способ получения белково-минеральной композиции, содержащей рекомбинантный белок collbd-bmp-2

Формула изобретения

Способ получения композиции на основе белково-минеральных компонентов, включающий получение плазмиды pCollbd-BMP-2, встраивание указанной плазмиды в штамм Escherichia coli M15/pREP4, получение рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 путем выращивания клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], индукции синтеза белка Collbd-BMP-2, разрушения клеток, получения супернатанта, содержащего белок, иммобилизации белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирования, отмывания сорбента со связавшимся белком, последующей элюции белка с сорбента и диализа, приготовление в ламинарном шкафу двух стерильных полипропиленовых пробирок и внесение в них суспензии гидроксиапатита, добавление раствора соединительнотканного коллагена или ксеногенного костного коллагена в виде крошки, перемешивание на встряхивателе до получения однородной суспензии, внесение 10% (по массе) желатиновых микросфер, содержащих рекомбинантный фактор роста костной ткани Collbd-BMP-2, перемешивание на встряхивателе, при этом полученная композиция (ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ) используется для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы, представляет собой стерильную пасту белого, бежевого, сероватого или желтоватого цвета равномерной консистенции, обладает остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, содержит 5-20% синтетического наноструктурного гидроксиапатита, 0,1-15% коллагена I типа и 5-10% пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии, биотехнологии, генной инженерии, нанотехнологиям и касается способа получения белково-минеральной композиции, содержащей рекомбинантный белок Collbd-BMP-2.

Белок Collbd-BMP-2 является рекомбинантным и помимо функционального домена костного морфогенетического белка содержит также коллагенсвязывающий домен, упрощающий очистку и иммобилизацию фактора роста в композиционном материале. Белок состоит из коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)) из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека и спейсерной последовательности GGS. Белок получают путем бактериального синтеза в клетках штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2]. Рекомбинантную плазмиду pCollbd-BMP-2 размером 3447 п.н., обеспечивающую экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd, из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-2, и содержащую:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (коллагенсвязывающий домен Collbd - спейсер - костный морфогенетический белок BMP-2) (117-545 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (585-679 п.н.);

- бактериальный оперон bla (3232-2382 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом контрселекции;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.), встраивают в штамм Escherichia coli M15/pREP4, получая штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2]. Полученный штамм является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-2.

Рекомбинантный белок Collbd-BMP-2, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd, из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-2, обладает биологическими свойствами белка BMP-2 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.

Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-2, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.

На сегодняшний день известно около 20-ти видов костных морфогенетических белков, которые играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки и апоптоза клеток различных типов, включая остеобласты, хондробласты, нервные клетки, эпителиальные клетки и др. [Sakou Т. 1998. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone. 22, 591-603]. Нативные костные морфогенетические белки содержатся в кости в небольших количествах (по разным источникам, от 2 до 180 мкг костных морфогенетических белков на 1 кг кости) [Iwata И, Sakano S, Itoh Т, Bauer TW. Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery. // Clin Orthop Relat Res. 2002 Feb; (395): 99-109]. Они очень консервативны и практически не отличаются по первичной структуре у человека и животных [Alaoui-Ismaili MH, Falb D. Design of second generation therapeutic recombinant bone morphogenetic proteins. // Cytokine Growth Factor Rev. 2009 Oct-Dec; 20(5-6): 501-507].

Следует отметить, что, несмотря на значительное разнообразие остеогенных композитных материалов, представленных на мировом рынке, биомедицинские продукты с применением рекомбинантного морфогенетического белка ВМР-2 производит лишь одна зарубежная компания: коммерческий рекомбинантный человеческий BMP-2 с названием «INFUSE» rhBMP-2/ACS, производимый компанией «Medtronic Biologics» (Мемфис, США), разрешен к применению FDA с 2002 года. На российском рынке препараты, содержащие рекомбинантные костные морфогенетические белки, полностью отсутствуют.

Таким образом, композиция, получаемая способом по изобретению, может применяться в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии для лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы человека в качестве активного биодеградируемого материала, для регенерации костной ткани, остеоиндуктивного биологического покрытия металлических эндопротезов костной ткани.

Современные материалы и покрытия - это биодеградируемые и биосовместимые матриксы или подложки разнообразной формы, несущие биологически активные компоненты (антибиотики, ростовые факторы, витамины и др.). Они обеспечивают благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей и могут иметь самые разнообразные способы применения. Создание нового поколения биосовместимых наполнителей, покрытий, тканевых протезов, подходящих для использования во всех фазах раневого процесса при ожогах, травмах различного размера и глубины, является одной из актуальных задач современной реконструктивной хирургии. Идеальное покрытие должно отвечать следующим требованиям: биосовместимость, биоабсорбция, способность к биодеградации, обеспечение клеточной адгезии, обеспечение васкуляризации и приживления тканей, торможение развития бактерий. В качестве биосовместимых материалов широко применяются препараты на основе коллагена. К ценным свойствам коллагена относятся его способность стимулировать фибриллогенез, рассасываться и замещаться живой тканью. Кроме того, следует отметить его низкую токсичность и антигенность, высокую механическую прочность и устойчивость к тканевым протеазам. В целом, однако, следует подчеркнуть, что как в мире, так и в нашей стране в области разработки биосовместимых костнопластических материалов основное внимание сосредоточено на получении имплантатов и покрытий на основе гидроксиапатита или коллагена типа I, а также их комбинации. Введение в состав белково-минеральных костнопластических материалов биологически активных компонентов является весьма перспективным подходом для развития методов реконструктивной хирургии.

Медицинским сообществом отмечается значительное преимущество имплантируемых композитных материалов, содержащих рекомбинантные белковые факторы, в частности, BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein, костный морфогенетический белок 2), перед другими видами имплантатов, вследствие того, что они существенно ускоряют регенерацию костной ткани и сокращают сроки реабилитации больных, исключая многочисленные проблемы, связанные с применением ауто- и аллотрансплантатов. Костные морфогенетические белки являются одним из ключевых компонентов современных костнопластических материалов, обеспечивающих их высокую остеоиндуктивность.

Известен биокомпозиционный материал для пластики костных дефектов (заявка № 97118288), содержащий в качестве компонентов гидроксиапатит (50-90% по массе), коллаген (2-48%) и антисептик (2-8%). При этом он обладает остеокондуктивными, но не обладает остеоиндуктивными свойствами.

Известно вещество для возмещения дефектов кости (патенты № 2005133592 и № 2303436), содержащее в качестве компонентов гидроксиапатит, трикальцийфосфат и незначительное количество коллагена, а также неколлагеновые белки костной ткани, обладающие остаточной остеоиндуктивностью. Однако она несопоставима с регенеративным потенциалом рекомбинантных факторов роста костной ткани.

За наиболее близкий к белково-минеральной композиции, получаемой способом по изобретению, аналог может быть принят остеоиндуктивный материал «ИНДОСТ» (патент № 2317088), включающий в зависимости от варианта исполнения гидроксиапатит, трикальцийфосфат и/или коллаген, причем во всех случаях материал дополнительно содержит композицию неколлагеновых белков костной ткани, стимулирующую остеогенез, при определенном соотношении компонентов на 100 г материала. Однако следует отметить, что предложенные способы получения неколлагеновых белков из костной ткани приводят к значительному снижению их биологической активности и, соответственно, остеоиндуктивного потенциала всего материала в целом.

Задачей настоящего изобретения является создание композиционного костнопластического материала, обладающего, в зависимости от вида исполнения, повышенным остеокондуктивным, либо остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом и содержащего компоненты костной ткани, свойства которых максимально приближены к природным.

Упомянутая задача решается за счет оптимального соотношения компонентов материала: нанокристаллического гидроксиапатита, коллагена, рекомбинантного фактора роста и регенерации костной ткани. Получаемая способом по изобретению композиция имеет наименование ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ.

Кроме того, упомянутая задача решается за счет введения в материал в качестве одного из компонентов нанокристаллического гидроксиапатита, который является основным минеральным компонентом костной ткани. Кристаллы синтетического гидроксиапатита, входящие в состав ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, постепенно разлагаются путем химических превращений до ионов кальция и фосфора с их последующей интеграцией в структуру новообразованной костной ткани. На их частицах путем эпитаксиального роста прикрепляется собственный нативный гидроксиапатит организма, составляющий минеральную основу новообразованной кости.

Помимо этого, упомянутая задача решается за счет введения в материал в качестве компонента коллагена I - основного белкового компонента костной ткани. Правильная пространственная структура белковых фибрилл коллагена, входящего в состав ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, обеспечивает клеткам организма наиболее благоприятные условия для интеграции внутрь композиционного материала и возможность формирования новых коллагеновых волокон, заполняющих полость в области костного дефекта или имплантации. Тем самым предотвращается формирование фиброзной ткани и значительно ускоряется восстановление костного дефекта.

Упомянутая задача также решается за счет иммобилизации в материале рекомбинатного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2, который помимо функциональных доменов костного морфогенетического белка, содержит также коллагенсвязывающий домен, упрощающий очистку и иммобилизацию фактора роста в композиционном материале.

Кроме того, упомянутая задача также была решена за счет инкапсулирования фактора роста костной ткани в желатиновые микросферы. Такой способ упаковки факторов роста обеспечивает их пролонгированное действие в области введения за счет постепенной деградации желатина эндогенными ферментами и высвобождения молекул факторов, что позволяет предотвратить их быструю диффузию из области введения. Как показали ранее проведенные авторами исследования [М.З Федорова, С.В. Надеждин, А.С. Семихин, М.А. Лазебная, Г.В. Храмов, Ю.Р. Колобов, А.В. Громов, М.С. Бартов, В.Г. Лунин, А.С. Карягина, Д.В. Гундеров «Экспериментальная оценка композиционного материала на основе белково-минеральных компонентов и рекомбинантного костного морфогенетического белка-2 в качестве покрытия титановых имплантатов», ТРАВМАТОЛОГИЯ И ОРТОПЕДИЯ РОССИИ, 2011-2(60)], композиционный материал с добавлением инкапсулированных факторов роста костной ткани обладает высоким остеоиндуктивным потенциалом и эффективно стимулирует образование костной ткани.

Сущность изобретения заключается в том, что получаемая способом по изобретению композиция на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ представляет собой стерильную пасту белого, бежевого, сероватого или желтоватого цвета равномерной консистенции, обладающую, в зависимости от вида исполнения, остеокондуктивными либо остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, состоящую из компонентов костной ткани, свойства которых максимально приближены к природным: синтетического наноструктурного гидроксиапатита (5-20%, в зависимости от вида исполнения), коллагена I типа (в виде раствора, полученного из соединительных тканей животных, либо крошки костной; 0,1-15%, в зависимости от вида исполнения) и отличающуюся содержанием пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2 (5-10%, присутствует в двух видах исполнения), обладающего высоким остеоиндуктивным потенциалом, а также способностью связываться с коллагенсодержащими материалами, благодаря наличию коллаген-связывающего функционального домена Collbd.

Техническим результатом, достигаемым способом по изобретению, является получение композиции на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ, обладающей в зависимости от вида исполнения повышенным остеокондуктивным, либо остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом, а также пролонгированным воздействием содержащегося в ней рекомбинантного фактора роста костной ткани на область костного дефекта.

Указанный технический результат достигается за счет того, что разработан способ получения ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, содержащей компоненты костной ткани, свойства которых максимально приближены к нативным:

1) ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ - содержит синтетический наноструктурный гидроксиапатит, ксеногенный костный коллаген в виде крошки и фактор роста костной ткани, инкапсулированный в желатиновые микросферы.

2) ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К - содержит синтетический наноструктурный гидроксиапатит, коллаген из соединительных тканей животных и фактор роста костной ткани, инкапсулированный в желатиновые микросферы.

Существует и третий вид исполнения - ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ - содержащий синтетический наноструктурный гидроксиапатит и ксеногенный костный коллаген в виде крошки, который обладает только остеокондуктивным потенциалом и применяется в случаях, когда использование ростовых факторов противопоказано. Например, наличие опухолевых заболеваний, детский возраст, беременность.

Однако виды исполнения ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ и ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К, получаемые способом по изобретению, проявляют высокие остеоиндуктивные свойства за счет пролонгированного выделения содержащихся в них рекомбинатного фактора роста костной ткани Collbd-ВМР-2.

Основные преимущества изобретения.

Основным преимуществом изобретения является наличие выраженных остеоиндуктивных свойств, обусловленное наличием в его составе пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2, способного связываться с коллагенсодержащими материалами за счет наличия у него коллагенсвязывающего домена.

Примеры

Пример 1. Получение плазмиды pQE6-BMP-2.

а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПААГ.

б) Получение гена ВМР-2 с последующим его клонированием.

Копию гена BMP-2 получали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК человека из скелетной мышцы человека. кДНК получали путем обработки 100 нг полиаденилированной РНК скелетной мышцы человека с помощью ImProm-II обратной транскриптазы Promega, согласно протоколу производителя.

Для последующей ПЦР были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу гена ВМР-2. В прямой праймер был введен сайт BamHI, а в обратный - сайты BglII, Kpn2I и стоп-кодон.

Dir

5'GGATCCAGATCCCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCT3'

Rev:

5'TCCGGACTAAGATCTACACCCACAACCCTCCACAACCATGTCCTG3'

2 мкл полученной в результате обратной транскрипции смеси вносили в реакционную смесь для ПЦР, которая содержала 10 пкМ каждого праймера (Dir и Rev), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. полимеразы Native Pfu Polymerase (Stratagene). Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл под вазелиновым маслом: 1 цикл 95°C - 3 мин; 35 циклов: 95°C - 15 сек, 72°C - 1 мин.

Продукт амплификации размером 357 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК BMP-2, а также ДНК плазмиды pQE6 («Qiagen», США) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и Kpn21 при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.

Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий гену BMP-2, размером 354 п.н. и фрагмент плазмиды pQE6 размером 3024 п.н., лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Эту конструкцию использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками - ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК рВМР-2 выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и BspEl, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны, плазмидная ДНК которых рВМР-2 размером 3447 п.н. содержит последовательность гена ВМР-2.

Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.

в) Получение фрагмента гена SPARC, содержащего последовательность коллагенсвязывающего домена, с последующим его клонированием в плазмидную конструкцию рВМР-2.

Коллагенсвязывающий домен Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектин) человека был синтезирован с использованием 4 олигонуклеотидов следующего состава:

Dir1:

CATGGGATCCCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCCGCTGCGCATGCGT

Dir2: GACTGGCTGAAAAACCCGGGTGGTTCTA

Rev1: GATCTAGAACCACCCGGGTTTTTCAGCCAGTCACGCATG

Rev2:CGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAGGGATCC.

Олигонуклеотиды были спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двуцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI и BglII. При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5 - концу.

Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов (по 20 пкМ), прогревали при 95°C (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°C. Полученную смесь объединяли с фрагментом плазмиды рВМР-2 (3376 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия в течение 1,5 часов. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pCollbd-ВМР-2 методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, соответствующей коллагенсвязывающему домену Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека.

Пример 2. Получение штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из ВМР-2, спейсера, коллагенсвязывающего домена Collbd.

Для получения штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 - клетки штамма E.coli M15 [pREP4] (Nals, Strs, rifs, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+) трансформировали плазмидой pCollbd-BMP-2. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 часов.

Для контроля продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 клетками штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] применяли метод электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов E.coli M15 [pREP4] и E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 16 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка Collbd-BMP-2. Уровень синтеза белка Collbd-BMP-2 определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Согласно полученным данным клетки штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] синтезируют около 12% Collbd-BMP-2 от общего белка клеток.

Пример 3. Способ получения препарата белка Collbd-BMP-2, иммобилизованного на коллагенсодержащем сорбенте.

Клетки E.coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pCollbd-BMP-2, выращивали в 3,5 мл среды LВ с ампициллином и канамицином при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-Б-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6.0), разрушали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.

К 100 мкл 50% суспензии желатин-сефарозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис, pH 8,0, и 0,15 М хлорида натрия, а также лизат клеток в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при +4°C в течение 2 ч, затем оставляли на 16 ч при той же температуре. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 мин при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис, pH 8,0, и 0,15 М хлорида натрия.

Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 6 М мочевины, 30 мМ Трис, pH 8,0, и 10 мМ ЭДТА. Анализ результатов связывания и элюции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.

По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН концентрация белка Collbd-BMP-2 составляла 10 мг на 1 мл сорбента.

Таким образом, получают штамм E.coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, и одновременно простую и эффективную схему очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.

Пример 4. Получение композиции на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ (вид исполнения ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К).

В ламинарном шкафу готовили 2 стерильные полипропиленовые пробирки объемом 50 мл и вносили в них по 9 мл 20%-ной суспензии гидроксиапатита. После этого добавляли по 9 мл 0,5%-ного раствора соединительнотканного коллагена и тщательно перемешивали на встряхивателе до получения однородной суспензии. В полученный композиционный препарат вносили 10% (по массе) желатиновых микросфер, содержащих рекомбинантный фактор роста костной ткани Collbd-BMP-2. Для этого в каждую полипропиленовую пробирку, содержащую композиционный препарат, вносили по 1,8 мг желатиновых микросфер и тщательно перемешивали на встряхивателе.

Композицию в исполнении ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ готовят аналогичным способом, исключая только то, что вместо раствора соединительнотканного коллагена добавляют ксеногенный костный коллаген в виде крошки.