фармацевтический препарат для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы

Формула изобретения

1. Применение, по меньшей мере, одной протеазы для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики гипертрофии/гиперплазии доброкачественной простаты, где лекарственное средство подходит для перорального введения, причем, по меньшей мере, одну протеазу выбирают из группы, состоящей из протеаз растений и микроорганизмов, и ее вводят в количестве от 1 до 100 мг/кг массы тела.

2. Применение по п.1, при котором протеазу растений выбирают из группы, состоящей из бромелина, папаина, фицина, ананина, балансаина, карикаина, фаустасаина, гиеронимаина, каратазина, макродонтаина, пингвинаина, кукумизина, актинидии.

3. Применение по п.1, при котором протеазу микроорганизмов выбирают из группы, состоящей из наттокиназы, бриназы, сипрозы, сфериказы, субтилизина и мутаназы.

4. Применение по п.1, при котором протеазу из не относящихся к млекопитающим животных выбирают из группы, состоящей из крилэнзима, батроксобина, люмброкиназы, алфимеразы и мутаназы.

5. Применение по п.1, при котором, по меньшей мере, одна протеаза содержится в лекарственном средстве в количестве от 5 до 100% вес/вес, предпочтительно от 20 до 80% вес/вес, более предпочтительно от 30 до 70% вес/вес.

6. Применение по п.1, при котором, по меньшей мере, одну протеазу вводят индивидууму в количестве от 2 до 50 мг/кг, предпочтительно от 5 до 20 мг/кг массы тела.

7. Применение по п.1, при котором лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент, предпочтительно связующий агент, наполнитель, разрыхлитель, смазывающий агент, консервант и/или оболочку.

8. Применение по п.1, при котором лекарственное средство обеспечивается в фармацевтической форме, которую выбирают из группы, состоящей из таблеток, гастрорезистентных таблеток и капсул, предпочтительно гастрорезистентных капсул.

9. Применение по п.1, при котором лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент.

10. Применение по п.9, при котором, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент представляет собой флавоноид и/или антиоксидант.

11. Применение по пп.9, 10, при котором дополнительный активный ингредиент содержится в лекарственном средстве в количестве от 5 до 35% вес/вес, предпочтительно от 10 до 30% вес/вес, более предпочтительно от 15 до 25% вес/вес.

12. Применение по п.1, при котором лекарственное средство содержит, по меньшей мере, одну протеазу, которую выбирают из группы, состоящей из бриназы, бромелина, фицина, люброкиназы, наттокиназы, папаина, проназы, сипрозы-S, серрапептазы, сфериказы, субтилизина, крилэнзима и батроксобина, мутаназы, алфимеразы, фибролазы, кукумизина, актинидии, ананина, балансаина, карикаина, фастузаина, гиеронимаина, каратазина, пинагвинаина и макродонтаина.

13. Фармацевтический препарат для перорального введения, содержащий, по меньшей мере, две протеазы по любому из пп.1-12 для лечения доброкачественной гипертрофии/гиперплазии простаты.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения доброкачественной гиперплазии простаты.

Уровень техники

Ангиогенез представляет собой процесс, посредством которого изменяется предшествующая васкуляризация с образованием комплексной сети новых кровеносных сосудов для поддержания растущей ткани. Сначала происходит местное высвобождение ЕСМ-протеаз посредством ЕС-деградирования базальной мембраны кровеносных сосудов. Затем активированные эндотелиальные клетки (ЕС) пронизывают строму, пролиферируют и образуют структуры из трубочек, которые объединяются вместе. В итоге базальная мембрана синтезируется повторно и перициты мигрируют в участки вновь образованных капилляров. Ангиогенез участвует в разных физиологический процессах (эмбриогенез, заживление ран) и способствует прогрессированию некоторых патологических состояний (рак, гиперплазия). В норме эндотелиальные клетки у взрослых млекопитающих находятся в состоянии покоя и делятся только каждые несколько лет. При патологических состояниях, таких как доброкачественная гиперплазия простаты, мастопатия, ревматоидный артрит, атеросклероз, эндометриоз, псориаз, рак или окулярная реваскуляризация, локальный рост эндотелиальных клеток значительно увеличивается.

Ангиогенез регулируется большим числом про- и антиангиогенных факторов, включая фактор роста плаценты (P1GF), фактор роста фибробластов, ангиопоэтины и другие. Главным лимитирующим этапом в этом процессе, однако, является фактор роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF). Ранее описанный как фактор, вызывающий стойкое нарушение проницаемости сосудов и называемый фактором сосудистой проницаемости (Vascular Permeability Factor, VPF), этот фактор роста позднее стали назвать фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) в расчете на его митогенный эффект в эндотелиальных клетках.

В ряде моделей in vitro и in vivo было обнаружено, что VEGF повышает рост эндотелиальных клеток сосудов и образует кровяные сосуды. VEGF также служит жизнеобеспечивающим фактором для эндотелиальных клеток. In vitro VEGF предотвращает апоптоз, вызванный кровопусканием. In vivo VEGF-ингибирование у новорожденных, но не у взрослых мышей приводит к большим апоптическим изменениям в сосудистой сети. Нокаутирование по VEGF-A у мышей (или нулевые [VEGF-A-/-]) или гетерозиготные [VEGF-A+/-] формы) приводит к гибели эмбриона между 11 и 12 неделями из-за развившихся аномалий, нарушенной васкуляризации в некоторых органах и значительным снижениям количества содержащих ядро эритроцитов в кровяных островках и желточного мешка, предполагая, что VEGF-A контролирует как васкулогенез, так и гематопоэз. В итоге VEGF повышает проницаемость сосудов и эндотелиальную фенестрацию в эндотелиальных клетках надпочечников.

Экспрессия VEGF может вызываться гипоксией посредством активации гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF-I). Недостаток кислорода, вызванный, например, избыточным ростом ткани, активирует экспрессию HIF-I. Затем комплексы HIF-I накапливаются в ядре клетки, соединяются с HIF-I-связывающим сайтом ДНК и инициируют соответственно нерегулируемую транскрипцию VEGF-мРНК, запуская ангиогенное переключение, что может вызвать прорастание соседних кровеносных сосудов в гипоксическую ткань. Разные провоспалительные цитокины также способны индуцировать экспрессию VEGF, чем объясняется роль ангиогенеза, в первую очередь, при воспалительных заболеваниях, таких как псориаз или ревматоидный артрит.

С признанием этой ключевой роли в регуляции ангиогенеза VEGF и его рецепторы выступают как привлекательная терапевтическая мишень. Некоторые стратегии, затрагивающие VEGF-опосредованный ангиогенез, применялись, главным образом, при лечении рака, но также и при других заболеваниях, характеризующихся повышенным ангиогенезом (например, макулярная дегенерация или доброкачественная гиперплазия простаты). Исследуемые лекарственные средства включали антибиотики, токсиновые конъюгаты, интерферирующие пептиды, растворимые рецепторы и ингибиторы тирозинкиназы. Взятые в совокупности, эти результаты полагают, что лекарственные средства, нацеленные на VEGF, улучшают будущую терапию заболеваний, таких как рак, ревматоидный артрит, псориаз, окулярная неоваскуляризация и др.

Доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП) относится к заболеваниям, связанным с увеличением размера простаты у мужчин среднего и пожилого возраста. Когда простата достигнет достаточно большого размера, она сдавливает мочеиспускательный канал и вызывает частичную, иногда даже полную обструкцию уретры, что затрудняет нормальный ток мочи. В некоторых случаях железа может увеличиваться до десятикратного размера от нормы. Принято считать, что ДГП не является предраковым поражением, но может стать существенной проблемой для здоровья для пожилого мужчины, главным образом, благодаря негативному влиянию на качество жизни, такому как затрудненное начало мочеиспускания, частое мочеиспускание, повышенный риск инфицирования мочеиспускательного тракта и задержка мочеиспускания.

ДГП является относительно медленно прогрессирующим состоянием, требующим десятилетия для развития симптомов, связанных с заболеванием. Однако к 60 годам до 50% мужчин имеет патологическую ДГП. Verhamme et al., Eur Urol. 2002 Oct; 42 (4):323-8 сообщает, что коэффициент заболеваемости ДГП у 3/1000 мужчин в год в возрасте от 45 до 49 лет достигает максимума 38 на 1000 мужчин в год в возрастной группе 75-79 лет. У мужчин старше 80 лет коэффициент заболеваемости остается постоянным.

В настоящее время существует три схемы лечения ДГП.

1. "Ожидание под наблюдением" заключается в том, что оно рекомендуется, если симптомы бывают умеренными и не влияют на качество жизни мужчины. Индивидуумы могут выбрать эту схему лечения, если они чувствуют, что лекарственная терапия будет более неудобной, чем при симптомах ДГП. При этом если проявляются симптомы и возникает дискомфорт, изменяется активность повседневной жизни, рекомендуется лекарственная терапия.

2. Лекарственные средства используются при общих симптомах, касающихся мочевыводящих путей, связанных с ДГП, для снижения размера предстательной железы или для замедления роста простаты (Madersbacher et al. Internist (Berl.). 2007 Apr 11). Обычно лекарства, используемые для лечения симптомов, включают альфа-блокаторы, такие как доксазозин (Cardura) [побочные эффекты: головокружение, сонливость, небольшая головная боль, мигрень, запор, потеря аппетита, сухость во рту, усталость, заложенность носа, нечеткость зрения, сухость глаз или беспокойный сон], тамсулозин (Flomax) [побочные эффекты: снижение кровяного давления, приводящее к in обмороку или потере сознания; головокружение, мигрень, заложенность носа и учащенное сердцебиение], ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид (Proscar) [побочные эффекты: пониженное количество спермы на эукуляцию, снижение сексуального влечения, импотенция] или дутастерид (Avodart) [побочные эффекты: огрубление молочных желез, снижение сексуального влечения, проблемы с эукуляцией, увеличение молочных желез у мужчин, крапивница, импотенция, зуд, сыпь].

3. В случае тяжелых симптомов ДГП, таких как рецидивирующая задержка мочи, появление крови в моче, рецидивирующие инфекции в мочеиспускательном тракте или камни в мочевом пузыре, способом выбора является хирургическое удаление простаты (простатэктомия). Побочные эффекты простатэктомии включают дополнительный риск присоединения инфекций, перфорацию мочевого пузыря, тромбоз глубоких вен и полное недержание.

WO 90/08555 касается применения гидролитических ферментов, подобных протеазам, таких как трипсин, химотрипсин или бромелин, применяемых для лечения гипертрофии простаты. Препарат вводят инъекционно непосредственно внутрь простаты.

В WO 2006/127431 описан способ лечения индивидуума, страдающего от гипертрофии простаты. В случае данного лечения вводят ферменты млекопитающих типа трипсина.

ZA 200002342 раскрывает применение растительных стеринов и их гликозидов при профилактике доброкачественной гипертрофии простаты. Для повышения скорости абсорбции растительных стеринов к указанным фармацевтическим композициям добавляют протеазы типа бромелина.

US 2006/0024385 раскрывает композиции, которые применяют для снижения оксидативного стресса. Эти композиции могут содержать экстракты растений, которые могут включать среди прочих веществ также и бромелин.

US 2003/0194400 описывает композиции, содержащие тромбоген, селективный к сосудистой ткани, который может связываться тканью, вызванной гиперплазией простаты.

В WO 94/019005 описана фармацевтическая композиция, содержащая одну или более протеаз. В этом документе протеазами являются трипсин, химотрипсин, бромелин, папаин и фицин.

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении лекарственными средствами, которые пригодны для лечения или профилактики доброкачественной гиперплазии простаты и которые ликвидируют недостатки обычно применяемых лекарственных форм и средств.

Настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного протеолитического фермента протеазы для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики доброкачественной гипертрофии/гиперплазии простаты, когда лекарственное средство предназначено для энтерального введения, причем, по меньшей мере, одну протеазу выбирают из группы, состоящей из протеаз растений, не относящихся к млекопитающим животных, микроорганизмов, и, по меньшей мере, одну протеазу вводят в количестве от 1 до 100 мг/кг массы тела.

Неожиданно было обнаружено, что определенное лекарственное средство, содержащее комбинацию, по меньшей мере, из одной протеазы, которая выбрана из группы, состоящей из протеаз растений, не относящихся к млекопитающим, и микроорганизмов, обеспечивает при введении индивидууму значительное снижение уровня фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (по меньшей мере, на 40%, предпочтительно, на 50%, более предпочтительно, на 60% или на 70%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, и в особенности, на 90% по сравнению с уровнем VEGF указанного индивидуума до введения лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением) и, следовательно, подавление ангиогенеза. Подавление ангиогенеза является особенно важным для профилактики и лечения доброкачественной гиперплазии/гипертрофии простаты у индивидуума.

Этот эффект является даже более неожиданным, поскольку лекарственное средство, содержащее, по меньшей мере, одну протеазу, вводят энтерально (предпочтительно орально или ректально): доза в 1-100 мг протеазы/кг массы тела (равная 3-300 Ед/кг массы тела) является низкой. Уровень техники, в частности WO 90/08555, предлагает вводить протеазы непосредственно в простату для разрушения гиперпластической ткани. Однако неожиданно оказалось эффективным неинвазивное энтеральное системное введение протеаз индивидууму в количестве, раскрываемом в настоящем изобретении, хотя, разумеется, применяли дозировку намного ниже дозировки, применяемой для разрушения ткани человека (WO 90/08555). Комбинация из более чем одной протеазы, особенно, по меньшей мере, из двух (предпочтительно, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, четырех, по меньшей мере, пяти, по меньшей мере, шести), протеаз повышает в несколько раз терапевтический эффект профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии простаты у индивидуума.

Неожиданно было обнаружено, что комбинация, по меньшей мере, из двух протеаз обеспечивает более эффективное лечение доброкачественной гипертрофии/гиперплазии простаты, чем применение единичной протеазы.

Предстательная железа является андрогензависимой в том отношении, что для ее нормального роста, развития, дифференцировки и функционирования требуется тестостерон, а снижение содержания андрогенов приведет к уменьшению размера простаты. Антиандрогенная терапия, направленная на снижение разрастания ткани простаты, обладает лишь ограниченным действием, поскольку она основывается на том, что стероиды могут влиять, а не вызывать рост предстательной железы. Данные показывают, что рост предстательной железы может находиться под непосредственным контролем конкретных факторов роста, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-beta), и может только опосредованно регулироваться андрогенами.

Для ДГП характерна гиперплазия стромальных и эпителиальных клеток простаты и повышенная плотность микрососудов в ткани простаты (Stefanou et al. In Vivo. 2004 Mar-Apr; 18 (2): 155-60). Андрогены стимулируют начало гипертрофии клеток в простате. Гипертрофия постепенно может привести к местной гипоксии, которая стимулирует экспрессию индуцируемых гипоксией факторов (HIF-1 и HIF-2). HIF стимулирует синтез VEGF в эпителиальных клетках простаты (Walsh et al. Prostatic Dis. 2002; 5 (2): 119-22). Увеличенная экспрессия VEGF может стимулировать ангиогенез, что в результате может привести к клиническому прогрессированию ДГП и образованию крупных изолированных узелков в периуретральной области простаты. Прерывание этого континуума должно уменьшить гиперплазию.

Следовательно, нацеливание VEGF непосредственно представляет собой лечение, регулирующее патологическое разрастание ткани простаты и возможно также уменьшение интенсивности симптомов, связанных с доброкачественной гиперплазией простаты. Концентрация VEGF в сыворотке крови у пациентов с ДГП повышена по сравнению с контрольной группой здоровых людей, но значительно ниже, чем у пациентов с раком простаты (Trapeznikova et al. Vestn Ross Akad Med Nauk. 2005; (5):14-6).

Ангиогенез повышен при ДГП, более выражен при злокачественной опухоли простаты и коррелирует с концентрацией VEGF (Stefanou et at. In Vivo. 2004 Mar-Apr; 18 (2): 155-60). Анти-VEGF терапия снижает ангиогенез в простате кастрированных крыс, которых лечили тестостероном (Lissbrant et al. Prostate. 2004 Jan 1; 58 (1): 57-65).

В соответствии с настоящим изобретением термины "доброкачественная гипертрофия простаты" и "доброкачественная гиперплазия простаты" обозначают одно заболевание и поэтому используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо.

Введение протеаз, полученных из бактерий, грибов, растений и не относящихся к млекопитающим животных, является особенно пригодным, поскольку указанные протеазы не проявляют значимую токсичность при взаимодействии с клетками человека или животного, в особенности с эндотелиальными клетками. Даже комбинация из протеаз, как здесь описывается, не токсична для животного или человека, но при этом влияет на ангиогенез.

Следует отметить, что протеазы, полученные из млекопитающих (т.е. людей), не способны эффективно ингибировать или предотвращать ангиогенез. Следовательно, отдельное введение таких протеаз индивидууму не может применяться для профилактики или лечении заболеваний, относящихся к неоангиогенезу.

Термин "лекарственное средство", как здесь определено, включает не только фармацевтические продукты, но также пищевые добавки.

В используемом здесь значении "протеазы растений" и "протеазы животных" относятся к протеазам, которые встречаются в природе у растений или животных (не относящихся к млекопитающим животных) и которые выделены или получены из них. "Протеазы растений" и "протеазы животных" также являются рекомбинантными протеазами, чья кодирующая ДНК (например, кДНК) происходит или получена из растения или животного (содержащего в природе указанную ДНК в своем геноме), соответственно, и клонирована в соответствующие векторы и экспрессирующаяся в клеточной культуре прокариот (например, бактериальной) или эукариот (например, клетке насекомого, клетке млекопитающего).

"Протеазы микроорганизмов", в используемом здесь значении, представляют собой протеазы, которые встречаются в природе у микроорганизмов, таких как бактерии и грибы (например, дрожжи, плесень). Указанные протеазы могут, однако, быть выделены также из других клеток и микроорганизмов при условии, что указанные клетки и организмы содержат ДНК микробной протеазы и способны продуцировать указанную рекомбинантную протеазу.

Также предпочтительным является применение лекарственного средства настоящего изобретения для профилактики и/или лечения индивидуумов, страдающих от заболеваний, обусловленных высокими уровнями VEGF и связанных с ангиогенезом, в результате чего эти заболевания становятся в основном или совершенно не связанными с повышенной пролиферативной активностью. По меньшей мере, одну протеазу растений предпочтительно выбирают из группы, состоящей из бромелина, папаина или фицина. Протеазы растений, предпочтительно использующиеся в соответствии с настоящим изобретением, перечислены выше.

Эти протеазы могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии в хозяине или путем извлечения из растения, продуцирующего указанные протеазы естественным путем, тем самым экстракт сам по себе может непосредственно быть использован для изготовления лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением. Способы экстрагирования протеаз хорошо известны из уровня техники.

Бромелин: Ананасы с давних времен используются в качестве медицинского растения среди местных растений Южной и Центральной Америки. Бромелин был впервые введен в Европе в качестве вспомогательного лекарственного средства в 1957 и в основном использовался в составе средств для лечения отека и воспалении (обзор, составленный Maurer. Cell Mol Life Sci 58 (9):1234-1245, 2001).

Папаин: может быть получен как неочищенный сухой материал путем сбора млечного сока от плода дынного дерева (папайя). Млечный сок собирают после надреза шейки фрукта, после чего он может быть высушен на фрукте или собран в контейнер. Затем этот млечный сок может быть высушен. С этого момента он является сухим необработанным материалом. Стадия очистки является необходимой для исключения загрязняющих веществ. Очистка состоит из солюбилизации и экстракции фермента папаина.

Фицин: Млечный сок некоторых видов фикуса (Могасеае) традиционно применяют в качестве антигельминтного средства в Центральной и Южной Америке. Признано, что антигельминтная активность обусловлена наличием протеолитической фракции, называемой фицин.

Протеазы растений: бромелин, папаин, фицин, ананин, балансаин, карикаин, фаустусаин, гиеронимаин, капаиазин, макродонтаин, пингвинаин, кукумизин, актинидин.

Протеазы бактерий/микроорганизмов: В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения протеазу, выделенную из бактерий или грибов, выбирают из группы, состоящей из бриназы (от Aspergillus oryzae), наттокиназы {Bacillus subtilis Natto), проназы (Streptomyces griseus), сипроза-S (Aspergillus melleus), серрапептазы (Bacillus Serratia E 15), сфериказы (Bacillus sphaericus), субтилизина (Bacillus subtilis) и mut-мутаназы (Aspergillus sp.).

Протеазы микроорганизмов могут быть получены с использованием рекомбинантных технологий или могут быть извлечены непосредственно из микробных культур, содержащих микроорганизмы, которые продуцируют указанные протеазы. Наттокиназу, например, получают из натто, традиционного японского продукта питания, производимого из сброженных соевых бобов, или культур, содержащих организмы специфических подтипов Bacillus subtilis (Bacillus subtilis var. Natto), которые способны продуцировать указанную протеазу.

Серрапептаза, также известная как серрапептидаза или серретиопептидаза, полученная из микроорганизмов серратия Е 15, которые живут в стенке кишечника шелковичного червя, помогают пищеварению и растворяют кристаллы. Этот фермент может использоваться в качестве дополнительного компонента при лечении боли и воспаления и применяется в клинической практике в некоторых странах Азии и Европы. Серрапептазу применяют в качестве альтернативы нестероидным противовоспалительным лекарственным средствам (НПВС), которые обычно используют для лечения артрита и воспаления.

Протеазу животных (немлекопитающих) предпочтительно выделяют из антарктического криля (ракообразные) Euphasia superba, крилэнзим, батроксобин и лимброкиназу - из дождевого червя, алфимераза, фибролаза.

Дополнительно предпочтительными протеазами являются мутаназа, алфимераза, фибролаза, кукумизин, актинидин, ананин, балансаин, карикаин, фастузаин, гиеронимаин, каратазин, пингвинаин и макродонтаин. Эти протеазы могут продуцироваться рекомбинантно с помощью способов, известных из уровня техники, или могут быть получены непосредственно из соответствующих животных.

Особенно предпочтительные лекарственные средства содержат бромелин и/или папаин в качестве протеаз растений и, при необходимости, наттокиназу в качестве протеазы микроорганизмов. Предпочтительное соотношение между этими протеазами в лекарственном средстве в соответствии с настоящим изобретением можно найти в следующей таблице.

Бромелаин	Папаин	Наттокиназа
100,00%	0,00%	0,00%
75,00%	25,00%	0,00%
16,67%	16,67%	66,67%
25,00%	25,00%	50,00%
0,00%	75,00%	25,00%
75,00%	0,00%	25,00%
25,00%	0,00%	75,00%
16,67%	66,67%	16,67%
50,00%	0,00%	50,00%
0,00%	100,00%	0,00%
0,00%	50,00%	50,00%
0,00%	25,00%	75,00%
33,33%	33,33%	33,33%
25,00%	75,00%	0,00%
0,00%	0,00%	100,00%
50,0%	25,00%	25,00%
25,00%	50,00%	25,00%
50,00%	50,00%	0,00%

Кроме того, предпочтительными комбинациями протеаз, использующихся в лекарственном средстве, в соответствии с настоящим изобретением являются:

бромелин и папаин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и фицин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, папаином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и наттокиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, папаином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и бриназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, папаином, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и сипроза (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, папаином, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, папаином и/или батроксобином), бромелин и крилэнзим (при необходимости вместе с бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, папаином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бромелин и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или папаином), бромелин и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, фицином, папаином, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином);

папаин и фицин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), папаин и наттокиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), папаин и бриназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, фицином, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), папаин и сипроза (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, фицином, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), папаин и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, фицином, субтилизином и/или батроксобином), папаин и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, фицином и/или батроксобином), папаин и крилэнзим (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), папаин и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, люмброкиназой, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или фицином), папаин и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, фицином, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином);

фицин и наттокиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), фицин и бриназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), фицин и сипроза (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, наттокиназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), фицин и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, наттокиназой, субтилизином и/или батроксобином), фицин и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, наттокиназой и/или батроксобином), фицин и крилэнзим (при необходимости вместе с наттокиназой, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), фицин и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, люмброкиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или наттокиназой), фицин и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, наттокиназой, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином);

наттокиназа и бриназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), наттокиназа и сипроза (при необходимости вместе с крилэнзимом, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), наттокиназа и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, бриназой, субтилизином и/или батроксобином), наттокиназа и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, бриназой и/или батроксобином), наттокиназа и крилэнзим (при необходимости вместе с бриназой, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), наттокиназа и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, люмброкиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или бриназой), наттокиназа и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, бриназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой-S, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином),

бриназа и сипроза (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, люмброкиназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бриназа и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, люмброкиназой, серрапептазой, сипрозой, субтилизином и/или батроксобином), бриназа и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, люмброкиназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или батроксобином), бриназа и крилэнзим (при необходимости вместе с сипрозой, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, люмброкиназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином), бриназа и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, люмброкиназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или сипрозой), бриназа и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, сипрозой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином);

сипроза и сфериказа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, люмброкиназой, субтилизином и/или батроксобином), сипроза и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, люмброкиназой, сфериказой и/или батроксобином), сипроза и крилэнзим (при необходимости вместе с сфериказой, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, люмброкиназой, субтилизином и/или батроксобином), сипроза и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, люмброкиназой, субтилизином и/или сфериказой), сипроза и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином и/или батроксобином);

сфериказа и субтилизин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сипрозой, люмброкиназой и/или батроксобином), сфериказа и крилэнзим (при необходимости вместе с субтилизином, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой, люмброкиназой и/или батроксобином), сфериказа и батроксобин (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, субтилизином, люмброкиназой и/или сипрозой), сфериказа и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, субтилизином, сипрозой и/или батроксобином);

субтилизин и крилэнзим (при необходимости вместе с люмброкиназой, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или батроксобином), субтилизин и батроксобин (при необходимости вместе с люмброкиназой, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или крилэнзимом), субтилизин и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или батроксобином);

крилэнзим и батроксобин (при необходимости вместе с субстилином, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или люмброкиназой), крилэнзим и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или батроксобином),

батроксобин и люмброкиназа (при необходимости вместе с крилэнзимом, наттокиназой, бромелином, папаином, фицином, проназой, бриназой, серрапептазой, сфериказой, сипрозой и/или крилэнзимом).

Эти комбинации протеаз можно дополнительно комбинировать, по меньшей мере, с одной протеазой, которую выбирают из группы, состоящей из мутаназы, алфимеразы, фибролазы, кукумизина, актинидина, ананина, балансаина, карикаина, фастузаина, гиеронимаина, каратазина, пингвинаина и макродонтаина.

Особенно предпочтительные лекарственные средства настоящего изобретения содержат бромелин в комбинации с папаином, фицином, наттокиназой, бриназой, сипрозой, сфериказой, субтилизином, крилэнзимом, батроксобином, люмброкиназой.

В лекарственном средстве настоящего изобретения каждая из, по меньшей мере, двух протеаз присутствует в количестве, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 15%, относительно общего содержания протеаз, содержащихся в указанном лекарственном средстве.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения, по меньшей мере, две протеазы содержатся в лекарственном средстве в количестве от 5 до 10, предпочтительно от 10 до 90% вес./вес., предпочтительно от 20 до 80% вес./вес., более предпочтительно от 30 до 70% вес./вес.

По меньшей мере, одну протеазу предпочтительно вводят индивидууму в количестве 2-50 мг/кг, предпочтительно 5-20 мг/кг массы тела. Как указано выше, количество вводимых протеаз варьирует от 3 до 300 Ед/кг массы тела, предпочтительно от 6 до 150 Ед/кг массы тела, более предпочтительно от 15 до 60 Ед/кг массы тела. Также протеазы могут вводится в количестве от 3 до 150 Ед/кг массы тела или от 3 до 60 Ед/кг массы тела. Лекарственное средство может предпочтительно дополнительно содержать, по меньшей мере, один фармацевтически подходящий носитель, растворители и/или эксципиенты, предпочтительно связывающий агент, наполнитель, разрыхлитель, смазывающий агент, консервант и/или оболочку.

В зависимости от фармацевтического состава лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением могут применяться другие вещества, подобные эксципиентам, оболочкам и др.

Лекарственное средство настоящего изобретения предпочтительно подходит для орального введения.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения лекарственное средство представлено в фармацевтической форме, которую выбирают из группы, состоящей из капель, спрея, таблеток, предпочтительно растворимых таблеток, шипучих таблеток, гастрорезистентных таблеток и сублингвальных таблеток, капсул, предпочтительно гастрорезистентных капсул, порошков, гранул, жидкостей для перорального применения, капель для перорального применения и суппозиториев.

Лекарственное средство подходит для перорального введения. Такой путь введения является неинвазивным и, следовательно, предусматривает повторное введение (без причинения вреда пациенту) лекарственного средства, что проверено приблизительно за 50 лет (Ransberger. Erfahrungsheilkunde 1:14-17, 1971).

Лекарственное средство настоящего изобретения может быть специально составлено для введения в твердой или жидкой форме, включая и те, которые подходят для перорального введения, например кисели (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык.

Лекарственное средство настоящего изобретения может также обеспечиваться для других путей введения:

(1) парентерального введения, например, путем подкожного, внутримышечного или внутривенного инъецирования, как, например, стерильного раствора или суспензии;

(2) местного нанесения, например, как крема, мази или спрея для нанесения на кожу; или

(3) внутриректального, например, как пессария, крема или пены.

Фраза "фармацевтически подходящий" в используемом здесь значении относится к таким соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые с медицинской точки зрения пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных без повышенной токсичности, возбудимости, аллергического ответа или других проблем или осложнений, причем их применение соизмеримо с целесообразным соотношением польза/риск.

Примеры материалов, которые могут применяться в качестве фармацевтически подходящих носителей, включают:

(1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза;

(2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал;

(3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетилцеллюлоза;

(4) порошкообразный трагант;

(5) солод;

(6) желатин;

(7) тальк;

(8) эксципиенты, такие как какао-масло и свечной воск;

(9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло;

(10) гликоли, такие как пропиленгликоль;

(11) полиолы, такие как глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль;

(12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат;

(13) агар;

(14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия;

(15) альгиновую кислоту;

(16) апирогенную воду;

(17) изотонический раствор;

(18) раствор Рингера;

(19) этиловый спирт;

(20) фосфатно-буферные растворы; и

(21) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.

Увлажняющие агенты, эмульгаторы и смазывающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, агенты для смазывания, покровные агенты, подсластители, отдушки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты также могут входить в состав лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением.

Примеры фармацевтически подходящих антиоксидантов включают:

(1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и им подобные;

(2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный оксианизол, бутилированный гидроксианизол, лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и им подобные; и

(3) металлхелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и им подобные.

Составы настоящего изобретения включают те, которые пригодны для перорального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), ректального и/или парентерального введения. Составы могут присутствовать в дозированной лекарственной форме и могут быть приготовлены любыми способами, хорошо известными из уровня техники специалисту в области фармации. Количество активного ингредиента, который можно комбинировать с носителем для получения дозированной формы для однократного применения, будет варьировать в зависимости от субъекта, который подвергается лечению, и определенного пути введения.

Количество активного ингредиента, который можно комбинировать с носителем для получения дозированной формы для однократного применения, будет составлять такое количество соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.

Способы приготовления лекарственных средств и составов в соответствии с настоящим изобретением включают стадию объединения соединения настоящего изобретения с носителем и, при необходимости, одним или более дополнительными ингредиентами. Обычно составы приготавливают путем одновременного и равномерного объединения соединения настоящего изобретения с жидкими носителями, или измельченными твердыми носителями, или с обоими с последующим, при необходимости, формированием продукта. Составы изобретения, пригодные для перорального введения, могут быть в форме капсул, облаток, пилюль, таблеток, пастилок (используя ароматизирующее основание, обычно сахарозу и акацию или трагакант), порошков, гранул или как раствор или суспензия в водной или неводной жидкости, или как жидкая эмульсия «масло-в-воде» или «вода-в-масле», или как сироп, или как пастилки (используя инертное основание, такое как желатин и глицерин, или сахароза и акация), причем каждая лекарственная форма содержит предварительно определенное количество протеазной комбинации настоящего изобретения в качестве активных ингредиентов.

Протеазы настоящего изобретения могут также вводиться как болюс, лекарственная кашка или паста. В твердых лекарственных формах изобретения для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и им подобных) активный ингредиент смешивают с одним или более фармацевтически подходящими носителями, такими как цитрат натрия или дикальция фосфат, и/или с любыми из следующих:

(1) наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и/или кремниевая кислота;

(2) связующими агентами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или акация;

(3) увлажнителями, такими как глицерин;

(4) агентами для улучшения распадаемости таблеток, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия;

(5) агентами, замедляющими схватывание, для растворов, такими как парафин;

(6) ускорителями впитывания, такими как четвертичные аммониевые соединения;

(7) увлажнителями, такими как, например, цетиловый спирт и глицерина моностеарат;

(8) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина;

(9) смазывающими агентами, такими как тальк, кальция стеарат, магния стеарат, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и

(10) красителями.

В случае капсул, таблеток и пилюль, фармацевтические композиции могут также сдержать буферные агенты. Твердые композиции одинакового типа также можно применять в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, используя такие эксципиенты, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и им подобные.

Таблетку можно приготовить путем прессования или формования, при необходимости вместе с одним или более дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки можно приготовить с использованием связующего агента (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающего агента, инертных растворителей, консерванта, агента для разделения (например, натрия гликолят крахмала или сетчатой карбоксиметилцеллюлозы натрия), поверхностно-активного или диспергирующего агента. Формованные таблетки можно приготовить путем формования в подходящем аппарате, где смесь порошкообразного соединения смачивают с инертными жидкими разбавителями. Таблетки и другие твердые лекарственные формы фармацевтических композиций настоящего изобретения, такие как драже, капсулы, пилюли и гранулы, можно при необходимости получить или приготовить вместе с покрытиями или оболочками, такими как энтеросолюбильные и другие покрытия, хорошо известные из уровня техники в области фармации. Они также могут быть составлены с тем, чтобы обеспечивать замедленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента, причем в их состав вводят, например, гидроксипропилметилцеллюлозу в разных соотношениях для обеспечения желаемого профиля высвобождения, другие полимерные матрицы, липосомы и/или микросферы. Их можно стерилизовать, например, путем фильтрации через задерживающий бактерии фильтр или путем введения в состав стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять в стерильной воде или в какой-либо другой инъецируемой среде непосредственно пред применением. Эти композиции могут также при необходимости содержать опалесцирующий компонент и могут быть такими композициями, которые высвобождают активный ингредиент(ы) только, или предпочтительно, определенной порцией в желудочно-кишечном тракте или при необходимости замедленным образом.

Примеры заливочных композиций, которые могут использоваться, включают полимерные вещества и воски. Протеазы могут также быть микроинкапсулированной формы при необходимости вместе с одним или более вышеуказанными эксципиентами. Жидкие лекарственные формы для перорального введения соединений изобретения включают фармацевтически подходящие эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно использующиеся в области техники, такие, например, как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты, и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, пшеничных зародышей, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана, и их смеси. Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать адъювант, такой как увлажняющие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты.

Суспензии, в дополнении к активным соединениям, могут содержать суспендирующие агенты, такие, например, как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбитол и эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, и их смеси.

Составы фармацевтических композиций изобретения для ректального введения могут иметь форму суппозитория, который можно приготовить путем смешивания протеаз изобретения с одним или более пригодными не вызывающими раздражение эксципиентами или носителями, содержащими, например, какао-масло, полиэтиленгликоль, воск для суппозиториев или салицилат, и который сохраняет твердую форму при комнатной температуре, но становится жидким при температуре тела и, следовательно, будет расплавляться в полости прямой кишки и высвобождать активное соединение. Составы настоящего изобретения, которые пригодны для ректального введения, также включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пенки или спреи, при этом составы, содержащие такие носители, известны из уровня техники.

Лекарственные формы для местного или трансдермального применения соединения данного изобретения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Протеазы можно смешивать в стерильных условиях вместе с фармацевтически подходящим носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут требоваться.

Мази, пасты, кремы и гели могут содержать в дополнение к активному соединению данного изобретения эксципиенты, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафин, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка, или их смеси.

Порошки и спреи могут содержать, в дополнение к протеазам данного изобретения, эксципиенты, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидные порошки, или смеси из этих веществ. Спреи могут дополнительно содержать обычные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные гидрокарбоны, такие как бутан и пропан.

Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество, поскольку обеспечивают контролируемую доставку протеаз настоящего изобретения в организм. Такие лекарственные формы можно приготовить путем растворения или диспергирования протеаз в подходящей среде. Усилители абсорбции также могут применяться для повышения проникновения протеаз через кожу. Скорость такого проникновения может контролироваться либо путем обеспечения контролирующей скорость мембраны, либо посредством диспергирования соединения в полимерном матриксе или геле.

Фармацевтические композиции данного изобретения, пригодные для парентерального введения, содержат протеазы изобретения в комбинации с одним или более фармацевтически подходящими стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые можно растворять в стерильных пригодных растворах или дисперсиях непосредственно перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики, растворы, которые представляют составу быть изотоничным с кровью предполагаемого реципиента или суспендирующими агентами или загустителями. Примеры пригодных водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях изобретения, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и им подобные), и пригодные их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Нужная текучесть может быть достигнута, например, путем использования покрывающих материалов, таких как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения сурфактантов. Эти композиции могут также содержать адъювант, такой как консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов на заявленные композиции можно обеспечить путем включения в их состав различных антибактериальных и антигрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, и им подобных. Также желательным является включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия, и им подобных в состав композиций. В дополнение пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть обусловлена включением агентов, которые задерживают абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин. В некоторых случаях для пролонгирования действия лекарственного средства желательным является замедлить абсорбцию лекарства из области подкожной или внутримышечной инъекции.

Это можно объяснить, используя жидкую суспензию кристаллина или аморфного материалы, имеющего плохую растворимость в воде. Альтернативно, замедленная абсорбция парентерально введенного лекарства выполняется путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном носителе. Инъецируемые депо-формы изготавливают путем формирования микроинкапсулированных матриц нужных соединений в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарства к полимеру и природы используемого конкретного полимера скорость высвобождения лекарственного средства можно контролировать. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды).

Инъецируемые депо-составы также приготавливают путем включения лекарства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканью человека. Если протеазы настоящего изобретения вводят как лекарственные препараты людям или животным, они могут приниматься per se или как фармацевтическая композиция, содержащая, например, 0,1-99,5% (более предпочтительно 0,5-90%) протеаз в комбинации с фармацевтически подходящим носителем. Препараты настоящего изобретения могут приниматься перорально, парентерально. Их, конечно, принимают в виде лекарственных форм, подходящих для каждого пути введения.

Например, их вводят в таблетированной или капсулированой форме, путем инъецирования, ингалирования, в качестве глазной примочки, мази, суппозитория и др., вводят путем инъекции, инфузии или ингаляции; местно с помощью лосьона или мази; и ректально посредством суппозиториев. Пероральное и местное введения являются предпочтительными. Фразы "парентеральное введение" и "вводят парентерально" в используемом здесь значении означают пути введения, отличные от энтерального и местного введений, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракупсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, внутрикожную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

Лекарственное средство настоящего изобретения можно вводить людям и животным для лечения любыми подходящими способами введения, включая орально, назально, с помощью, например, спрея, ректально, парентерально, интрацистернально или местно, с помощью, например, порошков, мазей или капель, включая буккально и сублигвально.

Независимо от выбранного пути введения протеазы настоящего изобретения, которые могут применяться в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции настоящего изобретения составлены в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм традиционными методами, известными для специалиста в данной области.

Конкретные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут варьировать для обеспечения количества активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа у конкретного пациента, композиции и пути введения при отсутствии токсичности для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от разных факторов, включая активность применяемой определенной протеазы настоящего изобретения, путь введения, время введения, скорость выведения применяемого конкретного соединения, длительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, использующихся в комбинации с применяемыми протеазами, возраста, веса, состояния, общего здоровья и анамнеза пациента, которого подвергают лечению, и подобных факторов, хорошо известных из уровня техники в области медицины. Терапевт или ветеринар, имеющий средний уровень компетенции, может без труда определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, терапевт или ветеринар может начать назначение дозировок протеаз изобретения, применяемых в фармацевтической композиции, с уровня ниже требуемого для достижения желаемого терапевтического эффекта и постепенно повышать дозировку до достижения желаемого эффекта.

Хотя вводить протеазы настоящего изобретения возможно и отдельно, предпочтительным является введение протеаз в фармацевтическом составе (композиции).

В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, один дополнительный активный ингредиент.

Указанный активный ингредиент может быть любым, но при этом способствовать профилактике и лечению ангиогенных заболеваний совместно с протеазами в соответствии с настоящим изобретением. Однако также возможно добавление активных ингредиентов, проявляющих другое действие, чем указанные протеазы.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения лекарственное средство содержит, по меньшей мере, одну, предпочтительно, по меньшей мере, две (три или даже четыре) протеазы, которые выбирают из группы, состоящей из:

протеаз растений: бромелин, папаин, фицин, ананин, балансаин, карикаин, фаустасаин, гиеронимаин, каратазин, макродонтаин, пингвинаин, кукумизин, актинидин;

протеаз бактерий: наттокиназа, проназа, серрапептаза, сфериказа и субтилизин;

протеаз грибов: бриназа, сипроза-S, мутаназа;

протеаз ракообразных: крилэнзим;

протеаз дождевых червей: люмброкиназа;

протеаз змей: алфимераза, фибролаза.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими чертежами и примерами.

Фигура 1 показывает активность LDH в супернатанте обработанных ферментом HUVEC.

Фигура 2 показывает анализ на основе МТТ с обработанными ферментом HUVEC.

Фигура 3 (А) показывает ингибирование образования трубочек, индуцированное VEGF, посредством комбинации из 25% бромелина, 50% наттокиназы и 25% папаина.

Фигура 3(В) показывает контролируемую обработку только VEGF. Тогда как в VEGF-контроле узкая линия сформированных трубочек видима, обработанный ферментами образец показывает широкую область не образованных трубочек, указывая на антиангиогенную активность смеси ферментов.

Фигура 4 показывает концентрации VEGF в крови пациентов, подвергавшихся лечению рутозимом.

Фигура 5 показывает МТТ-анализ с VEGF-стимулированными HUVEC и рутозидом. Ингибирование пролиферации не наблюдается.

Фигура 6 показывает токсические эффекты Рутозида на HUVEC. Токсические эффекты не выявлены в неактивных HUVEC, тогда как VEGF-активированные HUVEC показали небольшой эффект.

Фигура 7 (слева) показывает ингибирование спонтанного образования трубочек в HUVEC. Бромелин, фицин, наттокиназа, папаин и серрапептаза, но не химотрипсин или трипсин, ингибируют образование трубочек.

Фигура 7 (справа) показывает ингибирование образования трубочек, вызванное VEGF, в HUVEC. Бромелин, фицин, наттокиназа, папаин и серрапептаза, но не химотрипсин или трипсин, ингибируют образование трубочек почти так же, как и у необработанных HUVEC.

ПРИМЕРЫ

ДГП

Материалы:

Бромелин из стебля ананаса с активностью 3,51 Ед/мг был получен от Sigma Aldrich, Austria. Наттокиназа с активностью 10,000 Ед/мл была приобретена у Japan Bio Science Laboratory Co, Ltd. Папаин из папайи Carica с активностью >3 Ед/мг был получен от Sigma Aldrich, Austria

Методы:

Тест на токсичность

Антипролиферативную активность бромелина, наттокиназы и папаина оценивали с помощью анализа на активность лактатдегидрогеназы (LDH). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) из полуконфлюэнтных культур обрабатывали трипсином, высеивали с плотностью 2500 клеток/лунку в 96-луночных микропланшетах, предварительно покрытых человеческим фибронектином. Для обеспечения надлежащего прикрепления клетки инкубировали в течение 24 часов в эндотелиальной базальной среде 2MV (Cambrex Biochemicals), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, 60 мкг/мл фактора роста клеток эндотелия, hrEGF, hrFGF2, hrIGF, hrVEGF, аскорбиновую кислоту и гепарин. После прикрепления клетки инкубировали при 37°С и влажности 95% в среде 199+10% Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) без факторов роста. Через 24 часа супернатант заменяли средой 199, содержащей 10% FCS, VEGF и разные концентрации ферментов. После 48-часового инкубационного периода супернатант собирали и выполняли анализ на активность LDH в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Germany): 50 мкл аликвот из всех лунок перемещали в чистую 96-луночную плоскодонную (для ферментативного анализа) планшету. Аналитический буфер добавляли к субстратной смеси и аккуратно перемешивали. 50 мкл восстановленной субстратной смеси добавляли к каждой лунке. Планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл стоп-раствора. Не позднее одного часа измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм с опорной длиной волны 620 нм. Результаты выражали как % от необработанного контроля.

Результаты представлены на фигуре 1. Они четко демонстрируют, что бромелин, наттокиназа и папаин вплоть до уровня включительно 25 мкг/мл не оказывают токсического действия на HUVEC после 2 дней инкубации.

Антипролиферативная активность

Антипролиферативная активность бромелина, наттокиназы и папаина и их смесей оценивали, используя анализ на основе 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) из полуконфлюэнтных культур обрабатывали трипсином, высеивали с плотностью 2500 клеток/лунку в 96-луночных микропланшетах, предварительно покрытых человеческим фибронектином. Для обеспечения надлежащего прикрепления клетки инкубировали в течение 24 часов в эндотелиальной базальной среде 2MV (Cambrex Biochemicals), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, 60 мкг/мл фактора роста клеток эндотелия, hrEGF, hrFGF2, hrIGF, hrVEGF, аскорбиновую кислоту и гепарин. После прикрепления клетки инкубировали при 37°С и влажности 95% в среде 199+10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) без факторов роста. Через 24 часа супернатант заменяли средой 199, содержащей 10% FCS, VEGF и разные концентрации бромелина, наттокиназы или папаина. Клетки инкубировали дополнительно в течение 48 часов при температуре 37°С и влажности 95%. МТТ-анализ выполняли с использованием МТТ-набора EZ4U (Biomedica, Austria; в соответствии с инструкциями производителя). Оптическую плотность измеряли при при длине волны 490 нм с опорной длиной волны 620 нм. Результаты выражали как % необработанного контроля или % пролиферации при 100% существующей пролиферации VEGF-обработанного контроля.

Результаты экспериментов зависимости высвобождения от концентрации представлены на фигуре 2. Они демонстрируют ясный антипролиферативный эффект бромелина, наттокиназы и папаина с бромелином и папаина, достигающий 75% увеличения при концентрациях уже 25 мкг/мл. Взятые вместе с тестом на определение активности LDH, эти данные показывают четкий антипролиферативный эффект, но не цитотоксическую активность бромелина, наттокиназы или папаина на HUVEC.

Антиангиогенная активность

Антиангиогенную активность на HUVEC оценивали, используя анализ образования трубочек. Матригель (Becton Dickinson, Vienna), подавляющий фактор роста, размораживали при температуре 4°С. В лунки 96-луночной микропланшеты пипетировали 50 мкл на лунку. Планшету оставляли при температуре 4°С в течение 24 часов. Перед экспериментом планшету инкубировали в течение 30-60 минут при температуре 37°С для отверждения геля. HUVEC инкубировали в течение 24 часов со средой 199, содержащей 2% FCS. Клетки собирали путем обработки трипсином и высеивали в покрытые матригелем 96-луночные микропланшеты с плотностью 10000 клеток на лунку. Лекарственные средства добавляли до желаемых концентраций и клетки инкубировали в присутствии или отсутствие 5 нг VEGF/мл. Через следующие 6 часов лунки фотографировали. Определяли общий размер трубочек, используя программное обеспечение ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, USA).

Результаты:

Пример 1: Ингибирование роста HUVEC с помощью ферментов

Результаты смесей показаны в таблице 1. Виден четкий антипролиферативный эффект.

Таблица 1
Ингибирование роста HUVEC с помощью комбинаций бромелина, наттокиназы и папаина в присутствии VEGF
Бромелин	Наттокиназа	Папаин	% пролиферации
0,00%	0,00%	100,00%	75,45%
75,00%	0,00%	25,00%	89,09%
16,67%	16,67%	66,67%	91,82%
25,00%	75,00%	0,00%	94,55%
66,67%	16,67%	16,67%	96,82%

Пример 2: Образование трубочек HUVEC, инкубированных с ферментами бромелин, наттокиназа и папаин

Результаты анализов формирования трубочек смесей представлены на фигуре 3, а также в таблице 2.

Таблица 2
Ингибирование образования трубочек в % в HUVEC в присутствии VEGF. Результаты показаны как % ингибирования образования трубочек за 0% принято образование трубочек в образцах, обработанных только VEGF
Бромелин	Наттокиназа	Папаин	% ингибирования образования трубочек
75,00%	25,00%	0,00%	98,11%
16,67%	16,67%	66,67%	93,52%
25,00%	25,00%	50,00%	87,75%
0,00%	75,00%	25,00%	87,42%
75,00%	0,00%	25,00%	86,34%
25,00%	0,00%	75,00%	83,77%
16,67%	66,67%	16,67%	83,65%
50,00%	0,00%	50,00%	82,73%
0,00%	50,00%	50,00%	80,01%
0,00%	25,00%	75,00%	78,26%
33,33%	33,33%	33,33%	74,14%
25,00%	75,00%	0,00%	61,57%
50,00%	25,00%	25,00%	47,78%
0,00%	0,00%	100,00%	39,86%

Таблица 2 показывает длины трубочек, выраженные как % ингибирования образования трубочек.

Результаты ясно показывают следующее.

1. Образование трубочек ингибировано смесью из бромелина, наттокиназы и папаина.

2. Комбинация из бромелина, наттокиназы и папаина имеет более выраженный эффект, чем лекарственные средства по отдельности.

Фигура 3 (А) показывает комбинацию 25% бромелина, 50% наттокиназы и 25% папаина. (В) показывает контроль, обработанный VEGF. Тогда как в VEGF-контроле видна узкая площадь сформировавшихся трубочек (стрелки), образец, обработанный ферментами, демонстрирует широкую область без образованных трубочек, показывая антиангиогенную активность смеси ферментов.

Пример 3:

Влияние препаратов, содержащих бромелин в комбинации с другими ферментами, на эндотелиальные клетки простаты человека (HProsEC) анализировали аналогично примеру 2 с небольшими модификациями. Клетки выдерживали в течение 24 часов в эндотелиальной базальной среде-2 (MV) (Lonza, Verviers), дополненной аскорбиновой кислотой и гидрокортизоном. Клетки высеивали с плотностью 10000 на лунку в покрытые матригелем 96-луночные микропланшеты и инкубировали в присутствии или отсутствие 5 нг VEGF/мл с комбинациями ферментов (либо 100% бромелина, либо 50% фермента и 50% бромелина на 12,5 мкг/мл всего). Через 6 часов трубочки фотографировали и измеряли, используя программное обеспечение ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, USA). Были получены следующие результаты:

фермент + бромелин % ингибирования образования трубочек

генный фермент

% ингибирования образования трубочек

Фермент + бромелин

Бриназа 21,00% 81,00%

Проназа 94,25% 99,00%

Субтилизин 27,00% 100,00%

Streptokinase 29,00% 80,00%

Протеаза Тип X 96,70% 100,00%

Протеаза Тип XIII 60,60% 98,00%

Бромелин 68,00%

Таблица 4: Эти результаты четко показывают, что протеазная комбинация, содержащая бромелин и дополнительную протеазу, приводит к увеличению ингибирования образования трубочек.

Пример 4: Образование трубочек в HUVEC в присутствии протеаз от животных

Протеазы животных

Для исследования, ингибируется ли образование трубочек из-за отделения клеток, HUVEC обрабатывали химотрипсином и трипсином, оба протеолитических фермента широко используются в клеточном отделении. Результаты показаны в таблице 3. Ни химотрипсин, ни трипсин не показали значимого эффекта.

Концентрация [мкг/мл]

Химотрипсин Трипсин

0 100,00% 100,00%

2,5 112,40% 112,82%

5 95,94% 112,23%

10 81,16% 95,22%

20 131,18% 127,87%

Таблица 3: % образования трубочек в HUVEC после обработки VEGF и трипсином или химотрипсином

Значительное снижение пролиферации детектировали в эндотелиальных клетках пупочной вены человека после обработки бромелином, наттокиназой и папаином по отдельности или в комбинации в диапазоне концентраций от 25 до 100 мкг/мл.

Продемонстрирована относительно низкая токсичность бромелина, наттокиназы и папаина, особенно при указанных уровнях с обеспечением антипролиферативного эффекта. Концентрации до 50 мкг/мл не вызывали токсичного действия HUVEC через 2 дня инкубации при 37°С.

Пример 5: Влияние смеси ферментов на концентрацию VEGF в крови человека

В этом примере исследовали эффект ферментативной терапии (смесь из наттокиназы, бромелина, папаина) на содержание VEGF в крови. Показано (см. результаты ниже), что ферментативная терапия значительно снижает концентрацию VEGF в крови человека.

Испытание проводили как рандомизированное, без контроля плацебо, многоцентровое пилотное исследование на 111 пациентах, больных сахарным диабетом 2 типа, обоих полов в двух параллельных сравниваемых группах. 54 пациента принимали рутозим (наттокиназа (20000 FU/г) 25 мг бромелина (2450 GDU/г) 90 мг папаина N. F. (2.400 USP Ед/мг). 100 мг, Marlyn Nutraceuticals, USA) в течение 4 недель. VEGF-концентрации в плазме пациента определяли перед добавкой и сразу через 4 недели после добавки.

Пациенты обслуживали сами себя в качестве самоконтроля относительно их начальных значений.

VEGF-концентрации в крови разделяли на 4 разные группы (квартили; см. фигуру 4): VEGF-концентрация в крови пациентов перед терапией <50 нг/мл; (и50 = исходная <50 нд/мл; к50 = конечная); и 100: VEGF-концентрация <100 нг/мл перед терапией; и200: <200 нг/мл перед терапией и и300:>200 нг VEGF перед терапией.

Можно увидеть, что применение лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, содержащего протеазы растений и/или микроорганизмов, может использоваться для снижения уровня VEGF в крови и, следовательно, может использоваться для лечения заболеваний, относящихся к неоангиогенезу.

Заключение

Протеолитические ферменты растительного, бактериального и грибкового происхождения могут использоваться для лечения доброкачественной гипертрофии предстательной железы у млекопитающих со снижением прогрессирования и регрессией гипертрофической ткани простаты и, следовательно, обеспечивают средства от обструктивных симптомов, связанных с заболеванием.

Пероральная ферментативная терапия снижает повышенную VEGF-концентрацию у диабетических пациентов, но не влияет на нормальный уровень VEGF.

Протеолитические ферменты снижают образование трубочек в HUVEC, вызванное VEGF.

Ферментативная терапия ингибирует ангиогенные факторы роста, приводя к понижению васкуляризации, и на этом основано ее действие по уменьшению доброкачественной гипертрофии/гиперплазии простаты.