способ контроля полноты инактивации антирабической инактивированной вакцины

Формула изобретения

Способ определения полноты инактивации антирабической инактивированной вакцины, включающий внесение вакцины в культуру клеток почки сайги, инкубирование в течение 1 часа при t=37±0,5°С, омывание монослоя клеток средой Игла МЕМ без сыворотки, внесение поддерживающей среды Игла с 2% сыворотки КРС, инкубирование культуры при 37±0,5°С 3-4 суток, замораживание культуры при -40°С, размораживание, проведение 2-го пассажа указанным выше образом, раститровывание полученного материала и проведение оценки методом прямой иммунофлуоресценции на 9-11 сутки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу контроля полноты инактивации антирабической инактивированной вакцины, основанному на инокуляции инактивированной вакцины в культуру клеток ПС с последующей оценкой методом прямой иммунофлуоресценции, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и биофабриках, для контроля инактивированной антирабической вакцины, а именно оценки полноты инактивации вакцины.

Комитет экспертов ВОЗ по бешенству для специфической профилактики этой болезни рекомендовал использовать инактивированные культуральные вакцины [4, 5].

В ветеринарной практике РФ применяют инактивированные вакцины из штаммов Щелково-51, РВ-97, ТС-80 [1, 2, 6].

К качеству инактивированных антирабических вакцин комитет экспертов ВОЗ предъявляет довольно жесткие требования. Основные требования направлены к таким показателям качества вакцины, как иммуногенная активность и полнота инактивации вируса бешенства. Инактивированная антирабическая вакцина должна быть с иммуногенной активностью не менее 1 ME в дозе и быть авирулентной [8].

Существуют методы определения остаточной вирулентности инактивированного антирабического материала. В основе этих методик заложена оценка полноты инактивации вируса бешенства в вакцине или в инактивированном материале с использованием лабораторных животных - мышей. В одной из методик мышам вакцину или инактивированный антирабический материал вводят интрацеребрально, а через 10 дней проводят слепой пассаж также через головной мозг мышей. За животными наблюдают еще 7 дней. Общая длительность проведения исследования составляет 17 дней [3, 7].

Наиболее близким аналогом является способ определения полноты инактивации вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21 или Vero. Инактивированную вакцину или инактивированный антирабический материал инокулируют в одну из выбранных выше клеток, а затем инкубируют в течение 21 суток. На протяжении периода наблюдения проводят отбор аликвот на 14 и 21 сутки для последующего введения их интрацеребрально мышам. За животными наблюдают в течение 14 дней и при любых сомнительных признаках у животных проводят иммунофлуоресценцию мазков-отпечатков. Инокулированную культуру на 21 сутки оценивают методом иммунофлуоресценции. Данный способ технологически объемный и довольно продолжительный. Время получения как окончательного результата контроля полноты инактивации вируса, так и антирабической вакцины составляет не менее 35 дней, а это удлиняет весь технологический цикл контроля, как самого инактивированного антирабического материала, так и конечного продукта - вакцины. Использование метода интрацеребрального заражения мышей требует определенных навыков у исследователя. Возможность не специфической гибели животных приводит к проведению дополнительных исследований, а именно приготовлению мазков-отпечатков из головного мозга мышей и проведению иммунофлуоресценции [9].

Однако, в соответствии с рекомендациями World Organisation for animal health везде, где возможно, необходимо заменять тест инокуляции мышам на тест с использованием клеточной культуры [8].

Целью изобретения является разработать способ контроля полноты инактивации вируса бешенства в перевиваемой культуре клеток почки сайги, позволяющий проводить визуальную оценку потери инфекционной активности и сокращающий период контроля вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве модели для исследования используют перевиваемую линию клеток почки сайги (ПС).

Культивирование инокулированной культуры проводят при 37±0,5 С в течение 3-4 дней как первого, так и второго пассажей.

Окончательная оценка результатов производится с помощью метода прямой иммунофлуоресценции.

Пример конкретного выполнения

Лиофилизированную антирабическую вакцину восстанавливали физиологическим раствором (рН 7,2) до исходного объема. Содержимое 3 флаконов (ампул) с вакциной (как жидкой, так и восстановленной сухой) объединяли в одну емкость и вносили в 1-суточную культуру клеток ПС, выращенную в культуральном флаконе объемом 25 см³, в объеме 10 см³ и инкубировали в течение 1 часа при 37±0,5°С. Затем монослой клеток омывали средой Игла MEM без сыворотки 5-7 раз и вносили поддерживающую среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Данную культуру инкубировали при 37±0,5°С 3-4 суток. По истечении времени инкубирования культуру замораживали при -40°С, а после размораживания проводили 2-й пассаж таким же образом. После проведения 2-го пассажа и замораживания материал титровали микрометодом на плашках.

Для этого клетки ПС выращивали в 96-луночных культуральных планшетах, при этом посевная концентрация клеток составляла 200-300 тыс кл/см³. В лунки вносили по 0,1 см³ культуральной суспензии и инкубировали в СO²-инкубаторе (концентрация СО₂ - 4,0-5,0%, температура (37±0,5)°С, влажность - 95%) в течение 1 сут (до образования полного монослоя). Во флаконах готовили из общей пробы 2-го пассажа десятикратные разведения (0,9 см³ Игла MEM и 0,1 см³ исследуемой суспензии) материала от 10^-0 до 10 ^-3 на среде Игла MEM с содержанием 2,0% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота. Каждое разведение исследуемой суспензии вносили в объеме 0,1 см³ в лунки планшета с культурой клеток, предварительно удалив ростовую среду. На каждое разведение использовали по 4 лунки вертикального ряда. Планшеты с инфицированной культурой инкубировали в течение 72 ч при концентрация СО ₂ - 5,0%, температуре (37±0,5)°С и влажности - 95,0%. По истечению времени планшеты исследовали методом прямой иммунофлуоресценции. Для этого удалив надосадочную жидкость из планшетов с инфицированной культурой, их высушивали, после чего в каждую лунку вносили по 0,05 см³ охлажденного до минус 20-40°С 80%-ного раствора ацетона. Фиксацию проводили в течение 2 мин, ацетон сливали и планшеты высушивали на воздухе в течение 10-20 мин. После этого флуоресцирующий антирабический глобулин в рабочем разведении вносили по 0,05 см³ в лунку и инкубировали при (37±0,5)°С в течение 30 мин. Затем лунки планшета трехкратно отмывали физраствором (рН 7,2), в заключение промывали дистиллированной водой и проводили люминесцентную микроскопию с использованием инвертированного микроскопа.

В исследуемой культуре клеток не обнаруживали изумрудное или ярко-зеленое диффузное свечение цитоплазмы и гранул-включений.

Сравнительная оценка метода полноты инактивации антирабической вакцины

Этапы работы	Предлагаемый способ	Прототип
Инокуляция вакцины или инактивированного антира-бического материала	Внесение в перевиваемую линию клеток ПС	Внесение в культуры клеток BHK-21/13,Vero
Период наблюдения за первым пассажем	3-4 суток	21 сутки
Длительность наблюдения за вторым пассажем	3-4	-
Отбор проб аликвоты в процессе культивирования	не требуется	на 14 и 21 сутки
Инокуляция мышам	не требуется	по 20 голов мышей для и/ц заражения материалом взятого на 14 и 21 сутки
Проведение МФА	после раститровывания материала 2-го пассажа на 3 сутки	для подтверждения специфичности гибели животных
Получение результата	через 9-11 суток	не менее 35 суток

Использование предлагаемого способа определения полноты инактивации инактивированной антирабической вакцины по сравнению с существующим способом:

1. Сокращает время контроля вакцины по данному этапу (определение полноты инактивации) в 3 раза, за счет проведения исследования в культуре клеток ПС, путем проведения подращивания и оценки результатов методом прямой иммунофлуоресценции.

2. Исключается этап проведения исследования на мышах, что дает возможность получения более точных результатов, исключая не специфические реакции животных на введение материала.

3. Исключает использование лабораторных животных - мышей.

4. Не требует специального обучения (интрацеребральное заражение животных) младшего персонала работать с животными.

Список литературы

1. Вишняков И.О., Никишин И.В., Недосеков В.В. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства. Ветеринария. - 1998. - № 1. - С.22-24.

2. Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной культуральной вакцины против бешенства животных. Владимир, 1999. - 25 с.

3. K.Habel. Общие соображения относительно определения безвредности и иммуногенности. Методы лабораторных исследований по бешенству. - Женева: ВОЗ, 1975. - С.267-271.

4. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству: 8-й доклад. - Женева: ВОЗ, 1994. - 117 с.

5. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов: 31-й доклад. - Женева: ВОЗ, 1983. - 327 с.

6. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Кузнецова С.В. Антирабическая вакцина из фиксированного штамма вируса бешенства, адаптированного к перевиваемой линии клеток ВНК-21/13 // XXI Всемирный ветеринарный конгресс. - М., 1979. - С.20.

7. General consideration in testing the safety and potency of rabies vaccines. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, Geneva 1996. P.355-358.

8. Rabies //Manual of standards for diagnostic tests and vaceines:List A and В diseases of mammals, birds and bees/ Office International des Epizooties. World Organisation for animal health.-2000. P.276-289.

9. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов 24-28 октября 2005, Приложение 2, с.1-62.