н., Сперанская А.А. Идиопатический фиброзирующий альвеолит // Участковый терапевт - 2009. - № 6. - С.1-3.
2. Андреева И.И. Фиброзирующие альвеолиты. В кн.: Саперов В.Н., Андреева И.И., Мусалимова Г.Г. (ред.) Практическая пульмонология. Чебоксары: Изд-во Чуваш, гос. ун-та; 2007. С.511-514.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: «Новая волна», Издатель Умеренков, 2008. - С.660-661, 1003-1004.
4. Moeller A., Ask K., Warburton D. et al. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2008. - Vol.40, № 3. - P.362-382.
5. Bitencourt C.S., Pereira P.А.Т., Ramos S.G. et al. Hyaluronidase recruits mesenchymal-like cells to the lung and ameliorates fibrosis // Fibrogenesis & Tissue Repair. - 2011. - Vol.4, № 3. - P.1-14.
6. Thompson С.В., Shepard M.H., O'Connor P.M., et al. Enzymatic Depletion of Tumor Hyaluronan Induces Antitumor Responses in Preclinical Animal Models // Mol Cancer Ther. - 2010. - Vol.9. - P.3052-3064.
7. Noble P.W., Jiang D. Matrix Regulation of Lung Injury, Inflammation, and Repair. The Role of Innate Immunity // Proc Am Thorac Soc. - 2006. - Vol.3. - P.401-404.
8. Delpech В., Girard N., Bertrand P. et al. Hyaluronan: fundamental principles and applications in cancer // J. Intern. Med. - 1997. - № 242. - P.41-48.
9. Kemparaju K., Girish K.S. Snake venom hyaluronidase: a therapeutic target // Cell Biochem. Funct. - 2006. - Vol.24. - P.7-12.
10. Piedmonte D.M., Treuheit M.J. Formulation of Neulasta (pegfilgrastim) // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2008. - Vol.60. - P.50-58.
11. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Першина О.В. и др. Гемопоэзстимулирующая активность препаратов иммобилизированных олигонуклеотидов и гиалуронидазы в условиях цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - Т.150, № 11. - С.545-549.
12. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - СПб: Медицина, 1969. - С.14, 36-38, 58, 98-100, 163, 170.
Класс A61K38/43 энзимы; проэнзимы; их производные
Класс A61K47/48 неактивный ингредиент, химически связанный с активным ингредиентом, например полимер, связанный с лекарственным средством
Класс A61P11/00 Лекарственные средства для лечения дыхательной системы